테인 매개 인공 단백질 히드로 겔의 합성

요약

우리는 분할 테인 - 매개 단백질 겔의 합성을 제시한다. 이러한 하이드로 겔의 빌딩 블록은 각각 분할 테인의 가교제 및 ​​반 역할 삼량 단백질의 서브 유닛을 포함하는 단백질이 공중 합체이다. 두 단백질 공중 합체의 혼합은 하이드로 겔로 자기 조립 폴리펩티드 단위를 산출 테인 트랜스 - 스 플라이 싱 반응을 트리거합니다. 하이드로 겔은 높은 산도와 온도 안정, 유기 솔벤트와 함께, 쉽게 기능을 구형 단백질을 포함하고 있습니다.

초록

우리는 분할 테인-촉매 단백질 트랜스 - 스 플라이 싱 반응에 의해 매개되는 매우 안정한 단백질 겔의 합성을 제시한다. 이러한 하이드로 겔의 빌딩 블록은 각각 분할 테인의 가교제 및 ​​반 역할 삼량 단백질의 서브 유닛을 포함하는 단백질이 블록 공중 합체이다. 친수성이 높은 임의의 코일은 물 보존을위한 블록 공중 합체 중 하나에 삽입된다. 두 단백질의 블록 공중 합체의 혼합은 한쪽 끝에서 가교제와 폴리 펩타이드 단위를 산출 테인 트랜스 - 스 플라이 싱 반응을 유발하는 하이드로 겔에 신속하게 자기 조립. 하이드로 겔은 50 ° C까지, 및 유기 용매에 온도에서 모두 산성과 염기성 조건에서 매우 안정적입니다. 전단에 의한 파열 후 하이드로 겔은 빠른 속도로 개혁. 하이드로 겔 빌딩 블록에 "도킹 스테이션 펩티드"의 설립은 "도킹 단백질"- 태그 표적 단백질을 편리하게 결합 할 수 있습니다.히드로 겔은 조직 배양 성장 배지와 호환되는 20 kDa의 분자 확산을 지원하고, 생리 활성 단백질의 구형 고정화를 가능하게한다. 유기 용제 대응의 생체 촉매로서 테인 - 매개 단백질 겔의 적용은 고추 냉이 퍼 옥시 다제 효소를 캡슐화하고 그 활성을 확증에 의해 입증되었다.

서문

단백질 완전히 만든 하이드로 겔은 크게 조직 공학, 약물 전달 및 biofabrication ¹ 등 다양한 분야를 발전 할 수있는 잠재력을 가지고 다니십시오. 그들은 생체 적합성 및 비 침습적 생체 활성 구형 단백질의 결합을 지원하는 가능성을 포함하여 기존의 합성 고분자 하이드로 젤에 이점을 제공합니다.

이 작품에서 우리는 단백질 고정화 발판으로 분할 테인 매개 단백질 트랜스 - 스 플라이 싱 반응과 그 응용 (그림 1)를 통해 형성되는 새로운 단백질 하이드로 겔의 개발을 설명합니다. 이러한 하이드로 겔을위한 빌딩 블록은 각각 (IN 및 IC)를 테인 분할 및 가교제 다중 체 단백질의 서브 유닛의 N-또는 C-말단 단편을 포함 두 단백질 블록 공중 합체이다. 테인 Nostoc의 punctiforme (NPU)에서 DnaE ^2,3 테인 분할 및 작은 삼량 단백질 피로 코커스 (12 kDa의) CUTA 리코 쉬이 <로 사용되었다/ EM은> 가교제 단백질 ^4,5로서 사용 하였다. 다른 가교 결합제는 고도로 가교 결합 된 단백질 네트워크 (하이드로 겔)의 형성으로 이어지는 테인 촉매 된 트랜스 - 스 플라이 싱 반응을 통해 결합된다. NPU의 테인이 때문에 빠른 반응 속도 (t _{1 / 2} = 63 초)과 높은 트랜스 - 스 플라이 싱 수익률 (에 가까운 80 ^{%), 3의} 선택되었다. CUTA 단백질은 높은 안정성으로 인해 가교제로 선정되었습니다. CUTA 트리머 근처 150 ° C의 변성 온도를 가지고 많은 M 5로 구아니딘 염산염 ^4,6를 포함하는 솔루션 삼량 차 구조를 유지합니다. 다른 가교제 사이의 서브 유닛 교환이 물리적 하이드로 겔 표면 침식 ^7의 주요 원인이기 때문에, CUTA에서 매우 강한 서브 유닛 간 상호 작용은보다 안정적인 하이드로 겔로 이어지는, 그런 서브 유닛 교환을 억제해야한다. 이러한 빌딩 블록 중 하나는 물을 용이하게하기 위해 중간 블록으로 친수성이 높은 펩티드 S-단편을 포함보존 ^8.

하이드로 겔이 빌딩 블록의 혼합 양 말단에 가교제와 더 긴 폴리펩티드 사슬을 생성 단편 테인 IN과 IC 사이의 트랜스 - 스 플라이 싱 반응을 개시한다. 여러 그러한 분자 단위에서 가교제는 고도로 가교 하이드로 겔 네트워크 (도 1a)을 형성하는, 서로 상호 작용. 구체적인 "도킹 스테이션 펩티드"(DSP)는 "도킹 단백질"(DP) - 태그 된 하이드로 겔로 표적 단백질을 안정적으로 고정화를 용이하게 하이드로 겔 빌딩 블록 중 하나에 포함된다. 하이드로 겔 어셈블리를 중재하는 테인 분할의 사용은 표적 단백질이 종래의 하이드로 겔 형성에 로딩 될 때, 단백질의 겔 합성에 추가적인 유연성을 제공하지만, 또한 전체 하이드로 걸쳐 표적 단백질의 고밀도, 균일 한 하중을 가능 아닙니다.

테인 매개 단백질 하이드로 겔이 높은 역입니다과 수용액에 적합한 용 작은 - 투 - 더 실온에서 3 개월 만에 검출 침식. 안정성은 pH 값 (6-10)과 온도 (4-50 ℃)의 넓은 범위에서 유지하고, 하이드로 겔은 유기 용매와 호환된다. 녹색 형광 단백질 (GFP)와 고추 냉이 퍼 옥시 다제 (HRP)이 하이드로 겔은 두 개의 공 모양 단백질의 고정화에 사용됩니다. 후자 단백질을 포획 하이드로 겔은, 유기 용매 중에서 생물 촉매를 수행하는데 사용된다.

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프로토콜

1. 플라스미드 건설

참고 : 모든 유전자가 제조업체의 사양에 따라 Phusion 하이 피델리티 DNA 중합 효소를 사용하여 표준 PCR 반응에서 증폭되었다. 클로닝을 위해 사용 된 프라이머는 앞서 설명되었다 ^(9). 모든 구조는 표 1에 나타내었다.

1. CUTA-NpuN (N, 표 1)를 생성하려면 :
   1. PCR은 적절한 프라이머를 사용하여, 각각 플라스미드 pET30-CUTA-TIP1 ¹⁰ KanR-IntRBS-NpuNC ^{CFN-11에서와} CUTA NpuN 유전자를 증폭한다.
   2. 적절한 제한 효소로이 조각을 소화하고 순차적으로 T7 프로모터와 N (그림 2A)를 생성 할 수있는 C-말단 6xHistidine 태그 사이의 pET26b 벡터에이 조각을 삽입합니다.
2. NpuC-S-CUTA (C, 표 1)를 생성하려면 :
   1. PCR 증폭 NpuC, CUTA 및 S fragmen적절한 프라이머를 사용하여 플라스미드 KanR-IntRBS-NpuNC - CFN ¹¹ pET30-CUTA-TIP1 ¹⁰ pQE9 AC ₁₀ 각각 ATRP ¹² 일부터 T [AG ₃ (PEG)] _10.
   2. 적절한 제한 효소로이 조각을 소화하고 순차적으로 T7 프로모터와 C (그림 2B)를 생성 할 수있는 C-말단 6xHistidine의 pET26b 벡터에이 조각을 삽입합니다.
3. : NpuC-S-SH3 _LIG-CUTA (C-SH3 _{LIG 손해,} 표 1)를 생성하려면
   1. PCR 증폭 CUTA SH3 _{LIG 손해} (PPPALPPKRRR) 및 조각 SH3 _LIG-CUTA을 생성하는 유연한 링커 (GGGGS) _2를 포함하는 프라이머를 사용하여.
   2. 조각 SH3 _LIG-CUTA와 C에서 CUTA 유전자를 교체합니다.
4. SH3-GFP (표 1)를 생성하려면 :
   1. 사용하여 플라스미드 pJD757 ^13에서 SH3 유전자를 증폭적합한 프라이머.
   2. GFP 유전자에이 조각을 융합하고 T7 프로모터 (그림 2C)과 C-말단 6xHistidine 태그 사이의 pET26b 벡터에 삽입합니다.

2. 단백질 발현

1. 적절한 발현 플라스미드와 화학적 유능한 대장균 BL21 (DE3)의 50 μL를 변형.
2. 변환 후, 순차적으로 이들 세포를 희석하고, 루리아 - 베르 타니 (LB)에 그들을 접시 / 50 ㎍ / ㎖의 카나마이신을 포함하는 한천 플레이트.
3. ~ 15 시간 동안 37 ° C에서 형질 전환 된 세포를 포함하는 번호판을 품어.
4. 배양 후, 50 ~ 100 식민지를 포함하는 판을 선택하고 LB의 국물 5 ㎖의 모든 식민지를 재현 탁.
5. 전송 1 L LB의 국물 포함 카나마이신 (50 ㎍ / ㎖)에 서스펜션과 250 rpm에서 진탕 37 ° C에서 세포를 성장. 600 nm의 (OD _600)에서 흡광도를 모니터링합니다. OD ₆₀₀ ~ 0.8까지의 문화를 성장.
   1. C 및 C-SH3 _{LIG 손해 보험의} 경우, 문화 (1 mM의 최종 농도)에 이소 프로필 β-D-1-티오 갈 락토 피 라노 시드 (IPTG)를 첨가하여 단백질 발현을 유도하고 250 rpm에서 진탕하면서 4 시간 동안 37 ° C에서 문화를 품어.
   2. N 및 SH3-GFP를 들어, 문화를 냉각 ~ ~ 5 분 동안 얼음 수조에서 배양 플라스크를 침지하여 18 ° C에서. 문화 (1mM의 최종 농도)에 IPTG를 첨가하여 단​​백질 발현을 유도하고 250 rpm에서 진탕하면서 14 ~ 18 시간 동안 18 ° C에서 문화를 배양한다.
6. 단백질 발현 후, 펠렛을 수집하기 위해 4 ° C에서 20 분 동안 6,000 XG에 문화를 원심 분리기. -80 ° C까지 사용에 보관 세포 펠렛.

3. 단백질 정제

1. N의 정제 (변성 조건)
   1. 10 젖은 펠렛 ㎖ / g에서 버퍼 A (표 2)에 재현 탁 세포 펠렛.
   2. Immers빙수 욕에서 펠릿 서스펜션 및 전자 (1 초 펄스 및 1 분 10 초의 일시 정지와 앰프 10) 초음파 처리에 의해 세포를 방해.
   3. 4 ℃에서 20 분 동안 16,000 XG에서 해물을 원심 분리기
   4. 상층 액을 버린다. (8 M 요소를 포함하는) 버퍼 DA의 펠렛을 재현 탁하고 4 ℃에서 20 분 동안 16,000 XG에서 현탁액을 원심 분리
   5. 이전에 버퍼 DA와 평형을 5 ㎖ 니켈 니트릴 로트리 아세트산 (NTA) 칼럼을 통해 뜨는을 전달합니다.
   6. 45 mM의 이미 다졸 보충 버퍼 DA 30 ㎖로 컬럼을 씻으십시오. 150 mM의 이미 다졸과 보충 버퍼 DA 20 ㎖를 사용하여 정제 된 단백질을 용출.
   7. 3.1.7.1 또는 3.1.7.2에 주어진 다음 방법 중 하나가 <1 mm로 단백질 샘플의 요소 농도를 감소 :
      1. <20 kDa의 차단과 함께 튜브를 사용하여 4 ° C에서 하룻밤에 DPBS 버퍼 (표 2)에서 단백질을 Dialyze.
      2. 원심 분리기는 30 & # 단백질을 정제160, 2,800 XG에 kDa의 초 여과 스핀 열, 4 ° C 볼륨까지보다 1 ㎖이다. 단백질 시료를 희석하기 위해 열을 14 ML의 DPBS 버퍼를 추가합니다. 원심 분리 / 희석 세 번 단계를 반복합니다.
   8. 버퍼 교환 한 후, 정제 된 단백질 (최종 2 ㎜)에 디티 오 트레이 톨 (DTT)를 추가하고 2,800 XG에 30 kDa의 초 여과 스핀 열, 4 ° C.를 원심 분리하여 ~ 100 ㎎ / ㎖로 단백질을 집중
   9. 사용할 때까지 -80 ° C에서 농축 된 단백질과 상점을 나누어지는.
2. C 및 C-SH3 _LIG의 정화 (기본 조건)
   1. 버퍼 B (10) 습식 펠렛 ㎖ / g에서 1X 프로테아제 억제제 칵테일 보충 (산도 6.0) (표 2)에 재현 탁 세포 펠렛. 표적 단백질의 단백질 가수 분해를 최소화하기 위해 산성 완충액을 사용한다.
   2. 3.1.2에 설명 된대로 초음파 처리하여 세포 현탁액을 방해. 리스를 원심 분리기4 ° C에서 20 분 동안 16,000 XG에서 먹고 뜨는을 유지합니다.
   3. 이전에 버퍼 B.와 평형을 5 ㎖의 니켈 - NTA 칼럼을 통해 가용성 해물 합격
   4. 버퍼 B와 세척 컬럼 45 mM의 이미 다졸로 보충하고, 150 mM의 이미 다졸 완충액 B로 보충 된 20 ml의 표적 단백질을 용출.
   5. C의 경우, 3.2.6 단계로 이동합니다. C-SH3의 _LIG 들어 단계에 따른다 부분적 분해 단백질을 제거하기 위해 추가로 이온 교환 정제 단계 3.2.5.3에 3.2.5.1을 수행
      1. 3.1.7에 설명 된 절차에 따라 <1 mm로 C-SH3 _{LIG 손해에} 염화나트륨의 농도를 줄일 수 있습니다.
      2. 이전 인산 나트륨 완충액 (50 mM의, 산도 7.0)으로 평형을 5 ㎖의 이온 교환 구슬로 장식 된 아가 로스 매트릭스 칼럼에 목적 단백질을로드합니다.
      3. 10 mM 트리스 - 염산 pH를 8.0 buffe 함유 용액으로부터 구배를 실행하여 칼럼으로부터 용출 표적 단백질1 M NaCl로 보충 된 동일한 완충액을 함유하는 용액에 R. 도데 실 황산나트륨 폴리 아크릴 아미드 겔 전기 영동 (SDS-PAGE)에 기초하여 높은 순도의 단백질 용출 및 풀 샘플 중에 샘플을 채취.
   6. 3.1.7에 설명 된대로, DPBS 버퍼로 정제 된 단백질을 교환 버퍼입니다.
   7. 정제 된 단백질 (최종 농도 2 ㎜)에 DTT를 추가하고 3.1.8에 설명 된대로 ~ 100 ㎎ / ㎖ 30 kDa의 초 여과 스핀 컬럼을 사용하여 단백질을 집중한다. 나누어지는 및 저장은 -80 ° C까지 사용에서 단백질을 집중했다.
3. SH3-GFP의 정화
   1. 10 젖은 펠렛 ㎖ / g에서 버퍼를 사용을 Resuspend 세포 펠렛.
   2. 3.1.2에 설명 된 초음파에 의해 펠릿 현탁액을 방해.
   3. 4 ° C에서 20 분 동안 16,000 XG에서 해물을 원심 분리기 및 뜨는을 수집합니다.
   4. 이전에 평형을 5 ㎖의 니켈 - NTA 칼럼을 통해 상층 액 (수용성 해물을) 통과버퍼 A.
   5. 버퍼 30 ㎖로 컬럼을 씻어 45 mM의 이미 다졸 보충. 버퍼 20 ㎖의 150 mM의 이미 다졸을 사용하여 보충 된 정제 된 단백질을 용출.
   6. 버퍼 3.1.7에 기술 된 것과 유사한 방법을 사용 DPBS 완충액에 정제 된 단백질을 교환하고 단백질을 농축 ~ 150 ㎎ / 3.1.8에서 설명한 바와 같이 30 kDa의 울트라 여과 스핀 컬럼을 사용하여 ML.
   7. 나누어지는 및 저장은 -80 ° C까지 사용에서 단백질을 정제.
4. CUTA을 함유하는 정제 된 샘플의 SDS-PAGE 분석
   1. 염화나트륨 ~ 1 mm까지의 농도를 줄이기 위해 두 번 증류수에 각각의 정제 된 단백질을 희석. 이 염화나트륨 농도에서 CUTA 량체 단백질의 대부분은 SDS-PAGE 겔에 단량체로서 실행.
   2. 2X SDS 샘플 버퍼 (0.5 M 트리스 - 염산, 산도 6.8, 글리세롤, 10 % w SDS V / 0.1 % V의 브로 모 페놀 블루, 2 %의 β-머 캅토 에탄올 승 / 20 %), 95 ° C에서 배양과 샘플을 혼합 5 분.
   3. 샘에게로드PLES 12 % SDS-PAGE 젤 상. 50 분 ~ 200 V의 일정한 전압에서 전기 영동을 수행하십시오.
   4. 표준 프로토콜 (그림 1C) 다음 쿠마 화려한 푸른 R250로 염색하여 젤의 단백질을 관찰한다.

4. 하이드로 겔 형성

참고 : 별도로 언급하지 않는 한이 연구에서 만든 샘플 하이드로 겔 각 하이드로 겔 빌딩 블록 1.6 밀리미터가 포함되어 있습니다. 이 단백질의 농도는 부드럽고 안정된 겔을 얻을 수 있습니다. 주의 : 아 지드 화 나트륨 (NaN이 ₃₎ 박테리아 오염을 방지하기 위해 V / w 0.5 %의 최종 농도로 하이드로 겔에 첨가된다. NaN의 _3은 매우 독성 및 물질 안전 보건 자료 (MSDS)에 표시된 극단주의하여 취급해야합니다.

1. 100 μL 샘플 하이드로 겔에서 1.6 ㎜의 최종 농도를 달성하기 위해 필요한 농축 단백질의 각각의 볼륨을 산출한다. 예를 들면 :
   N의 농도 :100 ㎎ / ㎖
   N의 분자량 26.3 kDa의 (표 1 참조)
   원하는 양 : 100 ㎕를 원하는 농도 : 1.6 mM의
   
2. 100 ㎕의 히드로 겔 (1.6 mm)를 만들려면 C를 혼합 (X μL, 볼륨 4.1에 따라 계산) 5 % NaN의 ₃ (10 μL)로, 100 mM의 DTT (5 μL)와 N (Y μL, 양에 따라 계산 4.1) 2 ㎖ 유리 병 내부.
3. 100 μL의 최종 볼륨을 달성하기 위해 유리 병에 (Y) μL - X - (85), 수동 피펫 팁을 사용하여 소용돌이 치는 움직임을 통해 모든 구성 요소를 혼합 DPBS 버퍼를 추가합니다. 참고 :이 솔루션은 혼합시 점성이됩니다.
4. 기포를 제거하기 위해 8,000 XG에서 2 분 동안 상기 혼합물을 원심 분리기.
5. 방에서 혼합물을 품어테인 트랜스 - 스 플라이 싱 반응이 완성에 도달 할 수 있도록 밤새 온도. 거꾸로 튜브를 돌려 하이드로 겔 형성을 확인합니다. 하이드로 겔이 형성되는 경우에 단백질은 흐르지 않는다.
6. 3.4 (그림 1C)에 설명 된대로, 4.2 단계 전에 SDS-PAGE 젤에 4.5 단계 이후에 수집 된 시료 (0.5 ㎕의 각)을 확인하여 테인 트랜스 - 스 플라이 싱의 수익률을 예상하고있다.

5. 도킹 단백질 (DP)와 도킹 스테이션을 통한 GFP의 고정 펩타이드 (DSP)의 상호 작용

1. 50 μL의 GFP 기능화 된 하이드로 겔 (1.2 mm)를 만들기 위해 1.7 1:1 몰비 (4.1에 따라 계산, X μL) C-SH3 _{LIG 손해를} 결합 SH3-GFP (Y μL, 4.1에 따라 계산) 밀리리터 microcentrifuge 관 및 실온에서 30 분 동안 혼합물을 배양한다.
2. X - - ​​<5 % NaN의 ₃ (5 μL), 100 mM의 DTT (2.5 μL), (42.5 추가같은 관에 EM> Y) μL의 DPBS. N 및 C-SH3 _LIG의 1:1 몰비를 달성하기 위해 N (Y μL, 4.1에 따라 계산)을 추가한다. 소용돌이 운동에 의해 피펫 팁을 사용하여 샘​​플을 섞는다.
3. 2 분 동안 8,000 XG에서 상기 혼합물을 원심 분리에 어두운 혼합물을 실온에서 밤새 배양한다. 배양 중에 SH3-GFP 양식을 캡슐화하는 하이드로 겔.

6. 유기 용매에서 효소 반응에 대한 고정화 발판 1.6 mM의 히드로 겔의 사용

1. 모델 효소로 HRP를 사용합니다. DPBS에 HRP (28 ㎎ / ㎖ 또는 0.63 ㎜)의 주식 솔루션을 준비합니다.
2. HRP 포획 30 ㎕의 히드로 겔 (1.6 mm)를 만들려면 C 내부 HRP (2 μL), 5 % NaN의 ₃ (3 μL) 및 DTT (100 mm의 1.5 μL)과 (X μL, 4.1에 따라 계산) 겸용 1.7 ML의 원심 분리기 튜브.
3. N (Y 추가 </ EM> 4.1에 따라 계산 μL) 및 DPBS (23.5 - X - Y) μL. 소용돌이 모션 피펫 팁과 섞는다.
4. 2 분 동안 8,000 XG에서 혼합물을 원심 분리하고, 실온에서 밤새 배양한다.
   주의 : 다음 활동 분석에 사용되는 섭정은 매우 독성이 있습니다. 해당 물질 안전 보건 자료 (MSDS)에 의해 특정 안전 권고를 사용합니다.
5. 효소 반응을 위해, n-헵탄 ^(14)의 N, N-디메틸-p-페닐 렌 디아민 (5.8 ㎜), 페놀 (5.8 ㎜) 및 tert-부틸 하이드 로퍼 옥사이드 (2.9 mm)를 함유하는 반응 칵테일 1 ㎖의 하이드로 겔을 물속. 수동 하이드로 겔과 용매의 접촉 면적을 증가시키기 위해 피펫 팁을 사용하여 겔을 방해.
6. 플레이트 리더 (그림 5)에서 546 nm에서 다른 시간에 촬영 한 샘플의 흡광도를 측정하여, HRP 제품, 인도 페놀 형 염료를 감지합니다.

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결과

테인 매개 단백질 하이드로 겔 형성을위한 회로도는 그림 1A에 제시되어있다. 하이드로 겔의 빌딩 블록은 단백질 CUTA NpuN-(N) 및-S-NpuC CUTA (C) (도 1a, 표 1)를 공중합. NpuN / C는 Nostoc의 punctiforme (NPU)에서 테인 자연스럽게 분할 DnaE의 N-/C-fragments 있습니다. CUTA는 피로 코커스 호 리코 쉬이 ^4,5에서 안정적인 삼량 단백질이다. (도 1A 및 1C) : ?...

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토론

이 작품에서 우리는 매우 안정적인 테인 매개 단백질 하이드로 겔의 합성을 보여 주었다. 분할의 사용은 테인 조건부이 액상 성분의 혼합에 대응하여 형성되는 히드로 겔을 가능하게한다. 구체적으로는, 분할 테인 공유 차례로 자기 하이드로 겔로 조립하는 것이 단위 가교 어귀 폴리펩티드 유닛을 수득 트랜스 - 스 플라이 싱 반응을 통해이 액상 빌딩 블록을 연결한다. 하이드로 겔의 혼합?...

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자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Phusion High Fidelity DNA polymerase	New England BioLabs	M0530S
Competent Escherichia coli BL21 (DE3)	New England BioLabs	C2527I
Luria Bertani	VWR	90003-350
Bacto Agar Media	VWR
Kanamycin sulfate	VWR
IPTG	VWR	EM-5820
Imidazole	VWR	EM-5720
Urea	VWR	EM-9510
Dithiothreitol (DTT)	Fisher	BP172-5
Protease Inhibitor cocktail	Roche Applied Science	11836153001
DPBS	VWR	82020-066
Brilliant Blue R	Acros Organics	A0297990
Sodium Azide	Fisher	AC190380050	Caution, highly toxic
Horseradish peroxidase	Sigma	P8125-5KU
N,N-dimethyl-p-phenylene diamine	Fisher	AC408460250	Caution, highly toxic
phenol	Fisher	AC149340500	Caution, highly toxic
tert-butyl hydroperoxide	Fisher	AC180340050	Caution, highly toxic
n-heptane	Acros Organics	120340010
[header]
Shaker/Incubator	Fisher Scientific	Max Q 6000
Centrifuge	Sorvall	RC 6
Sonicator	QSonica	Misonix 200
Ultrafiltration Tubes	Amicon Ultra	UFC903024
Ni Sepharose High Performance HisTrap column	GE Healthcare Life Sciences	17-5248-01
HiTrap SP Sepharose FF ion exchange column	GE Healthcare Life Sciences	17-5156-01
Plate reader	Molecular Devices	SpectraMax Gemini EM