High-throughput Citometria de Fluxo Ensaio Celular para detectar anticorpos em N-metil-D-aspartato ou dopamina-2 Receptor em Soro Humano

Resumo

Ao longo dos últimos anos, os ensaios baseados em células vivas têm sido utilizados com sucesso para detectar anticorpos contra antigénios de superfície e de conformação. Aqui, descrevemos um método que utiliza o fluxo de alto rendimento citometria permitindo a análise de grandes grupos de pacientes. Detecção de novos anticorpos irá melhorar o diagnóstico e tratamento de distúrbios mediados pela imunes.

Resumo

Ao longo dos últimos anos, os anticorpos contra a superfície de conformação e proteínas envolvidas na neurotransmissão foram detectados em doenças auto-imunes do sistema nervoso central em crianças e adultos. Estes anticorpos têm sido usados ​​para ajudar no diagnóstico e tratamento. Os ensaios baseados em células têm melhorado a detecção de anticorpos no soro do paciente. Eles baseiam-se na expressão de antigénios de superfície do cérebro em células eucarióticas, que são, em seguida, incubadas com soro de paciente diluído seguido de anticorpos secundários conjugados com fluorocromo. Após a lavagem, o anticorpo secundário de ligação é então analisada por citometria de fluxo. O nosso grupo desenvolveu um fluxo de alto rendimento citometria de ensaio baseado em células vivas para detectar com fiabilidade os anticorpos contra receptores de neurotransmissores específicos. Este método de citometria de fluxo é para a frente, quantitativa, eficiente, e a utilização de um sistema de amostragem de alto rendimento permite grandes grupos de pacientes para ser facilmente testada num curto espaço de tempo. Além disso, esta célula baseada em quantodizer pode ser facilmente adaptado para a detecção de anticorpos para vários alvos antigénicos diferentes, tanto do sistema nervoso central e na periferia. Descobrindo biomarcadores romance anticorpos adicionais permitirá o diagnóstico rápido e preciso e melhorar o tratamento de doenças imunomediadas.

Introdução

Nos últimos anos, as formas auto-imunes do sistema nervoso central, doenças (CNS) tem sido identificado. Tem sido demonstrado que estas doenças estão associadas e definida pela presença de auto-anticorpos. Estes anticorpos ligam-se a receptores neuronais ou proteínas sinápticas envolvidas na neurotransmissão ^1,2. Antigénios diferentes foram detectados, tal como o receptor de N-metil-D-aspartato (NMDAR) ^3-5, receptor γ-aminobutírico, o B (GABA _B) do receptor ^6, α-amino-3-hidroxi-5-metil-4- ácido isoxazolopropiónico (AMPA) receptor ^7, canal de potássio voltagem-dependentes (CPVD) proteínas associadas: leucina-rico uma proteína ativada por glioma (LGL-1) e associada à contactina proteína 2 (capsr2) receptor ^8,9, glutamato ^5,10 , e a dopamina-2 receptor (D2R) ^11. No passado, estas desordens auto-imunes do sistema nervoso central (principalmente chamados encefalite) eram frequentemente não diagnosticada e não tratada. Estes biomarcadores de anticorpos novela, por exemplo,Anticorpo NMDAR ou anticorpo D2R, melhoraram substancialmente o diagnóstico e consciência, e abriram as opções de tratamento para os pacientes. Na verdade, o tratamento precoce com immunotherapies se associa à melhora resultado ^11,12.

Os métodos tradicionais para a detecção de anticorpos, tais como o ensaio imunoabsorvente ligado a enzima (ELISA) e Western blot foram utilizados para a detecção de anticorpos no soro. No entanto, eles não são facilmente permitir o reconhecimento de epitopos extracelulares ou de superfície e, em vez disso, pode revelar imunorreactividade contra o epitopo intracelular. Além disso, os anticorpos que se ligam ao domínio extracelular de proteínas importantes envolvidas na neurotransmissão são susceptíveis de ser ^2,3,7,13,14 patogénico. Portanto, o desenvolvimento de ensaios precisos e sensíveis para descobrir superfície celular relevante ou alvos de anticorpos extracelulares em pacientes é fundamental. O método padrão de ouro no domínio baseia-se na utilização de células vivas, em chamada "célula-baensaios sed ". Este método envolve a expressão de um antigénio na superfície de células de mamíferos (mais frequentemente nos rins (293) células embrionárias humanas HEK293) na sua forma nativa por transfecção de vectores contendo a sequência de cDNA completa do antigénio de interesse. Nonpermeabilized células vivas são então incubadas com o soro diluído do paciente e seguido por fluorocromo-conjugados com anti-imunoglobulina humana (Ig), o anticorpo secundário. A intensidade ou o nível de fluorescência é detectada e é associado ao nível de ligação de auto-anticorpos. Esta técnica é específica, uma vez que apenas um antígeno é sobre-expresso em células. O mais usado "read-out" tem sido a análise de microscopia confocal após imunocitoquímica ^4,5,8-10. No entanto, a citometria de fluxo ensaios baseados em células têm sido usados ​​com sucesso para detectar anticorpos em pacientes com doenças desmielinizantes ^15-17. Em particular, ¹⁵ Waters et al. Comparado a detecção do anticorpo usando uma panelael das técnicas de detecção de anticorpos, incluindo ensaios com células seguidas por microscopia ou citometria de fluxo analisa e mostrou citometria de fluxo ensaio baseado em célula a ser o método mais sensível, preciso e confiável. Portanto, citometria de fluxo ensaio baseado em células é vantajoso, pois é quantitativa, não dependente de investigador, e não envolve qualquer uso de material radioativo. Também é conveniente, uma vez que permite que grandes grupos de pacientes a serem ensaiadas em um curto espaço de tempo.

Mais recentemente, temos um fluxo otimizado de alto rendimento citometria de ensaio baseado em células para detectar anticorpos NMDAR e D2R anticorpo em pacientes com doenças auto-imunes do SNC ^11. O nosso grupo detectados recentemente nos soros de anticorpos NMDAR paciente utilizando citometria de fluxo de ensaio de base celular. Estes soros de anticorpos positivos NMDAR foram previamente analisados ​​por meio de microscopia confocal e também foram encontrados para ser positivo ^11. Este protocolo descreve uma citometria de fluxo de ensaio à base de células para a detecção de canticorpo CNS onformation sensível no soro do paciente, utilizando um amostrador automático de alto rendimento.

Protocolo

1. Subclonagem Estratégia Construir pIRES2-EGFP Vector Codificação D2R ou NMDAR

1. Obter full-length cDNA clone de D2R humano ou NMDAR subunidade 1 (NR1).
2. Escolher um vector de expressão, tal como pIRES2-EGFP, o que é adequado para a expressão de proteínas de transmembrana com uma proteína verde fluorescente melhorada (GFP) repórter sob o controlo de um local de entrada de ribossoma interno (IRES), permitindo que ambos os antigénios e GFP para ser co-expressas em células separadamente.
3. Subclone cDNA humano dentro pIRES2-EGFP vetor.
   1. Para subclonar cDNA, utilizar enzimas de restrição adequadas (por exemplo NheI e XhoI para humano D2R cDNA).
   2. CDNA corte ligadura inserir dentro restrito vetor pIRES2-EGFP.
   3. Seqüência ligado pIRES2-EGFP D2R ou NMDAR vetor para verificar se o vetor contém a seqüência correta.
   4. Purificar e amplificar pIRES2-EGFP D2R ou NMDAR vetor para uso posterior na transfecção.

itle "> 2. HEK293 transfecção celular para Expressão da Neuronal Antígeno

1. Células de cultura HEK293 em tecidos frascos de cultura com Meio Eagle Modificado fresco por Dulbecco (1x) (DMEM) completo com 4,5 g / L de D-glucose, L-glutamina e 110 mg / piruvato de sódio L suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS), GlutaMAX 2 mM, e 50 ug / ml de gentamicina.
2. Retire células HEK293 usando tripsina e transferir para um tubo cônico.
   1. Lave as células por centrifugação a 250 xg durante 6 minutos e ressuspender o sedimento de células em meio DMEM completo fresco.
3. Contar as células e as sementes em placas de 6 poços a cerca de 8 x 10 ⁵ células / poço e cultura durante a noite em DMEM 2 ml a 37 ° C e 5% de CO ₂ num incubador.
4. Uma vez que eles tenham atingido cerca de 70% de confluência, transfecção as células HEK293 com pIRES2-EGFP NR1 (células HEK293 ^{NMDAR +),} pIRES2-EGFP D2R (células HEK293 ^{D2R +)} e (células HEK293 ^CTL, controle vetorial) pIRES2-EGFP como segue.Mantenha algumas células HEK293 untransfected de indemnização mais tarde.
   1. Prepare o volume requerido da mistura de transfecção compreende de 2,5 ug de ADN, 200 ul de cloreto de sódio a 0,9% e 4 ug / ml de polietilenimina / poço (contendo cada um 2 ml de DMEM completo fresco).
   2. Vortex imediatamente a mistura para 10 seg e incubar à temperatura ambiente (RT) durante 10 minutos, antes da adição do volume da mistura de transfecção para os poços apropriados.
   3. Cubra o prato, embrulhe os lados com Parafilm e centrifugar a 280 xg por 5 min para ajudar transfecção celular.
   4. Remover o Parafilm e depois colocar na incubadora a cultura a 37 ° C.
   5. Substitua os meios de cultura de 18 horas depois, com DMEM completo fresco e manter em cultura por outra 72 horas.
   6. Opcional: 72 horas pós-transfecção, as células transfectadas podem ser seleccionadas por cultura em meio DMEM completo suplementado com 250 ug / ml de geneticina, de modo a obter um policlonal transfectante estável.

3. Citometria de Fluxo Ensaio Celular para Detecção de Anticorpos para Antígenos de Superfície Neuronal

1. Separar HEK293 ^{NMDAR +,} HEK293 ^{D2R +,} e células HEK293 ^CTL por incubação com 500 ul / poço Versene durante aproximadamente 5 min a 37 ° C.
   1. Ressuspender em 2ml/well de PBS (-Ca ^{2 +} /-Mg ^{2 +)} suplementado com 2% de FBS (PBS / FBS) e transferência para a 15 ml ou 50 ml de tubo cónica.
   2. Lavar as células por centrifugação a 250 xg durante 6 minutos e ressuspender o sedimento de células em 15-50 ml de PBS / FBS. Repita lavagem 2x.
   3. Contar as células e em seguida ressuspender em PBS / FBS a 1 x 10 ⁶ células / ml.
2. Conceber o molde de 96 cavidades para a aquisição de citometria de fluxo, uma vez que as células HEK293 ^{D2R +} ou HEK293 ^{NMDAR +,} bem como células HEK293 ^CTL terá de ser incubada com cada amostra de doente ou anticorpo primário.
3. Células de sementes em uma placa de 96 poços de fundo em V a 50.000 células / nósll acordo com a citometria de fluxo modelo de aquisição.
4. Agregar as células por centrifugação a placa de 96 poços a 450 g durante 5 min e suavemente remover o sobrenadante utilizando uma pipeta multi-canal electrónico ou manual, inclinando a placa sobre um ângulo e tendo cuidado para não aspirar o sedimento celular.
5. Incubar HEK293 ^{D2R +,} HEK293 ^{NMDAR +,} e células HEK293 ^CTL durante 1 h à TA no escuro, com:
   1. Diluições em série de anticorpo primário, a fim de avaliar a expressão do antigénio de superfície.
   2. As amostras dos pacientes, a fim de detectar anticorpos.
6. Use fluxo apropriado citometria controles de compensação, por exemplo. células HEK293 não transf ectadas não coradas, GFP ⁺ células HEK293 (AF647 ^-), e AF647 ⁺ células HEK293 não transf ectadas (GFP).
7. Lavar as células por centrifugação a 450 xg durante 5 min e ressuspender o sedimento de células em 170 ul de PBS / FBS. Repita o passo de lavagem mais duas vezes.
8. Incubar as células durante 1 hr à TA no escuro, com uma diluição de 1:100 de anticorpo secundário conjugado com AF647 (IgG anti-humano para o soro do paciente e anti-IgG de ratinho a anticorpos primários anti-NR1 ou anti-D2R).
9. Lave as células três vezes, tal como no passo 3.7, e voltar a suspender em 35 ul de PBS / FBS por citometria de fluxo de células de aquisição.
10. Configure o amostrador de alto rendimento (HTS) no citômetro de fluxo (BDLSRII).
11. Adquirir 10.000 eventos / poço de acordo com o modelo de aquisição de citometria de fluxo.
12. Export e, em seguida, analisar os dados para a análise usando uma citometria de fluxo de pacotes de software, como FlowJo v7.5:
    1. Primeiro, porta as células HEK293 vivos, com base para a frente (tamanho) e lateral (granularidade), espalha.
    2. Além disso portão células HEK293 ao vivo com base na alta GFP-positividade para analisar apenas as células transfectadas.
    3. Determinar a intensidade média de fluorescência (MFI) do canal AF647 nas células GFP positivas vivas.
    4. Exportar dados para o Excel ou prisma de análise:
       1. Lote concentrations de anticorpo primário (anti-NMDAR ou anticorpo anti-D2R) versus o MFI obtido a partir das células incubadas com estes anticorpos.
       2. Para cada amostra de doente e de controlo, determinar o ΔMFI subtraindo o MFI das células HEK293 ^CTL do MFI do células HEK293 ^{NMDAR +} HEK293 ^{D2R +} ou, respectivamente.
       3. Calcular o limiar de positividade por adição de três desvios padrão acima da média ΔMFI do grupo de controlo.
       4. Amostras individuais de plotagem agrupados de acordo com seu tipo de soro em um gráfico e representam o limite como uma linha.

Resultados

Células vivas HEK293 ^{D2R +} e HEK293 ^CTL foram adquiridas no citômetro de fluxo utilizando um amostrador de alto rendimento. Durante a análise, as células foram fechado com base na dispersão para a frente (tamanho) e (granularidade) parâmetros (Figuras 1A e 1D) dispersão lateral. Células HEK293 transfectadas expressa a molécula repórter, a GFP, no citoplasma, e as células não transfectadas foram excluídos da análise (Figuras 1B e

Discussão

Este artigo descreve uma nova aplicação da citometria de fluxo ensaio baseado em células vivas para detectar anticorpos que visam as proteínas neuronais específicos na superfície celular utilizando um amostrador de alto rendimento. Usando esta técnica, informamos que um subgrupo de pacientes afetados com doenças auto-imunes do sistema nervoso central têm anticorpos séricos para a superfície ou à superfície NMDAR D2R.

Passos essenciais para a detecção de anticorpo óptima utili...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
pIRES2-EGFP vector	Clontech	6029-1
Human HA-Dopamine-2 receptor (D2R) cDNA	Missouri S&T cDNA Resource Centre	DRD020TN00
Human subunit 1 of NMDAR (NR1) cDNA			Gift from Prof A. Vincent  (Oxford, UK)
Monoclonal purified mouse anti-human NR1 antibody (clone: 54.1)	BD Pharmingen	556308
Mouse purified monoclonal anti-DRD2 IgG (clone: 1B11)	Sigma-Aldrich	WH0001813M1-50UG
Alexa Fluor 647 donkey anti-mouse IgG (H + L)	Invitrogen	A31571
Alexa Fluor 647 goat anti-human IgG (H + L)	Invitrogen	A21445
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (1x) 4.5 g/L D-glucose, L-Glutamine and 110 mg/L sodium pyruvate	Invitrogen	11995-065
Foetal bovine serum	Invitrogen	10099-141
Gentamicin	Invitrogen	15710-072
GlutaMAX	Invitrogen	35050-061
Penicillin-streptomycin	Invitrogen	15140-122
Geneticin	Invitrogen	10131-035
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (1x) (-Ca2+/-Mg2+)	Invitrogen	14190-144
TrypLE Express (1x) with Phenol Red	Invitrogen	12605-028
0.9% Sodium chloride	Baxter	AHF7975
Polyethylenimine	Polysciences Inc	9002-98-6
Versene	Invitrogen	15040-066
XhoI	Roche	10899194001
NheI	Roche	10885843001
PureLink PCR Purification Kit	Invitrogen	K3100-01
JetQuick Gel Extraction Spin Kit	Genomed	420050
T4 DNA Ligase	Roche	10481220001
Plasmid Plus Maxi Kit	Qiagen	12963
Name of Equipment/Software	Company	Catalog Number	Model/Version
Flow cytometer with high-throughput sampler system	BD Biosciences		BDLSRII with HTS
Inverted microscope	Olympus		CKX41 (with mercury lamp and U-RFLT50 power supply)
Electronic multichannel pipette (15-300 μl)	Eppendorf	613-2240P	12-channel Xplorer Plus
Excel	Microsoft		2010
Prism	GraphPad Software, Inc.		v4
FlowJo	Treestar		v7.5
50 ml polypropylene conical tubes	BD Biosciences	352070
6-well plate	BD Biosciences	353046
Tissue culture flask (T75)	BD Biosciences	353136
Parafilm	Pechiney Plastic Packaging	PM-992
V-bottom 96-well plate	Corning	651180