Synthese einer Intein-vermittelten Protein-Hydrogel Künstliche

Zusammenfassung

Wir stellen die Synthese eines Split-Intein-vermittelten Protein-Hydrogel. Die Bausteine ​​dieser Hydrogel zwei Copolymeren, die jeweils eine Protein-Untereinheit eines trimeren Protein, das als Vernetzer und eine Hälfte eines getrennten Inteins dient enthält. Das Mischen der beiden Protein-Copolymere löst eine Intein Transspleißreaktion, wodurch ein Polypeptid Einheit, die Selbstorganisation zu einem Hydrogel. Dieses Hydrogel ist stark pH-und temperaturstabil mit organischen Lösungsmitteln kompatibel sind und leicht integriert funktionellen globulären Proteinen.

Zusammenfassung

Wir präsentieren die Synthese eines hochstabilen Protein-Hydrogel von einem Split-Intein-katalysierte Protein Transspleißreaktion vermittelt. Die Bausteine ​​dieser Hydrogel zwei Protein-Blockcopolymere jeweils eine Untereinheit eines trimeren Protein, das als Vernetzer und eine Hälfte eines getrennten Inteins dient enthält. Ein stark hydrophiler Zufallsspule in einem der Blockcopolymere für die Wasserrückhaltung eingesetzt. Mischen der beiden Protein-Blockcopolymere löst eine Intein Transspleißreaktion, wodurch ein Polypeptid mit Vernetzern Einheit an jedem Ende, die schnell Selbstorganisation zu einem Hydrogel. Dieses Hydrogel ist sehr stabil unter sauren und basischen Bedingungen bei Temperaturen bis zu 50 ° C, und in organischen Lösungsmitteln. Das Hydrogel rasch Reformen nach scherinduzierten Bruch. Einbau einer "Dockingstation Peptid" in das Hydrogel Baustein ermöglicht die komfortable Einbindung von Tagged-Zielproteine ​​"Docking-Protein".Das Hydrogel wird mit Gewebekulturwachstumsmedium kompatibel ist, unterstützt die Diffusion von 20 kDa Moleküle und ermöglicht die Immobilisierung von bioaktiven globulären Proteinen. Die Anwendung der Intein-vermittelten Protein-Hydrogel nach einem organischem Lösungsmittel kompatibel Biokatalysator wurde durch Einkapseln des Meerrettich-Peroxidase-Enzym und erhärten seine Aktivität nachgewiesen.

Einleitung

Hydrogele ganz aus Proteinen tragen das Potenzial, die so unterschiedlichen Bereichen wie Tissue Engineering, Drug Delivery und biofabrication ^ein deutlich voranzubringen. Sie bieten Vorteile gegenüber herkömmlichen synthetischen Polymer Hydrogele einschließlich Biokompatibilität und das Potenzial, nicht-invasiv unterstützt den Einbau von Kugelstern bioaktiven Proteinen.

In dieser Arbeit beschreiben wir die Entwicklung einer neuen Protein-Hydrogel über eine Split-Intein-vermittelten Protein Transspleißreaktion und seine Anwendung als ein Protein Immobilisierung Gerüst (1) ausgebildet ist. Die Bausteine ​​für diese Protein-Hydrogel zwei Blockcopolymeren, die jeweils den N-oder C-terminales Fragment eines getrennten Inteins (IN und IC) und einer Untereinheit eines multimeren Proteins Vernetzer. Die DnaE Intein aus Nostoc punctiforme (Npu) wurde als Splitinteins ^2,3 und einem kleinen trimere Protein (12 kDa) CUTA aus Pyrococcus horikoshii / Em> wurde als Vernetzer Protein ^4,5 verwendet. Verschiedene Vernetzer werden durch Intein katalysiert Transspleißreaktion verbunden, was zur Bildung eines stark vernetzten Proteinnetzwerk (Hydrogel). Npu Intein wurde wegen seiner schnellen Reaktionskinetik (t _1/2 = 63 sec) und hohe trans-Spleißen Ausbeute (fast 80%) ^2,3 gewählt. Die CUTA Protein wurde als Vernetzungsmittel aufgrund seiner hohen Stabilität ausgewählt. CUTA Trimere eine Denaturierungstemperatur in der Nähe von 150 ° C und halten trimeren Quartärstruktur in Lösungen, die bis zu 5 M Guanidin-Hydrochlorid ^4,6. Da Wechseleinheit zwischen verschiedenen Vernetzer ist ein wesentlicher Faktor der physischen Hydrogel Oberflächenerosion ^7, sollte die sehr starke Wechselwirkung zwischen den Untereinheiten in CUTA wie Börsen-Untereinheit abhalten, was zu einer stabileren Hydrogel. Einer dieser Bausteine ​​enthält auch eine stark hydrophile Peptid S-Fragment als Mittelblock, um Wasser zu erleichternRetention ^8.

Das Mischen der beiden Hydrogel Bausteine ​​initiiert eine trans-Spleißen Reaktion zwischen dem IN-und IC-Intein-Fragmente, wodurch eine längere Polypeptidkette mit Vernetzer in beiden Terminals. Vernetzer aus mehreren solchen Moleküleinheiten miteinander interagieren, wodurch eine hochvernetzte Hydrogel-Netzwerk (1A). Ein spezifisches "Dockingstation Peptid" (DSP) in einem der Hydrogel-Bausteine ​​enthalten, um stabile Immobilisierung einer markierten Target-Protein in das Hydrogel "Docking-Protein" (DP) zu erleichtern. Die Verwendung eines getrennten Inteins zum Hydrogel Anordnung vermitteln stellt nicht nur zusätzliche Flexibilität für die Protein-Hydrogel-Synthese, sondern ermöglicht auch hoher Dichte, gleichmäßige Belastung des Zielproteins während des gesamten Hydrogel, da die Zielproteine ​​vor der Hydrogelbildung geladen.

Die Intein-vermittelten Protein-Hydrogel ist sehr staBLE in wässriger Lösung mit wenig bis gar keinem nachweisbaren Erosion nach 3 Monaten bei Raumtemperatur. Stabilität in einem weiten pH-Bereich (6-10) und Temperaturen (4-50 ° C) gehalten wird, und das Hydrogel auch mit organischen Lösungsmitteln kompatibel. Das grün fluoreszierende Protein (GFP) und Meerrettich-Peroxidase (HRP): Dieses Hydrogel wird zur Immobilisierung von zwei globulären Proteinen verwendet. Hydrogel Einschließen des letzteren Proteins verwendet wird, um die Biokatalyse in einem organischen Lösungsmittel durchzuführen.

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Protokoll

1. Plasmid-Bau

HINWEIS: Alle Gene wurden unter Standard-PCR-Reaktionen mit Phusion High-Fidelity DNA Polymerase pro Angaben des Herstellers amplifiziert. Primer für die Klonierung verwendet wurden zuvor ⁹ beschrieben. Alle Konstrukte sind in Tabelle 1 aufgeführt.

1. Um CUTA-NpuN (N, Tabelle 1) zu generieren:
   1. PCR verstärken CUTA und NpuN Gene von Plasmiden pET30-CUTA-Tip1 ¹⁰ und KanR-IntRBS-NpuNC ^CFN-11, jeweils mit den entsprechenden Primer.
   2. Verdauen diese Fragmente mit den geeigneten Restriktionsenzymen und sequentiell diese Fragmente in den Vektor pET26b zwischen dem T7-Promotor und ein C-terminales Tag 6xHistidine N (2A) zu erzeugen, einzufügen.
2. Um NpuC-S-CUTA (C, Tabelle 1) zu generieren:
   1. PCR Amplify NpuC, CUTA-und S-Fragmentierungt [AG ₃ (PEG)] ₁₀ von Plasmid-KanR IntRBS-NpuNC-CFN ^11, pET30-CUTA ^Tip1-10 und AC ₁₀ pQE9 ATRP ^12, jeweils mit den entsprechenden Primer.
   2. Digest diese Fragmente mit den entsprechenden Restriktionsenzymen und nacheinander diese Fragmente in den Vektor pET26b zwischen T7-Promotor und einem C-terminalen 6xHistidine zu erzeugen C (2B) einfügen.
3. : Um NpuC-S-SH _3-Liga CUTA _(C-SH3-lig, Tabelle 1) zu erzeugen
   1. PCR Amplify CUTA Verwendung von Primern, die eine SH3 _lig (PPPALPPKRRR) und einen flexiblen Linker (GGGGS) _2-Fragment, SH _3-Liga CUTA generieren.
   2. Ersetzen Sie die CUTA Gen aus C mit Fragment _SH3-Liga CUTA.
4. Um SH3-GFP (Tabelle 1) zu generieren:
   1. Erhöhen der SH3-Gen aus dem Plasmid pJD757 ¹³ unter Verwendung dergeeigneten Primer.
   2. Fuse Dieses Fragment auf das GFP-Gen und legen Sie sie in das pET26b Vektor zwischen dem T7-Promotor (2C) und eine C-terminale 6xHistidine-Tag.

2. Protein Expression

1. Transformation 50 ul chemisch kompetente Escherichia coli BL21 (DE3) mit dem entsprechenden Expressionsplasmid.
2. Nach der Transformation dieser Zellen seriell verdünnt, und diese Platte auf Luria-Bertani (LB) / Agar-Platten, die 50 ug / ml Kanamycin.
3. Inkubieren Platten, die transformierten Zellen bei 37 ° C für ~ 15 Stunden.
4. Nach der Inkubation, wählen Sie eine Platte, die 50 bis 100 Kolonien enthält und resuspendieren alle Kolonien in 5 ml LB-Brühe.
5. Übertragungs Suspension auf 1 l LB-Medium mit Kanamycin (50 ug / ml) wachsen und Zellen bei 37 ° C mit Schütteln bei 250 UpM. Überwachung der Absorption bei 600 nm (OD _600). Kultur wachsen, bis OD ₆₀₀ ~ 0,8.
   1. Für C und _C-SH3-Liga induzieren Proteinexpression durch Zugabe von Isopropyl-β-D-1-thiogalactopyranosid (IPTG) zu der Kultur (1 mM Endkonzentration) und Inkubieren der Kultur bei 37 ° C für 4 Stunden unter Schütteln bei 250 UpM.
   2. Für N-und SH3-GFP, kühlen die Kultur auf ~ 18 ° C durch Eintauchen des Kulturkolben in einem Eiswasserbad für ~ 5 min. Induzieren Proteinexpression durch Zugabe von IPTG zur Kultur (1 mM Endkonzentration) und Inkubieren der Kultur bei 18 ° C für 14-18 Stunden unter Schütteln bei 250 UpM.
6. Nach Proteinexpression Zentrifugation der Kultur bei 6000 × g für 20 min bei 4 ° C, um das Pellet zu sammeln. Speicher Zellpellet bei -80 ° C bis zur Verwendung.

3. Protein Purification

1. Reinigung von N (denaturierende Bedingungen)
   1. Resuspendieren Zellpellets in Puffer A (Tabelle 2) bei 10 ml / g nasses Pellet.
   2. Immerse die Pellet-Suspension in einem Eis-Wasser-Bad und stören die Zellen durch Ultraschallbehandlung (Amp 10, wobei 1 sec Puls und 6 sec Pause für 1 min).
   3. Zentrifugieren des Lysats bei 16.000 × g für 20 min bei 4 ° C.
   4. Überstand verwerfen. Das Pellet in Puffer DA (enthaltend 8 M Harnstoff) und Zentrifugieren der Suspension bei 16.000 × g für 20 min bei 4 ° C.
   5. Die überstehende, durch eine 5 ml Ni-Nitrilotriessigsäure (NTA)-Säule zuvor mit Puffer äquilibriert DA.
   6. Mit 30 ml Puffer DA mit 45 mM Imidazol-Waschkolonne ergänzt. Eluiere gereinigtes Protein mit 20 ml Puffer DA mit 150 mM Imidazol ergänzt.
   7. Verringerung der Harnstoffkonzentration in der Proteinprobe auf <1 mM durch eines der folgenden Verfahren in 3.1.7.1 oder 3.1.7.2 angegeben:
      1. Dialysieren Protein in DPBS-Puffer (Tabelle 2) bei 4 ° C über Nacht unter Verwendung von Hülsen mit <20 kDa Cutoff.
      2. Zentrifuge gereinigtes Protein in einem 30 & #160; kDa Ultrafiltrations Spin-Säule bei 2.800 × g, 4 ° C, bis das Volumen weniger als 1 ml beträgt. In 14 ml DPBS-Puffer auf die Säule, um die Proteinprobe zu verdünnen. Wiederholen Sie die Zentrifugation / Verdünnungsstufen drei weitere Male.
   8. Nach dem Pufferaustausch, fügen Dithiothreitol (DTT), um das gereinigte Protein (final 2 mM) und konzentriert Protein auf ~ 100 mg / ml durch Zentrifugation durch ein 30 kDa Ultrafiltrations Spin-Säule bei 2.800 × g, 4 ° C
   9. Aliquot des konzentrierten Protein und bei -80 ° C bis zur Verwendung.
2. Reinigung von C-und C-SH3 _lig (native Zustand)
   1. Resuspendieren Zellpellets in Puffer B (pH 6,0) (Tabelle 2) mit 1x-Protease-Inhibitor-Cocktail, ergänzt mit 10 ml / g nasses Pellet. Verwenden sauren Puffer proteolytischen Abbau des Zielproteins zu minimieren.
   2. Stören Zellsuspension durch Beschallung wie in 3.1.2 beschrieben. Zentrifugieren Sie die lysaß bei 16.000 × g für 20 min bei 4 ° C und halten Sie den Überstand.
   3. Übergeben Sie die lösliche Lysat durch eine 5-ml-Ni-NTA-Säule zuvor mit Puffer B äquilibriert
   4. Waschsäule mit Puffer B, ergänzt mit 45 mM Imidazol, eluiert und das Zielprotein in 20 ml Puffer B mit 150 mM Imidazol ergänzt.
   5. Für C, weiter mit Schritt 3.2.6. Für _C-SH3-lig, führen Sie eine zusätzliche Ionenaustausch-Reinigungsschritt teilweise abgebauten Protein zu entfernen wie in den Schritten gegeben 3.2.5.1 bis 3.2.5.3
      1. Reduzieren NaCl-Konzentration in _C-SH3-lig auf <1 mM nach dem in 3.1.7 beschriebenen Verfahren.
      2. Laden des Zielproteins auf eine 5 ml Anionenaustauscher-Agarose-Perlen Matrixspalte vorher mit Natriumphosphatpuffer (50 mM, pH 7,0) äquilibriert.
      3. Eluat Zielproteins von der Säule, indem eine Steigung von einer Lösung, die 10 mM Tris-HCl pH 8,0 Buffer zu einer Lösung, die den gleichen Puffer mit 1 M NaCl ergänzt. Proben zu entnehmen, während Protein-Elution und Pool-Proben mit der höchsten Reinheit, basierend auf Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE).
   6. Puffer des gereinigten Protein austauschen in DPBS-Puffer, wie in 3.1.7 beschrieben.
   7. Hinzufügen DTT zu dem gereinigten Protein (Endkonzentration 2 mM) und konzentriere das Protein auf ~ 100 mg / ml unter Verwendung einer 30 kDa Ultrafiltrations Spin-Säule wie in 3.1.8 beschrieben. Aliquot und speichern konzentrierte Protein bei -80 ° C bis zur Verwendung.
3. Reinigung von SH3-GFP
   1. Resuspendieren Zellpellets unter Verwendung von Puffer A auf 10 ml / g nasses Pellet.
   2. Stören Pellet-Suspension durch Beschallung wie in 3.1.2 beschrieben.
   3. Zentrifugieren des Lysats bei 16.000 × g für 20 min bei 4 ° C und Sammeln des Überstands.
   4. Führen Sie den Überstand (lösliche Lysat) durch eine 5-ml-Ni-NTA-Säule zuvor mit ins GleichgewichtPuffer A.
   5. Waschen Säule mit 30 ml Puffer A, ergänzt mit 45 mM Imidazol. Eluens Protein unter Verwendung von 20 ml Puffer A, ergänzt mit 150 mM Imidazol.
   6. Pufferaustausch des gereinigten Proteins in DPBS-Puffer mit einem ähnlichen Ansatz wie in 3.1.7 beschrieben, und das Protein zu konzentrieren, um ~ 150 mg / ml unter Verwendung einer 30 kDa Ultrafiltrations Spin-Säule wie in 3.1.8 beschrieben.
   7. Aliquot und speichern gereinigte Protein bei -80 ° C bis zur Verwendung.
4. SDS-PAGE-Analyse der gereinigten Proben, die CUTA
   1. Verdünnen jedes gereinigte Protein in doppelt destilliertem Wasser, um die Konzentration von NaCl auf ca. 1 mm zu reduzieren. An dieser NaCl-Konzentration, führen die meisten der CUTA Trimer Proteine ​​als Monomere auf den SDS-PAGE-Gelen.
   2. Mischungsproben mit 2x SDS-Probenpuffer (0,5 M Tris-HCl, pH 6,8, 20% Glycerin, 10% w / v SDS, 0,1% w / v Bromphenol blau, 2% β-Mercaptoethanol) bei 95 ° C inkubiert, für 5 min.
   3. Laden Sie das samsätze auf ein 12% SDS-PAGE-Gel. Durchführung der Elektrophorese bei einer konstanten Spannung von 200 V für ~ 50 min.
   4. Beachten Protein in den Gelen durch Färbung mit Coomassie Brilliant Blue R250 nach den Standardprotokollen (Abbildung 1C).

4. Hydrogelierung

HINWEIS: Die Probe Hydrogele in dieser Studie beruhen 1,6 mM jedes Hydrogel Baustein sofern nicht anders angegeben. Diese Proteinkonzentration ergibt ein weiches und stabiles Hydrogel. VORSICHT: Natriumazid (NaN ₃₎ mit dem Hydrogel in einer Endkonzentration von 0,5% w / v zugegeben, um eine bakterielle Kontamination zu verhindern. NaN ₃ ist hochgiftig und muss mit äußerster Sorgfalt behandelt, wie im Sicherheitsdatenblatt angegeben werden.

1. Berechne das Volumen für jede der konzentrierten Proteine ​​benötigt, um eine Endkonzentration von 1,6 mM in einem 100 &mgr; l-Probe Hydrogel zu erreichen. Zum Beispiel:
   Konzentration von N:100 mg / ml
   Molekulargewicht von N: 26,3 kDa (siehe Tabelle 1)
   Wunsch Volumen: 100 ul Wunsch Konzentration: 1,6 mM
   
2. Um eine 100 &mgr; l-Hydrogel (1,6 mm) zu machen, mischen C (x &mgr; l, entsprechend 4.1 berechnete Volumen) mit 5% NaN ₃ (10 &mgr; l), entsprechend 100 mM DTT (5 &mgr; l) und N (y &mgr; l Volumen berechnet 4.1) in einem 2 ml-Glasfläschchen.
3. Hinzufügen DPBS-Puffer ((85 - x - y) ul) in das Fläschchen, um ein Endvolumen von 100 &mgr; l zu erreichen, und alle Komponenten über eine Wirbelbewegung mit einer Pipettenspitze von Hand zu mischen. Anmerkung: Die Lösung sehr viskos beim Mischen.
4. Zentrifugieren der Mischung für 2 min bei 8.000 × g, um die Luftblasen zu entfernen.
5. Inkubieren der Mischung bei RaumTemperatur über Nacht, damit der Intein-trans-Spleißen Reaktion zum Abschluss zu erreichen. Bestätigen Hydrogelbildung durch Drehen Rohr auf den Kopf. Die Proteine ​​nicht fließen, wenn ein Hydrogel gebildet wird.
6. Schätzen Sie die Intein-trans-Spleißen Ausbeute, indem Proben (0,5 ul jeweils) vor dem Schritt nach Schritt 4.2 und 4.5 auf einem SDS-PAGE-Gel gesammelt, wie in 3.4 (Abbildung 1C) beschrieben.

5. Immobilisierung von GFP über Docking Protein (DP) und Peptid-Docking Station (DSP) Wechselwirkung

1. Um eine 50 ul GFP-funktionalisierten Hydrogel (1,2 mm), kombinieren C-SH3 _lig (x ul, nach 4.1 berechnet) und SH3-GFP (y ul, nach 4.1 berechnet) bei molaren Verhältnis von 1:1 in einem 1,7 ml-Mikrozentrifugenröhrchen und Inkubieren der Mischung bei Raumtemperatur für 30 min.
2. In 5% NaN ₃ (5 ul), 100 mM DTT (2,5 ul), (42.5 - x - y) ul DPBS auf die gleiche Röhre. Add N (y ul, entsprechend 4,1 berechnet) zu einem 1:1-Molverhältnis von N-und _C-SH3-Liga erzielen. Die Probe durch mit einer Pipettenspitze von einem Wirbelbewegung.
3. Zentrifugieren des Gemisches bei 8000 × g für 2 min und Inkubation der Mischung bei Raumtemperatur über Nacht im Dunkeln. Ein Hydrogel Verkapselung SH3-GFP Formen während der Inkubation.

6. Die Verwendung von 1,6 mM Hydrogel als Gerüst für die Immobilisierung enzymatischen Reaktion in einem organischen Lösungsmittel

1. Verwenden Sie die HRP als Modell-Enzym. Bereiten Sie eine Stammlösung von HRP (28 mg / ml oder 0,63 mM) in DPBS.
2. , Um eine 30 &mgr; l-Hydrogel (1,6 mM) Einschließen HRP, kombinieren C (x ul, entsprechend 4,1 berechnet) mit HRP (2 &mgr; l), 5% NaN ₃ (3 &mgr; l) und DTT (1,5 ul 100 mM) in einen 1,7 ml-Zentrifugenröhrchen.
3. In N (y </ Em> ul, nach 4.1 berechnet) und DPBS (23,5 - x - y) ul. Mischen Sie mit einer Pipettenspitze mit einer Wirbelbewegung.
4. Zentrifugieren des Gemisches bei 8000 × g für 2 min und bei Raumtemperatur über Nacht.
   ACHTUNG: die für die folgenden Aktivitätstest verwendet Regenten sind hochgiftig. Verwenden Sie spezifische Sicherheitsempfehlungen durch die entsprechenden Sicherheitsdatenblätter.
5. Für die enzymatische Reaktion, tauchen das Hydrogel in 1 ml Reaktionscocktail, der N, N-Dimethyl-p-Phenylendiamin (5,8 mM), Phenol (5,8 mM) und tert-Butylhydroperoxid (2,9 mM) in n-Heptan ^14. Manuelles stören das Gel mit einer Pipettenspitze, um die Kontaktfläche des Hydrogels und das Lösungsmittel zu erhöhen.
6. Erkennen HRP Produkt, ein Indophenol-Farbstoff, durch Messung der optischen Extinktion der Proben zu verschiedenen Zeiten bei 546 nm in einem Plattenlesegerät (Fig. 5) aufgenommen.

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Ergebnisse

Ein Schema für Intein-vermittelten Protein-Hydrogel-Bildung ist in Fig. 1A dargestellt. Die Bausteine ​​des Hydrogels sind die Protein-Copolymere CUTA NpuN (N) und NpuC-S-CUTA (C) (Fig. 1A, Tabelle 1). NpuN / C sind die N-/C-fragments der natürlich aufgeteilt DnaE Intein aus Nostoc punctiforme (Npu). CUTA ist eine stabile trimere Protein aus Pyrococcus horikoshii ^4,5. Mischen von gereinigtem N und C in Gegenwart des Reduktionsmittels DTT induziert die Bildung v...

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Diskussion

In dieser Arbeit haben wir gezeigt, die Synthese eines hochstabilen Intein-vermittelten Protein-Hydrogel. Die Verwendung eines getrennten Inteins ermöglicht das Hydrogel bedingt in Antwort auf das Mischen von zwei Flüssigphasen-Komponenten gebildet werden. Insbesondere die Splitinteins kovalent verbindet zwei Flüssigphasen-Bausteine ​​über eine Transspleißreaktion, wodurch ein Polypeptid Einheit durch Vernetzung von Einheiten, die wiederum selbst montiert in ein Hydrogel flankiert. Das Mischen induzier...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Phusion High Fidelity DNA polymerase	New England BioLabs	M0530S
Competent Escherichia coli BL21 (DE3)	New England BioLabs	C2527I
Luria Bertani	VWR	90003-350
Bacto Agar Media	VWR
Kanamycin sulfate	VWR
IPTG	VWR	EM-5820
Imidazole	VWR	EM-5720
Urea	VWR	EM-9510
Dithiothreitol (DTT)	Fisher	BP172-5
Protease Inhibitor cocktail	Roche Applied Science	11836153001
DPBS	VWR	82020-066
Brilliant Blue R	Acros Organics	A0297990
Sodium Azide	Fisher	AC190380050	Caution, highly toxic
Horseradish peroxidase	Sigma	P8125-5KU
N,N-dimethyl-p-phenylene diamine	Fisher	AC408460250	Caution, highly toxic
phenol	Fisher	AC149340500	Caution, highly toxic
tert-butyl hydroperoxide	Fisher	AC180340050	Caution, highly toxic
n-heptane	Acros Organics	120340010
[header]
Shaker/Incubator	Fisher Scientific	Max Q 6000
Centrifuge	Sorvall	RC 6
Sonicator	QSonica	Misonix 200
Ultrafiltration Tubes	Amicon Ultra	UFC903024
Ni Sepharose High Performance HisTrap column	GE Healthcare Life Sciences	17-5248-01
HiTrap SP Sepharose FF ion exchange column	GE Healthcare Life Sciences	17-5156-01
Plate reader	Molecular Devices	SpectraMax Gemini EM