Sintesi di una proteina artificiale mediata da inteina Hydrogel

Riepilogo

Presentiamo la sintesi di un idrogel split-mediata da inteina proteina. Le componenti di questo idrogel sono due copolimeri proteine ​​contenenti ciascuno una subunità di una proteina trimeric che funge da reticolante e una metà di una inteina scissione. Miscelazione dei due copolimeri proteina innesca una reazione trans-splicing inteina, ottenendo una unità polipeptide che autoassembla in un idrogel. Questo idrogel è altamente pH e temperatura stabile, compatibile con solventi organici, e facilmente incorpora proteine ​​globulari funzionali.

Abstract

Presentiamo la sintesi di una proteina idrogel altamente stabile mediata da uno split-inteina catalizzata reazione proteina trans-splicing. Le componenti di questo idrogel sono due blocchi copolimeri proteine ​​contenenti ciascuno una subunità di una proteina trimeric che funge da reticolante e una metà di una inteina scissione. Una bobina casuale altamente idrofila viene inserito in uno dei blocchi copolimeri per la ritenzione idrica. Miscelazione dei due copolimeri a blocchi proteina innesca una reazione trans-splicing inteina, ottenendo una unità polipeptide con reticolanti alle due estremità che rapidamente auto-assembla in un idrogel. Questo idrogel è molto stabile sia in condizioni acide o basiche, a temperature fino a 50 ° C, e in solventi organici. L'idrogel rapidamente riforme dopo la rottura shear-indotta. Costituzione di una "docking station peptide" in blocco dell'edificio idrogel permette conveniente incorporazione di "aggancio proteina"-tagged proteine ​​bersaglio.L'idrogel è compatibile con mezzi di crescita di coltura tissutale, supporta la diffusione di molecole 20 kDa, e consente l'immobilizzazione di proteine ​​globulari bioattivi. L'applicazione del idrogel proteine ​​mediata da inteina come biocatalizzatore compatibile organico-solvente è stato dimostrato incapsulando l'enzima perossidasi di rafano e corroborare la sua attività.

Introduzione

Gli idrogel interamente in proteine ​​portano il potenziale per far avanzare in modo significativo campi diversi come l'ingegneria dei tessuti, somministrazione di farmaci e biofabrication ^1. Essi offrono vantaggi rispetto ai tradizionali idrogel polimerici sintetici, tra cui biocompatibilità e la possibilità di sostenere in modo non invasivo l'incorporazione di proteine ​​globulari bioattive.

In questo lavoro, si descrive lo sviluppo di una proteina idrogel romanzo formata tramite split-mediata da inteina reazione proteina trans-splicing e la sua applicazione come impalcatura immobilizzazione di proteine ​​(Figura 1). Gli elementi fondamentali per questo idrogel sono due blocchi copolimeri proteine ​​comprendenti ciascuno il frammento N-o C-terminale di una inteina suddivisa (IN e IC) e una subunità di una proteina multimerica reticolante. Il DnaE inteina da Nostoc punctiforme (Npu) è stato utilizzato come inteina suddivisa ^2,3 e una piccola proteina trimeric (12 kDa) Cuta da Pyrococcus horikoshii </ Em> è stato utilizzato come ^4,5 proteina reticolante. Diversi reticolanti sono uniti attraverso inteina reazione catalizzata trans-splicing, che porta alla formazione di una rete di proteine ​​altamente reticolato (idrogel). Npu inteina è stato scelto per le sue cinetica di reazione rapida (t _1/2 = 63 sec) e ad alto rendimento trans-splicing (vicino al 80%) ^2,3. La proteina Cuta stato scelto come reticolante grazie alla sua elevata stabilità. Trimeri Cuta hanno una temperatura di denaturazione di prossimità 150 ° C e mantenere la struttura quaternaria trimeric in soluzioni contenenti fino al 5 M guanidina cloridrato ^4,6. Dal momento che lo scambio tra le diverse subunità crosslinkers è un importante contributo della idrogel fisica superficie di erosione ^7, molto forte interazione tra subunità in Cuta dovrebbe scoraggiare tali scambi subunità, portando ad un idrogel più stabile. Uno di questi blocchi contiene anche un peptide altamente idrofilo S-frammento come mid-block per facilitare acquaritenzione ^8.

Miscelazione dei due blocchi idrogel inizio a una reazione trans-splicing tra IN e IC inteina frammenti, generando una catena polipeptidica più con reticolanti a entrambi i terminali. Reticolanti da più tali unità molecolari interagiscono tra loro, formando una rete idrogel altamente reticolato (Figura 1A). Una specifica "docking station peptide" (DSP) è incorporato in uno dei blocchi di idrogel per facilitare immobilizzazione stabile di un "aggancio proteina" (DP)-tag proteina bersaglio in idrogel. L'uso di una inteina suddivisa per mediare il montaggio idrogel non solo fornisce una maggiore flessibilità per la sintesi proteica idrogel, ma permette anche ad alta densità, il caricamento uniforme della proteina bersaglio nell'intero idrogel, come le proteine ​​target vengono caricati prima della formazione idrogel.

La proteina idrogel mediata da inteina è altamente stazioneBLE in soluzione acquosa con poco a nessuna erosione rilevabile dopo 3 mesi a temperatura ambiente. La stabilità è mantenuto in una vasta gamma di pH (6-10) e temperature (4-50 ° C), e l'idrogel è anche compatibile con solventi organici. Questo idrogel viene utilizzato per l'immobilizzazione di due proteine ​​globulari: la proteina fluorescente verde (GFP) e la perossidasi di rafano (HRP). Idrogel intrappolare quest'ultima proteina viene utilizzato per eseguire biocatalysis in un solvente organico.

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Protocollo

1. Plasmide Costruzioni

NOTA: Tutti i geni sono stati amplificati in reazioni di PCR standard utilizzando Phusion-High Fidelity DNA Polymerase secondo le specifiche del produttore. Primer utilizzati per il clonaggio sono stati descritti in precedenza ^9. Tutti i costrutti sono elencati nella Tabella 1.

1. Per generare Cuta-NpuN (N, Tabella 1):
   1. PCR amplifica Cuta e NpuN geni da plasmidi PET30-Cuta-Tip1 ¹⁰ e kanr-IntRBS-NpuNC-CFN ^11, rispettivamente, utilizzando i primer appropriati.
   2. Digerire questi frammenti con gli appropriati enzimi di restrizione e sequenzialmente inserire questi frammenti nel vettore pET26b tra il promotore T7 e un tag 6xHistidine C-terminale per generare N (Figura 2A).
2. Per generare NpuC-S-Cuta (C, tabella 1):
   1. PCR amplificare NpuC, Cuta e S frammentazionet [AG ₃ (PEG)] ₁₀ dal plasmide kanr-IntRBS-NpuNC-CFN ^11, PET30-Cuta-Tip1 ¹⁰ e pQE9 AC ₁₀ ATRP ^12, rispettivamente, utilizzando i primer appropriati.
   2. Digerire questi frammenti con gli appropriati enzimi di restrizione e sequenzialmente inserire questi frammenti nel vettore pET26b tra promotore T7 e un 6xHistidine C-terminale per generare C (Figura 2B).
3. Per generare NpuC-S-SH3 _lig-Cuta (C-SH3 _lig, Tabella 1):
   1. PCR Amplificazione Cuta utilizzando primer contenenti un _lig SH3 (PPPALPPKRRR) ed un linker flessibile (GGGGS) ₂ per generare frammento SH3 _lig-Cuta.
   2. Sostituire il gene Cuta da C con frammento SH3 _lig-Cuta.
4. Per generare SH3-GFP (Tabella 1):
   1. Amplificare il gene SH3 dal plasmide pJD757 ¹³ utilizzando ilprimer appropriati.
   2. Fondere questo frammento di gene GFP e inserirlo nel vettore pET26b tra il promotore T7 (Figura 2C) e un tag 6xHistidine C-terminale.

2. Protein Expression

1. Trasformare 50 ml di chimicamente competenti di Escherichia coli BL21 (DE3) con il plasmide di espressione appropriato.
2. Dopo la trasformazione, serialmente diluire queste cellule, e piatto su Luria-Bertani (LB) / piastre di agar contenenti 50 ug / ml kanamicina.
3. Incubare le piastre contenenti cellule trasformate a 37 ° C per ~ 15 ore.
4. Dopo l'incubazione, scegliere la piastra contenente 50-100 colonie e risospendere tutte le colonie in 5 ml di brodo LB.
5. Sospensione Trasferimento a 1 L di brodo LB contenente kanamicina (50 mcg / ml) e crescere le cellule a 37 ° C con agitazione a 250 rpm. Monitorare l'assorbanza a 600 nm (OD _600). Far crescere la cultura fino OD ₆₀₀ ~ 0.8.
   1. Per C e C-SH3 _lig, indurre l'espressione della proteina aggiungendo isopropil β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) alla coltura (1 mM concentrazione finale) e incubare la coltura a 37 ° C per 4 ore sotto agitazione a 250 rpm.
   2. Per N e SH3-GFP, raffreddare la cultura a ~ 18 ° C immergendo il pallone di coltura in un bagno di acqua ghiacciata per ~ 5 min. Indurre l'espressione di proteine ​​con l'aggiunta di IPTG alla cultura (concentrazione finale 1 mM) e incubare la coltura a 18 ° C per 14-18 ore agitando a 250 rpm.
6. Dopo l'espressione della proteina, centrifugare la cultura a 6.000 xg per 20 min a 4 ° C per raccogliere il pellet. Pellet cellulare conservare a -80 ° C fino all'utilizzo.

3. Protein Purification

1. Purificazione di N (condizioni denaturanti)
   1. Risospendere pellet cellulari in tampone A (Tabella 2) a 10 ml / g di pellet bagnato.
   2. Immersposta la sospensione pellet in un bagno di ghiaccio-acqua e distruggere le cellule mediante sonicazione (Amp 10, con 1 sec impulso e 6 sec pausa di 1 min).
   3. Centrifugare il lisato a 16.000 xg per 20 min a 4 ° C.
   4. Scartare il surnatante. Risospendere il pellet in Buffer DA (contenente 8 M urea) e centrifugare la sospensione a 16.000 xg per 20 min a 4 ° C.
   5. Passare il surnatante con una colonna di 5 ml di acido Ni-nitrilotriacetico (NTA) precedentemente equilibrata con tampone DA.
   6. Lavare colonna con 30 ml di tampone DA integrato con imidazolo 45 mM. Eluire proteina purificata utilizzando 20 ml di tampone DA integrato con imidazolo 150 mM.
   7. Ridurre la concentrazione di urea nel campione ad <1 mM da uno tra i seguenti metodi indicati in 3.1.7.1 o 3.1.7.2:
      1. Dializzare proteina in tampone DPBS (Tabella 2) a 4 ° C per una notte usando tubi con <20 kDa cutoff.
      2. Centrifugare purificato proteina in un 30 & #160; kDa ultra-filtrazione centrifuga colonna a 2.800 xg, a 4 ° C fino a quando il volume è inferiore a 1 ml. Aggiungere 14 ml tampone DPBS alla colonna di diluire il campione di proteine. Ripetere la centrifugazione / diluizione passaggi da altre tre volte.
   8. Dopo lo scambio di tamponi, aggiungere ditiotreitolo (DTT) per la proteina purificata (finale 2 mM) e concentrato proteico di ~ 100 mg / ml mediante centrifugazione attraverso un ultra-filtrazione centrifuga colonna 30 kDa a 2800 xg, a 4 ° C.
   9. Aliquotare proteica concentrata e conservare a -80 ° C fino all'utilizzo.
2. Purificazione di C e C-SH3 _lig (condizione nativo)
   1. Risospendere pellet cellulari in tampone B (pH 6,0) (Tabella 2) supplementato con 1x cocktail di inibitori delle proteasi a 10 ml / g di pellet bagnato. Utilizzare tampone acido a minimizzare la degradazione proteolitica della proteina bersaglio.
   2. Perturbare sospensione cellulare mediante sonicazione come descritto in 3.1.2. Centrifugare del Lysmangiato a 16.000 xg per 20 min a 4 ° C e conservare il surnatante.
   3. Passare il lisato solubile attraverso una colonna 5 ml Ni-NTA precedentemente equilibrata con tampone B.
   4. Lavare colonna con tampone B supplementato con imidazolo 45 mM, ed eluire la proteina bersaglio in 20 ml di tampone B supplementato con imidazolo 150 mM.
   5. Per la C, passare al punto 3.2.6. Per la C-SH3 _lig, effettuare una purificazione a scambio ionico ulteriore passo per rimuovere proteine ​​parzialmente degradata come indicato nei punti 3.2.5.1 alla 3.2.5.3
      1. Ridurre la concentrazione di NaCl in C-SH3 _lig a <1 mm seguendo la procedura descritta in 3.1.7.
      2. Caricare la proteina bersaglio su un ml scambiatore anionico perline agarosio colonna 5 matrice precedentemente equilibrata con tampone sodio fosfato (50 mM, pH 7,0).
      3. Eluire obiettivo della proteina dalla colonna eseguendo un gradiente da una soluzione contenente 10 mM Tris-HCl pH 8.0 buffer per una soluzione contenente lo stesso tampone supplementato con 1 M NaCl. Prelevare campioni durante proteine ​​eluizione e campioni piscina con la massima purezza basato su sodio dodecil solfato elettroforesi su gel di poliacrilammide (SDS-PAGE).
   6. Buffer scambiare la proteina purificata in tampone DPBS, come descritto in 3.1.7.
   7. Aggiungere DTT alla proteina purificata (concentrazione finale 2 mM) e concentrare la proteina di ~ 100 mg / ml usando un ultra-filtrazione colonnine 30 kDa come descritto in 3.1.8. Aliquotare e conservare concentrate proteine ​​a -80 ° C fino all'utilizzo.
3. Purificazione di SH3-GFP
   1. Pellet cellulari Risospendere con tampone A a 10 ml / g di pellet bagnato.
   2. Disrupt sospensione pellet mediante ultrasuoni come descritto in 3.1.2.
   3. Centrifugare il lisato a 16.000 xg per 20 min a 4 ° C e raccogliere il surnatante.
   4. Passare il surnatante (lisato solubile) attraverso una colonna 5 ml Ni-NTA precedentemente equilibrata conBuffer A.
   5. Lavare colonna con 30 ml di tampone A completato con imidazolo 45 mM. Eluire proteina purificata utilizzando 20 ml di tampone A, completata con imidazolo 150 mM.
   6. Buffer scambiare la proteina purificata nel buffer DPBS utilizzando un approccio simile a quello descritto in 3.1.7 e concentrare la proteina di ~ 150 mg / ml utilizzando un ultra-filtrazione colonnine 30 kDa come descritto in 3.1.8.
   7. Aliquotare e deposito proteico purificato a -80 ° C fino all'utilizzo.
4. SDS-PAGE analisi di campioni purificati contenenti Cuta
   1. Diluire ogni proteina purificata in acqua bidistillata per ridurre la concentrazione di NaCl a ~ 1 mM. A questa concentrazione di NaCl, la maggior parte delle proteine ​​Cuta Trimer gestita come monomeri su gel SDS-PAGE.
   2. Mescolare campioni con tampone campione SDS 2x (0,5 M Tris-HCl, pH 6,8, 20% glicerolo, 10% w / v SDS, 0.1% w / v bromo-fenolo blu, 2% β-mercaptoetanolo), incubato a 95 ° C per 5 min.
   3. Caricare il samcipi su un gel SDS-PAGE 12%. Effettuare elettroforesi ad una tensione costante di 200 V per ~ 50 min.
   4. Osservare proteine ​​in gel mediante colorazione con blu brillante Coomassie R250 seguendo i protocolli standard (Figura 1C).

4. Idrogel Formazione

NOTA: i idrogel campione eseguite in questo studio contengono 1,6 mm di ogni blocco di idrogel salvo diversa indicazione. Questa concentrazione proteica produce un idrogel morbida e stabile. ATTENZIONE: Sodio azide (NaN ₃₎ è aggiunto l'idrogel ad una concentrazione finale di 0,5% w / v per prevenire la contaminazione batterica. NaN ₃ è altamente tossico e deve essere maneggiata con estrema cura, come indicato nella scheda di dati di sicurezza del materiale.

1. Calcolare il volume per ciascuna delle proteine ​​concentrate necessari per ottenere una concentrazione finale di 1,6 mM in un idrogel campione 100 microlitri. Per esempio:
   Concentrazione di N:100 mg / ml
   Peso molecolare di N: 26.3 kDa (vedi Tabella 1)
   Concentrazione 100 microlitri desiderata:: volume desiderato 1,6 mm
   
2. Per effettuare una microlitri idrogel 100 (1,6 mM), mescolare C (x ml, volume calcolato secondo 4.1) con 5% NaN ₃ (10 ml), DTT 100 mM (5 ml) e N (y microlitri, volume calcolato secondo 4.1) in una fiala di vetro da 2 ml.
3. Aggiungi il tampone di DPBS ((85 - x - y) microlitri) per flaconcino per ottenere un volume finale di 100 ml e mescolare manualmente tutti i componenti attraverso un movimento rotatorio con un puntale. Nota: La soluzione diventa molto viscoso con la miscelazione.
4. Centrifugare la miscela per 2 minuti a 8000 xg per rimuovere le bolle d'aria.
5. Incubare la miscela a temperatura ambientetemperatura durante la notte per permettere la reazione inteina trans-splicing per raggiungere il completamento. Confermare la formazione di idrogel girando il tubo a testa in giù. Le proteine ​​non affluiranno se si forma un idrogel.
6. Stima della resa inteina trans-splicing controllando campioni (0,5 microlitri ciascuno) raccolti prima fase 4.2 e 4.5 dopo passo su un gel SDS-PAGE, come descritto in 3.4 (Figura 1C).

5. Immobilizzazione della GFP via Docking Protein (DP) e Docking Station Peptide (DSP) Interazione

1. Per fare un 50 microlitri GFP-funzionalizzato idrogel (1,2 mM), combinare C-SH3 _lig (x microlitri, calcolato secondo 4.1) e SH3-GFP (y microlitri, calcolato secondo 4.1) in rapporto molare 1:1 in 1.7 ml provetta e incubare la miscela a temperatura ambiente per 30 min.
2. Aggiungere 5% NaN ₃ (5 ml), DTT 100 mm (2,5 ml), (42.5 - x - y) DPBS microlitri allo stesso tubo. Aggiungere N (y microlitri, calcolato secondo 4.1) per ottenere un rapporto 1:1 molare di N e C-SH3 _lig. Mescolare il campione utilizzando un puntale da un moto vorticoso.
3. Centrifugare la miscela a 8.000 xg per 2 minuti e incubare la miscela a temperatura ambiente per una notte al buio. Un idrogel incapsulando forme SH3-GFP durante l'incubazione.

6. L'uso di 1.6 Hydrogel mM come impalcatura immobilizzazione per reazione enzimatica in solvente organico

1. Utilizzare l'HRP come modello enzima. Preparare una soluzione stock di HRP (28 mg / ml o 0,63 mm) a DPBS.
2. Per effettuare una microlitri idrogel 30 (1.6 mM) entrapping HRP, unire C (x microlitri, calcolato secondo 4.1) con HRP (2 ml), 5% NaN ₃ (3 ml) e DTT (1,5 ml di 100 mM) all'interno di un 1,7 ml provetta da centrifuga.
3. Aggiungi N (y </ Em> microlitri, calcolato secondo 4.1) e DPBS (23.5 - x - y) microlitri. Mescolare con un puntale con un movimento vorticoso.
4. Centrifugare la miscela a 8.000 xg per 2 minuti e incubare a temperatura ambiente per una notte.
   ATTENZIONE: i reggenti utilizzati per il seguente saggio di attività sono altamente tossici. Utilizzare raccomandazioni di sicurezza specifiche per le corrispondenti Schede Dati di Sicurezza.
5. Per reazione enzimatica, immergere l'idrogel in 1 ml di cocktail di reazione contenenti N, diammina N-dimetil-p-fenilene (5,8 mM), fenolo (5,8 mM) e tert-butil idroperossido (2,9 mM) in n-eptano ^14. Interrompere manualmente il gel utilizzando un puntale per aumentare la superficie di contatto di idrogel e il solvente.
6. Controllo prodotto HRP, un indofenolo tipo dye, misurando l'assorbanza ottica di campioni prelevati in tempi diversi a 546 nm in un lettore di piastre (Figura 5).

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Risultati

Uno schema per mediata da inteina formazione proteica idrogel è presentato nella Figura 1A. Gli elementi costitutivi del idrogel sono la proteina copolimeri Cuta-NpuN (N) e NpuC-S-Cuta (C) (Figura 1A, Tabella 1). NpuN / C sono i N-/C-fragments del DnaE naturalmente inteina suddivisa da Nostoc punctiforme (Npu). Cuta è una proteina trimeric stabile da Pyrococcus horikoshii ^4,5. Miscelazione di purificato N e C in presenza dell'agente riducente DTT induce la form...

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Discussione

In questo lavoro, abbiamo dimostrato la sintesi di un altamente stabile mediata da inteina idrogel proteina. L'uso di una scissione consente inteina l'idrogel essere condizionale formata in risposta alla miscelazione dei due componenti in fase liquida. In particolare, la scissione collega inteina covalentemente due blocchi in fase liquida tramite una reazione di trans-splicing, producendo una unità polipeptide fiancheggiato da reticolazione unità che a sua volta sé ​​assembla in un idrogel. La fo...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Phusion High Fidelity DNA polymerase	New England BioLabs	M0530S
Competent Escherichia coli BL21 (DE3)	New England BioLabs	C2527I
Luria Bertani	VWR	90003-350
Bacto Agar Media	VWR
Kanamycin sulfate	VWR
IPTG	VWR	EM-5820
Imidazole	VWR	EM-5720
Urea	VWR	EM-9510
Dithiothreitol (DTT)	Fisher	BP172-5
Protease Inhibitor cocktail	Roche Applied Science	11836153001
DPBS	VWR	82020-066
Brilliant Blue R	Acros Organics	A0297990
Sodium Azide	Fisher	AC190380050	Caution, highly toxic
Horseradish peroxidase	Sigma	P8125-5KU
N,N-dimethyl-p-phenylene diamine	Fisher	AC408460250	Caution, highly toxic
phenol	Fisher	AC149340500	Caution, highly toxic
tert-butyl hydroperoxide	Fisher	AC180340050	Caution, highly toxic
n-heptane	Acros Organics	120340010
[header]
Shaker/Incubator	Fisher Scientific	Max Q 6000
Centrifuge	Sorvall	RC 6
Sonicator	QSonica	Misonix 200
Ultrafiltration Tubes	Amicon Ultra	UFC903024
Ni Sepharose High Performance HisTrap column	GE Healthcare Life Sciences	17-5248-01
HiTrap SP Sepharose FF ion exchange column	GE Healthcare Life Sciences	17-5156-01
Plate reader	Molecular Devices	SpectraMax Gemini EM