Síntesis de una proteína artificial mediada Intein hidrogel

Resumen

Se presenta la síntesis de un hidrogel de proteína dividida intein mediada. Los bloques de construcción de este hidrogel son dos copolímeros de proteína conteniendo cada uno una subunidad de una proteína trimérica que sirve como un agente de reticulación y una media de un intein dividida. La mezcla de los dos copolímeros de proteínas desencadena una reacción de trans-empalme inteína, produciendo una unidad de polipéptido que se auto-ensambla en un hidrogel. Este hidrogel es altamente pH y temperatura estable, compatible con disolventes orgánicos, y fácilmente incorpora proteínas globulares funcionales.

Resumen

Se presenta la síntesis de un hidrogel altamente estable de proteínas mediada por una reacción de trans-empalme proteína dividida inteína catalizada. Los bloques de construcción de este hidrogel son dos copolímeros de bloque de proteína conteniendo cada uno una subunidad de una proteína trimérica que sirve como un agente de reticulación y una media de un intein dividida. Una bobina al azar altamente hidrófilo se inserta en uno de los copolímeros de bloque para la retención de agua. La mezcla de los dos copolímeros de bloques de proteína desencadena una reacción de trans-empalme inteína, produciendo una unidad de polipéptido con agentes de reticulación en cada extremo que rápidamente se auto-ensambla en un hidrogel. Este hidrogel es muy estable bajo condiciones ácidas y básicas, a temperaturas de hasta 50 ° C, y en disolventes orgánicos. El hidrogel rápidamente las reformas después de la ruptura inducida por cizalla. La incorporación de una "estación de acoplamiento peptídico" en el bloque de construcción de hidrogel permite la incorporación conveniente de "proteína de acoplamiento"-etiquetados proteínas diana.El hidrogel es compatible con el medio de crecimiento de cultivo de tejidos, apoya la difusión de moléculas de 20 kDa, y permite la inmovilización de proteínas globulares bioactivos. La aplicación del hidrogel de proteína mediada por inteína-como un biocatalizador compatible con disolventes orgánicos se demostró mediante la encapsulación de la enzima peroxidasa de rábano picante y corroborar su actividad.

Introducción

Los hidrogeles hechos enteramente de las proteínas tienen el potencial para avanzar significativamente campos tan diversos como la ingeniería de tejidos, la administración de fármacos y biofabricación ^1. Ofrecen ventajas sobre hidrogeles poliméricos sintéticos tradicionales, incluyendo la biocompatibilidad y el potencial para apoyar de forma no invasiva la incorporación de proteínas globulares bioactivos.

En este trabajo se describe el desarrollo de una novela de hidrogel de proteína formada por una reacción de trans-empalme proteína dividida intein mediada y su aplicación como un andamio inmovilización de proteínas (Figura 1). Los bloques de construcción para este hidrogel son dos copolímeros de bloque de proteína que comprenden cada uno el fragmento N-o C-terminal de una fracción de intein (EN e IC) y una subunidad de una proteína multimérica reticulante. La inteína DnaE de Nostoc punctiforme (Npu) se utilizó como la división inteína ^2,3 y una pequeña proteína trimérica (12 kDa) CUTA de Pyrococcus horikoshii </ Em> se utilizó como ^4,5 proteína reticulante. Diferentes agentes de reticulación se unen a través de reacción de trans-empalme inteína catalizada, lo que lleva a la formación de una red de proteínas altamente reticulado (hidrogel). Inteína Npu fue elegido debido a su cinética de reacción rápida (t _1/2 = 63 seg) y alto rendimiento trans-empalme (cerca del 80%) ^2,3. La proteína CUTA fue elegido como el agente de reticulación debido a su alta estabilidad. Trímeros CUTA tienen una temperatura de desnaturalización de cerca de 150 ° C y conservan la estructura cuaternaria trimérica en soluciones que contienen tanto como 5 M hidrocloruro de guanidina ^4,6. Desde intercambio de subunidades entre diferentes agentes de reticulación es un contribuyente importante de la erosión de la superficie de hidrogel física ^7, la fuerte interacción entre la subunidad de Cuta debería desalentar este tipo de intercambios de subunidades, lo que lleva a un hidrogel más estable. Uno de estos bloques de construcción también contiene un péptido S-fragmento altamente hidrofílico como la mitad de la cuadra para facilitar aguaretención ^8.

La mezcla de los dos bloques de construcción de hidrogel inicia una reacción de trans-empalme entre el EN y IC inteína fragmentos, la generación de una cadena de polipéptido más largo con agentes de reticulación en ambos terminales. Los reticulantes de múltiples tales unidades moleculares interactúan entre sí, formando una red de hidrogel altamente reticulado (Figura 1A). Una "estación de acoplamiento de péptidos" específica (DSP) se incorpora en uno de los bloques de construcción de hidrogel para facilitar la inmovilización estable de una "proteína de acoplamiento" (DP)-etiquetados proteína diana en el hidrogel. El uso de una fracción de inteína para mediar el ensamblaje de hidrogel no sólo proporciona una flexibilidad adicional para la síntesis de hidrogel de proteína, sino que también permite alta densidad, una carga uniforme de la proteína diana a través de todo el hidrogel, como las proteínas diana se cargan antes de la formación de hidrogel.

La proteína de hidrogel intein mediada es altamente Stables en solución acuosa con poca o ninguna erosión detectable después de 3 meses a temperatura ambiente. Estabilidad es retenido en una amplia gama de pH (6-10) y temperaturas (4-50 ° C), y el hidrogel también es compatible con disolventes orgánicos. Este hidrogel se usa para la inmovilización de dos proteínas globulares: la proteína fluorescente verde (GFP) y la peroxidasa de rábano picante (HRP). Hidrogel atrapando la última proteína se utiliza para realizar la biocatálisis en un disolvente orgánico.

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Protocolo

1. Construcción de plásmidos

NOTA: Todos los genes fueron amplificados bajo reacciones de PCR utilizando Phusion de alta fidelidad de ADN polimerasa según las especificaciones del fabricante. Los cebadores usados ​​para la clonación se han descrito anteriormente ^9. Todos los constructos se enumeran en la Tabla 1.

1. Para generar Cuta-NpuN (N, Tabla 1):
   1. Amplificar por PCR los genes Cuta y NpuN de plásmidos pET30-cuta-Tip1 ¹⁰ y kanR-IntRBS-NpuNC-CFN ^11, respectivamente, utilizando los cebadores apropiados.
   2. Digerir estos fragmentos con las enzimas de restricción apropiadas y secuencialmente insertar estos fragmentos en el vector pET26b entre el promotor T7 y una etiqueta 6xHistidine C-terminal para generar N (Figura 2A).
2. Para generar NPUC-S-cuta (C, Tabla 1):
   1. PCR amplificar NPUC, Cuta y S fragmentaciónt [AG ₃ (PEG)] ₁₀ del plásmido kanR-IntRBS-NpuNC-CFN ^11, pET30-cuta-Tip1 ¹⁰ y pQE9 AC ₁₀ ATRP ^12, respectivamente, utilizando los cebadores apropiados.
   2. Digerir estos fragmentos con las enzimas de restricción apropiadas y secuencialmente insertar estos fragmentos en el vector pET26b entre el promotor T7 y un 6xHistidine C-terminal para generar C (Figura 2B).
3. Para generar NPUC-S-SH3 _{lig-cuta (lig} C-SH3, Tabla 1):
   1. Amplificar por PCR utilizando cebadores Cuta contienen un _lig SH3 (PPPALPPKRRR) y un conector flexible (GGGGS) ₂ para generar un fragmento SH3 _lig-cuta.
   2. Vuelva a colocar el gen Cuta de C con el fragmento SH3 _lig-cuta.
4. Para generar SH3-GFP (Tabla 1):
   1. Amplificar el gen SH3 del plásmido pJD757 ¹³ utilizando elcebadores apropiados.
   2. Fusible este fragmento con el gen GFP y la inserta en el vector pET26b entre el promotor T7 (Figura 2 C) y una etiqueta 6xHistidine C-terminal.

2. Expresión de Proteínas

1. Transformar 50 l de químicamente competente de Escherichia coli BL21 (DE3) con el plásmido de expresión apropiado.
2. Después de la transformación, en serie diluir estas células, y la placa de ellos en medio Luria-Bertani (LB) / placas de agar que contienen 50 mg / ml de kanamicina.
3. Incubar las placas que contienen células transformadas a 37 ° C durante ~ 15 horas.
4. Después de la incubación, recoger una placa que contiene 50 a 100 colonias y volver a suspender todas las colonias en 5 ml de caldo LB.
5. Suspensión de transferencia a 1 L de caldo LB que contenía kanamicina (50 mg / ml) y crecer las células a 37 ° C con agitación a 250 rpm. Supervisar la absorbancia a 600 nm (OD _600). Cultive hasta OD ₆₀₀ ~ 0,8.
   1. Para C y C-SH3 _LIG, inducir la expresión de la proteína mediante la adición de isopropil β-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG) al cultivo (1 mM de concentración final) y se incuba el cultivo a 37 ° C durante 4 horas mientras se agitaba a 250 rpm.
   2. Para N y SH3-GFP, enfriar la cultura a ~ 18 ° C por inmersión del matraz de cultivo en un baño de agua con hielo durante ~ 5 min. Inducir la expresión de proteínas mediante la adición de IPTG al cultivo (concentración final 1 mM) y se incuba el cultivo a 18 ° C durante 14-18 horas con agitación a 250 rpm.
6. Después de la expresión de proteínas, centrifugar el cultivo a 6000 xg durante 20 min a 4 ° C para recoger el sedimento. Sedimento celular Almacenar a -80 ° C hasta su uso.

3. Protein Purification

1. Purificación de N (condiciones de desnaturalización)
   1. Resuspender los sedimentos celulares en tampón A (Tabla 2) en 10 ml / g de sedimento húmedo.
   2. Immerse la suspensión de pellets en un baño de hielo-agua y romper las células por sonicación (Amp 10, con 1 pulso segundos y 6 segundos de pausa durante 1 min).
   3. Centrifugar el lisado a 16.000 xg durante 20 min a 4 ° C.
   4. Eliminar el sobrenadante. Resuspender el sedimento en Tampón de DA (que contiene 8 M de urea) y se centrifuga la suspensión a 16.000 xg durante 20 min a 4 ° C.
   5. Pasar el sobrenadante a través de un 5 ácido Ni-nitrilotriacético ml (NTA) columna previamente equilibrada con tampón DA.
   6. Lavar la columna con 30 ml de Tampón DA suplementado con imidazol 45 mM. Eluir la proteína purificada utilizando 20 ml de Tampón DA suplementado con imidazol 150 mM.
   7. Reducir la concentración de urea en la muestra de proteína a <1 mM ya sea por uno de los siguientes métodos dados en 3.1.7.1 o 3.1.7.2:
      1. Se dializa la proteína en tampón DPBS (Tabla 2) a 4 ° C durante la noche utilizando tubos con <20 kDa de corte.
      2. Centrífuga purificado proteínas en un 30 & #160; columna de centrifugación de ultra-filtración kDa a 2800 xg, 4 ° C hasta que el volumen es menos de 1 ml. Añadir tampón de 14 ml de DPBS a la columna para diluir la muestra de proteína. Repetir la centrifugación / dilución pasos tres veces más.
   8. Después de intercambio de tampón, añadir ditiotreitol (DTT) a la proteína purificada (final de 2 mM) y concentrado de proteína de ~ 100 mg / ml mediante centrifugación a través de una columna de centrifugación de ultra-filtración 30 kDa a 2800 xg, 4 ° C.
   9. Alícuota de la proteína concentrada y se almacenan a -80 ° C hasta su uso.
2. Purificación de C y C-SH3 _lig (condición nativa)
   1. Resuspender los sedimentos celulares en tampón B (pH 6,0) (Tabla 2) suplementado con 1x cóctel inhibidor de proteasa a 10 ml / g de sedimento húmedo. Utilizar una solución tampón ácida para minimizar la degradación proteolítica de la proteína diana.
   2. Disrupt suspensión celular por sonicación como se describe en 3.1.2. Centrifugar las Lyscomió a 16.000 xg durante 20 min a 4 ° C y mantener el sobrenadante.
   3. Pasar el lisado soluble a través de una columna de 5 ml de Ni-NTA equilibrada previamente con tampón B.
   4. Lavar la columna con Tampón B suplementado con imidazol 45 mM, y eluir la proteína diana en 20 ml de tampón B complementado con imidazol 150 mM.
   5. Para C, vaya al paso 3.2.6. Para C-SH3 _lig, llevar a cabo un paso adicional de purificación de intercambio iónico para eliminar la proteína parcialmente degradado como se indica en los pasos 3.2.5.1 a 3.2.5.3
      1. Reducir la concentración de NaCl en C-SH3 _LIG a <1 mM siguiendo el procedimiento descrito en 3.1.7.
      2. Carga de la proteína diana en una columna de matriz de 5 ml de aniones de cuentas intercambiador de agarosa previamente equilibrada con tampón de fosfato de sodio (50 mM, pH 7,0).
      3. Proteína diana eluyen de la columna mediante la ejecución de un gradiente de una solución que contenía Tris-HCl 10 pH 8,0 Buffer para una solución que contiene el mismo tampón suplementado con 1 M de NaCl. Tomar muestras durante la elución de proteínas y las muestras de la piscina con la más alta pureza basado en sodio dodecil sulfato de electroforesis en gel de poliacrilamida (SDS-PAGE).
   6. Intercambio de tampón de la proteína purificada en tampón DPBS, como se describe en 3.1.7.
   7. Añadir DTT a la proteína purificada (concentración final 2 mM) y concentrar la proteína a ~ 100 mg / ml utilizando una columna de centrifugación de ultra-filtración 30 kDa como se describe en 3.1.8. Alícuota y almacenar concentrados de proteínas a -80 ° C hasta su uso.
3. La purificación de SH3-GFP
   1. Resuspender los sedimentos celulares usando tampón A a 10 ml / g de sedimento húmedo.
   2. Interrumpir la suspensión de pellets por sonicación como se describe en 3.1.2.
   3. Centrifugar el lisado a 16.000 xg durante 20 min a 4 ° C y recoger el sobrenadante.
   4. Pasar el sobrenadante (lisado soluble) a través de una columna de 5 ml de Ni-NTA equilibrada previamente conTampón A.
   5. Lavar la columna con 30 ml de tampón A suplementado con imidazol 45 mM. Eluir la proteína purificada utilizando 20 ml de tampón A suplementado con imidazol 150 mM.
   6. Intercambio de tampón de la proteína purificada en tampón DPBS usando un enfoque similar al que se describe en 3.1.7 y concentrar la proteína a ~ 150 mg / ml usando una columna de centrifugación de ultra-filtración 30 kDa como se describe en 3.1.8.
   7. Alícuota y almacenar la proteína purificada a -80 ° C hasta su uso.
4. El análisis de SDS-PAGE de muestras purificadas que contienen CUTA
   1. Diluir cada proteína purificada en agua doblemente destilada para reducir la concentración de NaCl a ~ 1 mM. A esta concentración de NaCl, la mayor parte de las proteínas trímeros CUTA ejecutar como monómeros en los geles de SDS-PAGE.
   2. Mezclar muestras con 2x tampón de muestra SDS (0,5 M de Tris-HCl, pH 6,8, 20% de glicerol, 10% w / v de SDS, 0,1% w / v-bromo fenol azul, 2% β-mercaptoetanol), se incubaron a 95 ° C durante 5 min.
   3. Cargue el sammuestras en un gel de SDS-PAGE al 12%. Llevar a cabo la electroforesis a un voltaje constante de 200 V durante ~ 50 min.
   4. Observar la proteína en los geles mediante tinción con azul brillante de Coomassie R250 siguiendo los protocolos estándar (Figura 1C).

4. Formación de hidrogel

NOTA: los hidrogeles de muestras hechas en este estudio contienen 1,6 mM de cada bloque de construcción de hidrogel a menos que se indique lo contrario. Esta concentración de proteína se obtiene un hidrogel suave y estable. PRECAUCIÓN: La azida de sodio _(NaN3) se añade al hidrogel hasta una concentración final de 0,5% w / v para evitar la contaminación bacteriana. NaN ₃ es altamente tóxica y debe manejarse con sumo cuidado, como se indica en la Hoja de Datos de Seguridad.

1. Calcular el volumen de cada una de las proteínas concentradas necesarios para alcanzar una concentración final de 1,6 mM en un hidrogel 100 l de muestra. Por ejemplo:
   Concentración de N:100 mg / ml
   Peso molecular de N: 26,3 kDa (consulte la Tabla 1)
   Concentración 100 l deseado:: Volumen deseado 1,6 mM
   
2. Para hacer un hidrogel 100 l (1,6 mM), mezclar C (x l, volumen calculado de acuerdo a 4,1) con 5% de NaN ₃ (10 l), 100 mM de DTT (5 l) y N (Y l, volumen calculado según 4.1) dentro de un vial de vidrio de 2 ml.
3. Añadir tampón DPBS ((85 - x - y) l) al vial para alcanzar un volumen final de 100 l, y mezclar manualmente todos los componentes a través de un movimiento de torbellino usando una punta de pipeta. Nota: La solución se vuelve muy viscoso tras la mezcla.
4. Centrifugar la mezcla durante 2 min a 8000 xg para eliminar las burbujas de aire.
5. Incubar la mezcla a la habitacióntemperatura durante la noche para permitir que la reacción inteína trans-empalme para llegar a la terminación. Confirme la formación del hidrogel por sonda girando al revés. Las proteínas no fluirá si se forma un hidrogel.
6. Estimar el rendimiento inteína trans-empalme mediante la comprobación de muestras (0,5 mu l cada uno) recogidos antes del paso 4.2 y después de la etapa 4.5 en un gel de SDS-PAGE, como se describe en 3.4 (Figura 1C).

5. La inmovilización de las buenas prácticas agrarias a través de proteínas Docking (DP) y la estación de acoplamiento de péptidos (DSP) Interacción

1. Para hacer una 50 l de hidrogel de GFP-funcionalizado (1,2 mM), se combinan C-SH3 _LIG (x l, calculado de acuerdo con 4.1) y SH3-GFP (l Y, calculado de acuerdo con 4,1) en una relación molar 1:1 en un 1,7 tubo de microcentrífuga ml y se incuba la mezcla a temperatura ambiente durante 30 min.
2. Añadir 5% NaN ₃ (5 l), DTT 100 mM (2,5 l), (42,5 - x - y) mu l DPBS al mismo tubo. Añadir N (Y l, calculado de acuerdo a 4,1) para alcanzar una relación molar 1:1 de N y C-SH3 _LIG. Mezclar la muestra mediante el uso de una punta de pipeta por un movimiento giratorio.
3. Centrifugar la mezcla a 8000 xg durante 2 min y se incuba la mezcla a temperatura ambiente durante la noche en la oscuridad. Un hidrogel encapsular formas SH3-GFP durante la incubación.

6. El uso de 1,6 mM de hidrogel como un andamio para la inmovilización reacción enzimática en Disolvente orgánico

1. Utilice el HRP como enzima modelo. Preparar una solución madre de HRP (28 mg / ml o 0,63 mM) en DPBS.
2. Para hacer una 30 l de hidrogel (1,6 mM) atrapando HRP, combinan C (x l, calculado de acuerdo con 4.1) con HRP (2 l), 5% de NaN ₃ (3 l) y DTT (1,5 l de 100 mM) dentro de un tubo de centrífuga de 1,7 ml.
3. Añadir N (y </ Em> l, calculado de acuerdo con 4.1) y DPBS (23,5 - x - y) l. Mezclar con una punta de pipeta con un movimiento giratorio.
4. Centrifugar la mezcla a 8000 xg durante 2 min y se incuba a temperatura ambiente durante la noche.
   PRECAUCIÓN: los regentes utilizados para el siguiente ensayo de actividad son altamente tóxicos. Utilice las recomendaciones de seguridad específicas de las correspondientes fichas de datos de seguridad de materiales.
5. Para la reacción enzimática, sumergir el hidrogel en 1 ml de cóctel de reacción que contiene N, diamina N-dimetil-p-fenileno (5,8 mM), fenol (5,8 mM) e hidroperóxido de terc-butilo (2,9 mM) en n-heptano ^14. Interrumpir manualmente el gel usando una punta de pipeta para aumentar el área de superficie de contacto del hidrogel y el disolvente.
6. Detectar producto HRP, un tinte de tipo indofenol, mediante la medición de la absorbancia óptica de las muestras tomadas en diferentes momentos a 546 nm en un lector de placas (Figura 5).

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Resultados

Un esquema para la formación de hidrogel de proteína intein mediada se presenta en la Figura 1A. Los bloques de construcción de hidrogel son la proteína copolímeros Cuta-NpuN (N) y NPUC-S-cuta (C) (Figura 1A, Tabla 1). NpuN / C son las N-/C-fragments del DnaE dividir naturalmente inteína de Nostoc punctiforme (Npu). Cuta es una proteína trimérica estable de Pyrococcus horikoshii ^4,5. La mezcla de purificado N y C en la presencia del agente reductor TDT induce...

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Discusión

En este trabajo, hemos demostrado la síntesis de una gran estabilidad de hidrogel de proteína intein mediada. El uso de una fracción de inteína permite el hidrogel que se forme condicionalmente en respuesta a la mezcla de dos componentes en fase líquida. En concreto, la división inteína covalente une dos bloques de construcción en fase líquida a través de una reacción de trans-empalme, produciendo una unidad polipéptido flanqueada por unidades de reticulación que a su vez auto se ensambla en un hid...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Phusion High Fidelity DNA polymerase	New England BioLabs	M0530S
Competent Escherichia coli BL21 (DE3)	New England BioLabs	C2527I
Luria Bertani	VWR	90003-350
Bacto Agar Media	VWR
Kanamycin sulfate	VWR
IPTG	VWR	EM-5820
Imidazole	VWR	EM-5720
Urea	VWR	EM-9510
Dithiothreitol (DTT)	Fisher	BP172-5
Protease Inhibitor cocktail	Roche Applied Science	11836153001
DPBS	VWR	82020-066
Brilliant Blue R	Acros Organics	A0297990
Sodium Azide	Fisher	AC190380050	Caution, highly toxic
Horseradish peroxidase	Sigma	P8125-5KU
N,N-dimethyl-p-phenylene diamine	Fisher	AC408460250	Caution, highly toxic
phenol	Fisher	AC149340500	Caution, highly toxic
tert-butyl hydroperoxide	Fisher	AC180340050	Caution, highly toxic
n-heptane	Acros Organics	120340010
[header]
Shaker/Incubator	Fisher Scientific	Max Q 6000
Centrifuge	Sorvall	RC 6
Sonicator	QSonica	Misonix 200
Ultrafiltration Tubes	Amicon Ultra	UFC903024
Ni Sepharose High Performance HisTrap column	GE Healthcare Life Sciences	17-5248-01
HiTrap SP Sepharose FF ion exchange column	GE Healthcare Life Sciences	17-5156-01
Plate reader	Molecular Devices	SpectraMax Gemini EM