インテイン媒介人工タンパク質ヒドロゲルの合成

要約

当社は、分割インテイン媒介タンパク質ヒドロゲルの合成を提示する。このヒドロゲルのビルディングブロックは、それぞれが分割インテインの架橋剤及び半分となる三量体タンパク質のサブユニットを含む二つのタンパク質の共重合体である。二つのタンパク質の共重合体の混合は、ヒドロゲルに自己組織化ペプチドユニットを得インテイントランススプライシング反応をトリガします。このヒドロゲルは、有機溶媒に対応して、高度なpHおよび温度安定性であり、簡単に機能的な球状タンパク質が組み込まれています。

要約

当社は、分割インテイン触媒によるタンパク質トランススプライシング反応によって媒介性の高い安定なタンパク質ヒドロゲルの合成を提示する。このヒドロゲルのビルディングブロックは、それぞれが分割インテインの架橋剤及び半分となる三量体タンパク質のサブユニットを含む二つのタンパク質のブロックコポリマーである。親水性の高いランダムコイルは、保水性ブロックコポリマーの1つに挿入される。 2タンパク質のブロックコポリマーの混合は両端に架橋剤とペプチドユニットを得インテイントランススプライシング反応をトリガするヒドロゲルに急速に自己集合。このヒドロゲルは、酸性および塩基性の両方の条件下で、50°Cまでの温度で、有機溶媒中で非常に安定である。せん断誘発の破裂後のヒドロゲルは、急速な改革。ヒドロゲルビルディングブロックに「ドッキングステーションペプチド」の組み込みは、「ドッキングタンパク「タグ化標的タンパク質の簡便な取り込みを可能にする。ヒドロゲルは、組織培養増殖培地と互換性のある20 kDaの分子の拡散をサポートし、生​​物活性球状タンパク質の固定化を可能にする。有機溶媒適合性、生体触媒としてインテイン媒介タンパク質ヒドロゲルの適用は、西洋ワサビペルオキシダーゼ酵素をカプセル化し、その活性を確証することによって実証された。

概要

タンパク質の全く作らヒドロゲルは大幅に組織工学、薬物送達およびbiofabrication ¹のように多様な分野を進める可能性を運ぶ。彼らは、生体適合性と非侵襲的に生体活性球状タンパク質の取り込みをサポートするための可能性を含め、従来の合成高分子ヒドロゲルを上回る利点を提供します。

本研究では、分割インテイン媒介タンパク質トランス-スプライシング反応およびタンパク質固定足場（ 図1）としてのその適用を介して形成された新規タンパク質、ヒドロゲルの開発を記載している。このヒドロゲルのためのビルディングブロックは、各々が（INおよびIC）を分割インテインおよび多量体タンパク質の架橋サブユニットのN-またはC-末端断片を含む二つのタンパク質のブロックコポリマーである。のDnaEはインテノストックパンクチ （NPU）から<ホリコシパイロコッカスから^2,3インテ分割し、小さなトリマータンパク質（12 kDa）のCutAとして使用された/全角>は架橋タンパク質^4,5として使用した。異なる架橋剤は高度に架橋されたタンパク質ネットワーク（ハイドロゲル）の形成を導く、インテイン触媒によるトランス - スプライシング反応を介して接合されている。 NPUのインテインは、その高速な反応速度（T _1/2 = 63秒）、高トランススプライシング利回り（近い80％） ^の2,3の選ばれた。 CutAタンパク質は、その高い安定性のために、架橋剤として選ばれた。 CutAトリマーは、近い150℃の変性温度を持っているし、できるだけ多くのM 5として塩酸グアニジン^4,6を含む溶液中で三量体四次構造を保持する。異なる架橋剤間のサブユニット交換は、物理的なハイドロゲル表面侵食⁷の主要な原因であることから、CutA非常に強い間、サブユニットの相互作用は、より安定したヒドロゲルにつながるようなサブユニットの交換を阻止する必要があります。これらのビルディングブロックの一つは、水を容易にするために、中間ブロックとして親水性の高いS-ペプチド断片を含むリテンション^8。

2ヒドロゲルのビルディングブロックの混合は、両末端に架橋剤と、より長いポリペプチド鎖を生成し、フラグメントインテインINとICの間のトランス-スプライシング反応を開始する。複数のそのような分子単位の架橋剤は、高度に架橋されたヒドロゲル網目構造（ 図1A）を形成し 、互いに相互作用する。特定の「ドッキングステーションペプチド」（DSP）「ドッキングタンパク質」（DP）の安定な固定化を容易にするために、ヒドロゲル構成要素の1つに組み込まれているタグ化標的タンパク質へのヒドロゲル。のみならず、ヒドロゲルアセンブリを媒介するインテイン分割の使用は、タンパク質、ヒドロゲル合成のための追加の柔軟性を提供するだけでなく、標的タンパク質前ヒドロゲル形成にロードされるように、全体ヒドロゲルを通して標的タンパク質の高密度で均一な充填を可能にする。

インテイン媒介タンパク質ハイドロゲルは非常に安定である室温で3ヶ月後のリトル·ツー·検出可能な浸食と、水溶液中のBLE。安定性のpH（6-10）および温度（4-50℃）の広い範囲内に保持し、ヒドロゲルはまた、有機溶媒と適合性である。緑色蛍光タンパク質（GFP）、西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）：このヒドロゲルは2つの球状タンパク質の固定化のために使用される。後者のタンパク質を捕捉するヒドロゲルを有機溶媒に生体触媒を実行するために使用される。

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プロトコル

1。プラスミド構築

注：すべての遺伝子は、製造業者の仕様に従ってのPhusion高忠実度DNAポリメラーゼを使用する標準的なPCR反応条件下で増幅した。クローニングに用いたプライマーは以前に記載されている^9。全ての構築物を表1に示す。

1. CutA-NpuN（N、表1）を生成する。
   1. PCRは、適切なプライマーを用いて、それぞれのプラスミドたpET30-CutA-TIP1 ¹⁰とKanR-IntRBS-NpuNC-CFNの¹¹からCutAとNpuN遺伝子を増幅。
   2. 適当な制限酵素でこれらの断片を消化し ​​、順次、T7プロモーターおよびN（図2A）を生成するC-末端タグの間6xHistidineいるpET26Bベクターにこれらのフラグメントを挿入する。
2. NpuC-S-CutA（C、表1）を生成する。
   1. PCRはNpuC、CutAとSフラグメンテーションを増幅適切なプライマーを用いて、それぞれプラスミドKanR-IntRBS-NpuNC-CFNの^11、たpET30-CutA-TIP1 ¹⁰とpQE9交流₁₀ ATRP ¹²からT [AG _{3（PEG）] 10。}
   2. 適当な制限酵素でこれらの断片を消化し ​​、順次、T7プロモーターおよびC（図2B）を生成するC-末端との間の6xHistidineいるpET26Bベクターにこれらのフラグメントを挿入する。
3. ：NpuC-S-SH3 _{LIG-CutA（C-SH3}の_LIG、 表1）を生成する
   1. PCRは、フラグメントのSH3 _LIG-CutAを生成するのSH3 _{LIG（PPPALPPKRRR）}と柔軟なリンカー_{（GGGGS）2を}含むプライマーを使用してCutAを増幅する。
   2. フラグメントSH3 _LIG-CutAとCからCutA遺伝子を交換してください。
4. SH3-GFP（ 表1）を生成する。
   1. 使用してプラスミドpJD757 ¹³からSH3遺伝子を増幅適切なプライマー。
   2. GFP遺伝子にこの断片を融合し、T7プロモーター（ 図2C）およびC末端6xHistidineタグとの間にいるpET26Bベクターに挿入します。

2。タンパク質の発現

1. 適当な発現プラスミドで化学的にコンピ大腸菌 BL21（DE3）の50μlのを変換します。
2. 形質転換後、連続的にこれらの細胞を希釈し、ルリア - ベルターニ（LB）上にプレート/ 50μg/ mlのカナマイシンを含む寒天プレート。
3. 〜15時間、37℃で形質転換された細胞を含むプレートをインキュベートする。
4. インキュベーションの後、50〜100個のコロニーが含まれているプレートをピックアップし、LBブロス5mlに全てのコロニーを懸濁します。
5. 転送サスペンションカナマイシン（50μg/ mlの）を含む1LのLBブロスに、250rpmで振盪しながら37℃で細胞を増殖させる。 600ナノメートル（OD _600）での吸光度をモニターする。 OD _600〜0.8までの文化を育てる。
   1. C及びC-SH3 _LIGのために、培養（最終濃度1mM）にイソプロピルβ-D-1-チオガラクトピラノシド（IPTG）を加えることでタンパク質発現を誘導し、250rpmで振盪しながら4時間37℃で培養物をインキュベートする。
   2. NおよびSH3-GFPについては、約5分間、氷水浴中で培養フラスコを浸漬することにより培養物を〜18℃に冷却する。文化（1mMの最終濃度）にIPTGを添加することにより、タンパク質の発現を誘導し、250rpmで振とうしながら14〜18時間、18℃で培養液を、。
6. タンパク質発現の後、ペレットを収集するために、4℃で20分間、6,000×gで培養物を遠心分離する。使用するまで-80℃で保存した細胞ペレット。

3。タンパク質精製

1. Nの精製（変性条件）
   1. 湿ったペレットを10ミリリットル/ gで、緩衝液A（ 表2）に再懸濁細胞ペレット。
   2. Immers氷水浴中でペレット懸濁液を電子と（1秒パルスおよび1分6秒の休止とアンプ10、）超音波処理により細胞を破壊する。
   3. 4℃で20分間16,000×gで溶解液を遠心分離
   4. 上清を捨てる。バッファDA（8 M尿素を含有する）及び遠心分離機で4℃で20分間16,000 xgで懸濁液中にペレットを再懸濁
   5. 以前にバッファDAで平衡化した5ミリリットルのNi-ニトリロ三酢酸（NTA）カラムに通して上清を渡します。
   6. 45 mMイミダゾールを補ったバッファーDAの30ミリリットルでカラムを洗浄します。 150 mMイミダゾールを補充した緩衝液20mlのDAを使用して精製したタンパク質を溶出させる。
   7. 3.1.7.1または3.1.7.2で与えられ、次のいずれかの方法により、<1 mmのタンパク質試料中の尿素濃度を低下させる。
      1. <20 kDaのカットオフを有するチューブを用いて4℃で一晩DPBS緩衝液（ 表2）でタンパク質を透析する。
      2. 遠心分離器は、30＆＃中のタンパク質を精製した160; 2,800 xgでkDaの限外濾過スピンカラム、4°Cにまで体積1 ml未満である。タンパク質試料を希釈するために列に14ミリリットルのDPBSバッファーを追加します。遠心分離/希釈は3回以上繰り返し繰り返します。
   8. バッファー交換した後、精製したタンパク質（最終2mM）をにジチオスレイトール（DTT）を追加し、2800×gで30kDaの限外ろ過スピンカラム、4℃を通して遠心分離により〜100 mg / mlのにタンパク質を濃縮
   9. 使用するまで-80℃で濃縮されたタンパク質や店舗を分取。
2. CおよびC-SH3 _LIGの精製（ネイティブ条件）
   1. 10ミリリットル/湿ったペレットのgで1Xプロテアーゼ阻害剤カクテルを補充した緩衝液Bに再懸濁細胞ペレット（pH6.0）である（ 表2）。標的タンパク質のタンパク質分解を最小にするために、酸性緩衝液を使用する。
   2. 3.1.2に記載のように超音波処理により細胞懸濁液を破壊する。遠心分離機のLys4℃で20分間16,000×gで食べたし、上清を保持します。
   3. 以前にバッファーBで平衡化した5mlのNi-NTAカラムを通して可溶性溶解を渡す
   4. 緩衝液Bで洗浄カラムは、45 mMイミダゾールを補充し、および150 mMイミダゾールを補充した緩衝液Bを20mlの標的タンパク質を溶出させる。
   5. Cの場合は、3.2.6に進みます。 C-SH3の_LIGについては、3.2.5.3と3.2.5.1ステップで与えられている部分的に分解されたタンパク質を除去するために追加のイオン交換精製工程を行う
      1. 3.1.7で説明した手順に従って、<1 mmの_LIG C-SH3中のNaCl濃度を低下させる。
      2. 予めリン酸ナトリウム緩衝液（50mM、pH7.0）で平衡化させた5mlの陰イオン交換ビーズアガロースマトリックスカラムに標的タンパク質をロードする。
      3. 溶出液は、10mMトリス-HCl pH8.0のbuffeを含有する溶液の勾配を実行して、カラムからタンパク質を標的とする1 M NaClを補充した同じ緩衝液を含有する溶液にrであるドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）に基づいて、最高純度のタンパク質溶出プール試料中にサンプルを採取する。
   6. 3.1.7に記載のように、DPBSバッファー中に精製されたタンパク質を緩衝液交換。
   7. 精製されたタンパク質（最終濃度2 mM）をにDTTを追加し、3.1.8で説明したように〜100 mg / mlの30kDaの限外ろ過スピンカラムを使用してタンパク質を濃縮。分量とストアが使用するまで-80℃でタンパク質を濃縮した。
3. SH3-GFPの精製
   1. 10ミリリットル/湿ったペレットのgの緩衝液Aを使用して再懸濁細胞ペレット。
   2. 3.1.2で説明したように超音波処理によりペレットサスペンションを混乱させる。
   3. 遠心4℃で20分間16,000 xgで溶解物および上清を回収する。
   4. 以前で平衡化した5mlのNi-NTAカラムを通して上清（可溶性溶解）を渡す緩衝液A
   5. 緩衝液A 30mlで洗浄カラムは、45 mMイミダゾールを補った。緩衝液A 20mlの溶出を用いて精製したタンパク質を150 mMイミダゾールを補充した。
   6. 緩衝液は、3.1.7で述べたものと同様のアプローチを用いてDPBS緩衝液中に精製されたタンパク質を交換し、〜150mgのタンパク質を濃縮/ mlの3.1.8に記載されるように30kDaの限外濾過スピンカラムを用いて。
   7. 使用するまで-80℃で精製タンパク質をアリコートし、保存します。
4. CutAを含む精製サンプルのSDS-PAGE分析
   1. 〜1 mMのNaCl濃度を減少させるために二重蒸留水に各精製タンパク質を希釈する。このNaCl濃度で、CutA三量体タンパク質のほとんどは、SDS-PAGEゲル上で単量体として実行する。
   2. 95℃でインキュベートした2×SDSサンプル緩衝液（0.5 Mトリス - 塩酸、pH 6.8、20％グリセロール、10％/ vのSDS、0.1％w / vブロモフェノールブルー、2％β-メルカプトエタノールw）を有する試料を混合5分間。
   3. SAMを読み込む12％SDS-PAGEゲル上にples。 〜50分間、200Vの定電圧で電気泳動を行う。
   4. 標準プロトコル（ 図1C）は、次のクマシーブリリアントブルーR250で染色することにより、ゲル中のタンパク質を観察します。

4。ヒドロゲル形成

注：特に断りのない限り、本研究で作成したサンプルのヒドロゲルは、各ヒドロゲルビルディングブロックの1.6 mMのが含まれています。このタンパク質濃度は柔らかく、安定したヒドロゲルが得られる。注意：アジ化ナトリウム（NaN _3を ） _は、細菌汚染を防ぐために、w / vの最終濃度0.5％にヒドロゲルに添加される。のNaN _3は、非常に毒性があり、化学物質等安全データシートに示されているように、細心の注意を払って取り扱わなければならない。

1. 100μlのサンプルヒドロゲル中に1.6 mMの最終濃度を達成するために必要な濃縮タンパク質のそれぞれについて体積を計算する。たとえば、次のように
   Nの濃度：100 mg / mlの
   Nの分子量：26.3 kDaの（ 表1を参照してください）
   所望の体積：100μlの所望の濃度：1.6 mMの
   
2. 100μlのハイドロゲル（1.6 mm）を作るために、C言語を混在させる（XμL、容量4.1に従って計算）5％のNaN _3（10μL）で、100のDTT（5μL）とN（YμL、音量に応じて算出4.1）2を10mlのガラスバイアルの内部。
3. 最終容量100μlを達成するために、バイアルに（Y）μL - - X（85）と、手動ピペットチップを使用して旋回運動を経由してすべてのコンポーネントを混在させるDPBSバッファーを追加します。注意：ソリューションは、混合時に非常に粘稠になる。
4. 気泡を除去するために8,000×gで2分間混合物を遠心分離する。
5. 室温で混合物をインキュベートインテイントランス -スプライシング反応が完了に到達させるために一晩温度。逆さにチューブを回して、ハイドロゲル形成を確認してください。ハイドロゲルが形成されるとタンパク質が流れない。
6. 3.4（ 図1C）で説明したように、ステップ4.2の前にし、SDS-PAGEゲル上でステップ4.5の後に採取した試料（0.5μLずつ）チェックして、インテトランススプライシング収量を推定する。

5。ドッキングタンパク質（DP）とドッキングステーションを経由して、GFPの固定化ペプチド（DSP）の相互作用

1. 50μlのGFP-官能化ヒドロゲル（1.2 mm）を作るために1.7での1:1のモル比で、（4.1に従って計算、XμL）C-SH3の_LIGを組み合わせて、SH3-GFP（YμL、4.1に従って計算） mlマイクロ遠心チューブ30分間室温で混合物をインキュベートする。
2. X - - ​​<5％のNaN _{3（5μL）、100}のDTT（2.5μL）、（42.5の追加同じチューブにEM> Y）μlのDPBS。 N及びC-SH3 _LIGの1:1モル比を達成するためにN（yの μlの4.1に従って計算）を添加する。旋回運動によりピペットチップを用いて試料を混合する。
3. 2分間8,000×gで遠心分離し、混合物を暗所で室温で一晩混合物をインキュベートする。インキュベーション中にSH3-GFPフォームをカプセル化ヒドロゲル。

6。有機溶媒中の酵素反応のための固定化の足場として1.6 mMのハイドロゲルの使用

1. モデル酵素として、HRPを使用してください。 DPBS中のHRP（28 mg / mlのか、0.63ミリモル）のストック溶液を準備します。
2. HRPを捕捉30μlのハイドロゲル（1.6 mm）を作るために、C内の HRP（2μL）、5％のNaN _3（3μL）およびDTT（100 mMと1.5μL）と（XμL、4.1に従って計算）を組み合わせ1.7ミリリットルの遠心管。
3. N（Yを追加する</ em>の4.1に従って計算μL、）とDPBS（23.5 - X - Y）μL。旋回運動をピペットチップで混ぜる。
4. 2分間8,000×gで遠心分離し、混合物を室温で一晩インキュベートする。
   注意：以下の活性アッセイに用いジェンツは非常に有毒である。対応する化学物質等安全データシートにより、特定の安全勧告を使用してください。
5. 酵素反応は、N、N-ジメチル-p-フェニレンジアミン（5.8 mM）を、n-ヘプタン¹⁴中のフェノール（5.8ミリモル）およびtert-ブチルヒドロペルオキシド（2.9ミリモル）を含有する反応カクテル1mlのヒドロゲルを沈める。手動ヒドロゲルおよび溶媒の接触面積を増加させるためにピペットチップを用いてゲルを破壊する。
6. プレートリーダー（ 図5）で546 nmでの異なる時点で採取した試料の吸光度を測定することにより、HRP生成物、インドフェノール系色素を検出する。

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結果

インテイン媒介タンパク質ヒドロゲルを形成するための模式図を図1Aに提示される。ヒドロゲルのビルディングブロックは、タンパク質がCutA-NpuN（N）およびNpuC-S-CutA（C）（ 図1A、表1）コポリマーである。 NpuN / Cノストックパンクチ（NPU）からインテ自然に分割のDnaEのN-/C-fragmentsです。 CutAはパイロコッカスホリコシ ^4,5から安定した三量体タンパク質で...

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ディスカッション

本研究では、安定性の高いインテイン媒介タンパク質ヒドロゲルの合成を示した。分割の使用は、条件付きインテインつの液相の成分の混合に対応して形成されるヒドロゲルを可能にする。具体的には、分割インテイン共有結合ターンでヒドロゲルに自己アセンブル単位を架橋することにより隣接されるポリペプチドユニットを得、 トランス -スプライシング反応を介して2つの液相の...

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資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Phusion High Fidelity DNA polymerase	New England BioLabs	M0530S
Competent Escherichia coli BL21 (DE3)	New England BioLabs	C2527I
Luria Bertani	VWR	90003-350
Bacto Agar Media	VWR
Kanamycin sulfate	VWR
IPTG	VWR	EM-5820
Imidazole	VWR	EM-5720
Urea	VWR	EM-9510
Dithiothreitol (DTT)	Fisher	BP172-5
Protease Inhibitor cocktail	Roche Applied Science	11836153001
DPBS	VWR	82020-066
Brilliant Blue R	Acros Organics	A0297990
Sodium Azide	Fisher	AC190380050	Caution, highly toxic
Horseradish peroxidase	Sigma	P8125-5KU
N,N-dimethyl-p-phenylene diamine	Fisher	AC408460250	Caution, highly toxic
phenol	Fisher	AC149340500	Caution, highly toxic
tert-butyl hydroperoxide	Fisher	AC180340050	Caution, highly toxic
n-heptane	Acros Organics	120340010
[header]
Shaker/Incubator	Fisher Scientific	Max Q 6000
Centrifuge	Sorvall	RC 6
Sonicator	QSonica	Misonix 200
Ultrafiltration Tubes	Amicon Ultra	UFC903024
Ni Sepharose High Performance HisTrap column	GE Healthcare Life Sciences	17-5248-01
HiTrap SP Sepharose FF ion exchange column	GE Healthcare Life Sciences	17-5156-01
Plate reader	Molecular Devices	SpectraMax Gemini EM