JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

אנו מציגים את הסינתזה של הידרוג'ל-תיווך intein פיצול חלבון. אבני הבניין של הידרוג'ל הזה הוא שני קופולימרים חלבון המכילים כל מקטע של חלבון trimeric המשמש כcrosslinker וחצי אחד של intein מפוצלת. ערבוב של שני קופולימרים החלבון מעורר תגובת טרנס שחבור intein, מניב יחידת פוליפפטיד שעצמי מרכיבה לתוך הידרוג'ל. הידרוג'ל זו משלבת חלבונים כדוריים מאוד פונקציונליים pH והטמפרטורה יציבה, תואם עם ממסים אורגניים, ובקלות.

Abstract

אנו מציגים את הסינתזה של חלבון הידרוג'ל מאוד יציב בתיווך תגובת טרנס שחבור-זרז intein פיצול חלבון. אבני הבניין של הידרוג'ל זה שני בלוק קופולימרים חלבון המכילים כל מקטע של חלבון trimeric המשמש כcrosslinker וחצי אחד של intein מפוצלת. סליל אקראי הידרופילי מאוד מוכנס לתוך אחד מבלוק קופולימרים להחזקת מים. ערבוב של שני קופולימרים לחסום חלבון מעורר תגובת טרנס שחבור intein, מניב יחידת פוליפפטיד עם crosslinkers בכל צד שמהירות עצמי מרכיב להידרוג'ל. הידרוג'ל זה מאוד יציב תחת שני תנאים חומציים ובסיסיים, בטמפרטורות של עד 50 מעלות צלזיוס, ובממסים אורגניים. הידרוג'ל במהירות רפורמות לאחר קרע מושרה גזירה. התאגדות של "פפטיד תחנת עגינה" לאבן בניין הידרוג'ל מאפשרת שילוב נוח של "חלבון עגינה" מתויג חלבוני יעד.הידרוג'ל תואם תקשורת צמיחה בתרבית רקמה, תומך בדיפוזיה של מולקולות 20 kDa, ומאפשר הקיבוע של חלבונים כדוריים ביו. היישום של הידרוג'ל חלבון intein בתיווך כbiocatalyst אורגני ממס תואם הודגם על ידי המתמצת את אנזים peroxidase חזרת והאימות את פעילותה.

Introduction

הידרוג עשוי כולו מחלבונים לשאת הפוטנציאל לקדם באופן משמעותי תחומים מגוונים כמו הנדסת רקמות, אספקת הסמים וbiofabrication 1. הם מציעים יתרונות על פני הידרוג פולימר סינטטי מסורתי כולל התאמה ביולוגית ואת הפוטנציאל לתמוך שילוב של חלבונים כדוריים ביו noninvasively.

בעבודה זו, אנו מתארים את הפיתוח של הידרוג'ל חלבון חדש שנוצר באמצעות תגובה-תיווך intein פיצול חלבון טרנס שחבור ויישומה כפיגום קיבוע חלבון (איור 1). אבני הבניין להידרוג'ל זה שני בלוק קופולימרים חלבון בכל המרכיבים את שבר N-או C-המסוף של פיצול intein (IN וIC) ומקטע של חלבון crosslinker Multimeric. DnaE intein מpunctiforme Nostoc (NPU) שימש כפיצול intein 2,3 וחלבון קטן trimeric (12 KDA) CutA מPyrococcus horikoshii </ Em> שימש כ4,5 חלבון crosslinker. הם הצטרפו crosslinkers שונה באמצעות תגובת טרנס שחבור זרז intein, מה שמוביל להיווצרות של רשת crosslinked מאוד חלבון (הידרוג'ל). intein NPU נבחרה בגלל קינטיקה שלה תגובה מהירה (t 1/2 = 63 שניות) ותשואה גבוהה טרנס שחבור (קרוב ל80%) 2,3. חלבון CutA נבחר כcrosslinker בשל היציבות הגבוהה שלה. יש לי trimers CutA טמפרטורת denaturation של ליד 150 ° C ולשמור על מבנה של הרביעון trimeric בפתרונות המכילים ככל 5 M hydrochloride guanidine 4,6. מאז החלפת מקטע בין crosslinkers השונים היא תורם עיקרי לשחיקת משטח הידרוג'ל הפיזי 7, האינטראקציה מקטע היתר חזקה מאוד בCutA צריכה להרתיע חילופי מקטע כזה, מה שמוביל להידרוג'ל יציב יותר. אחת מאבני הבניין הללו מכיל גם פפטיד S-בר הידרופילי מאוד כפי שאמצע הבלוק כדי להקל על מיםשמירה 8.

ערבוב של שני אבני בניין הידרוג'ל יוזם תגובת טרנס שחבור בין IN וIC intein ברים, יצירת שרשרת פוליפפטיד כבר עם crosslinkers בשני המסופים. Crosslinkers מיחידות מולקולריות כגון מרובות לתקשר אחד עם השני, ויוצר רשת crosslinked מאוד הידרוג'ל (איור 1 א). "פפטיד עגינה תחנה" ספציפי (DSP) הוא שולב אחד מאבני בניין הידרוג'ל כדי להקל על קיבוע יציב של "חלבון עגינה" (DP), מתויג חלבון המטרה להידרוג'ל. השימוש בפיצול intein לתווך ההרכבה הידרוג'ל לא רק מספק גמישות נוספת לסינתזת הידרוג'ל החלבון, אלא גם מאפשר צפיפות גבוהה, טעינה אחידה של חלבון המטרה לאורך כל הידרוג'ל, כמו חלבוני היעד נטענים לפני היווצרות הידרוג'ל.

הידרוג'ל החלבון בתיווך intein הוא STA מאודble בתמיסה מימית עם מעט לשחיקה לא לגילוי לאחר 3 חודשים בטמפרטורת חדר. יציבות נשמרת במגוון רחב של PHS (6-10) וטמפרטורות (4-50 מעלות צלזיוס), והידרוג'ל הוא גם תואם עם ממסים אורגניים. הידרוג'ל זה משמש לקיבוע של שני חלבונים כדוריים: החלבון פלואורסצנטי הירוק (GFP) והחזרה peroxidase (HRP). הידרוג'ל הכולא החלבון האחרון משמש לבצע biocatalysis בממס אורגני.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

1. בניית פלסמיד

הערה: כל הגנים היו מוגבר בתגובות סטנדרטיות PCR באמצעות Phusion גבוהים פידליטי DNA פולימראז לפי המפרטים של היצרן. פריימרים המשמשים לשיבוט תוארו בעבר 9. כל המבנים מפורטים בטבלה 1.

  1. כדי ליצור CutA-NpuN (N, טבלת 1):
    1. PCR להגביר גנים CutA וNpuN מפלסמידים pET30-CutA-Tip1 10 ו11 KanR-IntRBS-NpuNC-CFN, בהתאמה, תוך שימוש בפריימרים המתאימים.
    2. לעכל שברים אלה עם אנזימי ההגבלה המתאימים ורצף להוסיף שברים אלה לתוך וקטור pET26b בין אמרגן T7 ותג 6xHistidine טרמינל C-לייצר N (איור 2 א).
  2. כדי ליצור NpuC-S-CutA (C, טבלת 1):
    1. fragmen PCR להגביר NpuC, CutA ו-St [AG 3 (PEG)] 10 מפלסמיד 11 KanR-IntRBS-NpuNC-CFN, pET30-CutA-Tip1 10 וpQE9 AC 10 12 Atrp, בהתאמה, תוך שימוש בפריימרים המתאימים.
    2. לעכל שברים אלה עם אנזימי ההגבלה המתאימים ורצף להוסיף שברים אלה לתוך וקטור pET26b בין אמרגן T7 ו6xHistidine טרמינל C-ליצור C (איור 2).
  3. כדי ליצור NpuC-S-SH3 lig-CutA (lig C-SH3, טבלת 1):
    1. PCR להגביר CutA באמצעות פריימרים המכילים lig SH3 (PPPALPPKRRR) ומקשר גמיש (GGGGS) 2 כדי ליצור שבר SH3 lig-CutA.
    2. להחליף את גן CutA מC עם SH3 הבר lig-CutA.
  4. כדי ליצור SH3-GFP (טבלת 1):
    1. להגביר את גן SH3 מפלסמיד pJD757 13 באמצעותפריימרים מתאימים.
    2. הפתיל שבר זה לגן ה-GFP ולהכניס אותו לתוך וקטור pET26b בין אמרגן T7 (איור 2 ג) ותג 6xHistidine C-מסוף.

2. ביטוי חלבון

  1. להפוך 50 μl של כימי המוסמך Escherichia coli BL21 (DE3) עם פלסמיד הביטוי ההולם.
  2. לאחר שינוי, סדרתי לדלל את התאים האלה, וצלחת אותם על לוריא-Bertani (LB) / צלחות אגר המכילות 50 מיקרוגרם / מיליליטר kanamycin.
  3. דגירה צלחות המכילות תאים הפכו ב37 מעלות צלזיוס במשך ~ שעות 15.
  4. לאחר דגירה, להרים צלחת המכילה 50-100 מושבות וresuspend כל המושבות ב5 מיליליטר של מרק LB.
  5. העברת השעיה ל1 kanamycin L LB מרק המכיל (50 מיקרוגרם / מיליליטר) ולגדל תאים על 37 מעלות צלזיוס עם רועד ב250 סל"ד. לנטר את הספיגה ב 600 ננומטר (OD 600). לגדול בתרבות עד OD 600 ~ 0.8.
    1. עבור lig C ו-C-SH3, לגרום ביטוי חלבון על ידי הוספת איזופרופיל β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) לתרבות (ריכוז סופי 1 מ"מ) ודגירת התרבות ב37 מעלות צלזיוס למשך 4 שעות תוך רועד ב250 סל"ד.
    2. עבור N וSH3-GFP, לקרר את התרבות ל~ 18 מעלות צלזיוס ידי טבילת בקבוק התרבות באמבט מי קרח ל~ 5 דקות. לגרום ביטוי חלבון על ידי הוספת IPTG לתרבות (ריכוז סופי 1 מ"מ) ודגירת התרבות ב18 מעלות צלזיוס במשך שעה 14-18 תוך רועד ב250 סל"ד.
  6. אחרי ביטוי חלבון, צנטריפוגות התרבות ב6,000 XG עבור 20 דקות ב 4 ° C לאסוף את הכדור. תא גלולה חנות ב -80 מעלות צלזיוס עד לשימוש.

3. טיהור חלבון

  1. טיהור של N (denaturing תנאים)
    1. כדורי תא גלול במאגר (טבלה 2) בשעה 10 מיליליטר / גרם של גלולה רטובה.
    2. Immersדואר ההשעיה גלולה באמבט קרח מים ולשבש תאים על ידי sonication (Amp 10, עם דופק 1 שניות והפסקת שניות 6 דקות 1).
    3. צנטריפוגה lysate XG 16,000 עבור 20 דקות ב 4 ° C.
    4. בטל supernatant. Resuspend את הכדור בהצפה DA (המכיל 8 מ אוריאה) וצנטריפוגה ההשעיה XG 16,000 עבור 20 דקות ב 4 ° C.
    5. להעביר את supernatant דרך עמודה 5 חומצת Ni-nitrilotriacetic מיליליטר (נ.ת. ע) equilibrated בעבר עם תובע חיץ.
    6. לשטוף טור עם 30 מיליליטר של הצפת DA בתוספת 45 imidazole מ"מ. Elute חלבון מטוהר באמצעות 20 מיליליטר של הצפת DA בתוספת 150 imidazole מ"מ.
    7. להפחית את ריכוז האוריאה במדגם החלבון ל< 1 מ"מ על ידי אחד משתי השיטות הבאות שניתן ב3.1.7.1 או 3.1.7.2:
      1. Dialyze חלבון במאגר DPBS (טבלה 2) בשעה 4 בלילה מעלות צלזיוס באמצעות צינורות עם <20 הפסקת kDa.
      2. צנטריפוגה מטוהרים חלבון ב# 30 &160; עמודת kDa Ultra-סינון ספין ב2,800 XG, 4 ° C עד הנפח הוא פחות מ 1 מיליליטר. הוסף חוצץ 14 DPBS מיליליטר לעמודה לדלל מדגם החלבון. חזור צנטריפוגה / דילול צעדים שלוש פעמים נוספות.
    8. לאחר חילופי חיץ, להוסיף dithiothreitol (DTT) לחלבון מטוהר (סופי 2 מ"מ) ולהתרכז חלבון ל~ 100 מ"ג / מיליליטר על ידי צנטריפוגה דרך עמודת 30 kDa Ultra-סינון ספין ב2,800 XG, 4 ° C.
    9. Aliquot החלבון וחנות מרוכזים ב-80 מעלות צלזיוס עד לשימוש.
  2. טיהור של lig C ו-C-SH3 (מצב מקורי)
    1. כדורי תא גלול במאגר B (pH 6.0) (טבלה 2) בתוספת מעכבי פרוטאז קוקטייל 1x ב10 מיליליטר / גרם של גלולה רטובה. השתמש חיץ חומצי כדי למזער את השפלת מפרקי חלבונים של חלבון המטרה.
    2. לשבש את ההשעיה תא על ידי sonication כמתואר ב3.1.2. צנטריפוגה ליסאכלתי בXG 16,000 ל20 דקות ב 4 ° C ולשמור את supernatant.
    3. להעביר את lysate המסיסים באמצעות Ni-נ.ת. ע עמודת 5 מ"ל equilibrated בעבר עם B. החיץ
    4. טור לשטוף עם הצפת B בתוספת imidazole 45 מ"מ, וelute חלבון המטרה ב20 מיליליטר של הצפת B בתוספת 150 imidazole מ"מ.
    5. לג, דלג לשלב 3.2.6. עבור lig C-SH3, לבצע צעד נוסף חילופי יונים טיהור להסיר חלבון מושפל באופן חלקי, כפי שנמסר בצעדים 3.2.5.1 ל3.2.5.3
      1. להפחית את ריכוז NaCl בlig C-SH3 ל< 1 מ"מ ביצוע ההליך המתואר ב3.1.7.
      2. טען את חלבון המטרה על גבי 5 עמודת מיליליטר אניון חרוזים מחליף agarose מטריצת equilibrated בעבר עם חיץ פוספט נתרן (50 מ"מ, pH 7.0).
      3. חלבון מטרת Elute מהעמודה על ידי הפעלה הדרגתית מתמיסה המכילה buffe 8.0 pH 10 מ"מ טריס-HClr לתמיסה המכילה את אותו החיץ בתוספת 1 M NaCl. לקחת דגימות במהלך elution חלבון ודגימות בריכה עם הטוהר הגבוה ביותר המבוסס על אלקטרופורזה נתרן גופרתי dodecyl polyacrylamide ג'ל (SDS-PAGE).
    6. חיץ להחליף החלבונים המטוהרים למאגר DPBS, כפי שתואר ב3.1.7.
    7. הוספת DTT לחלבון מטוהר (הריכוז סופי 2 מ"מ) ולרכז את החלבון ל~ 100 מ"ג / מיליליטר באמצעות טור ספין Ultra-סינון 30 kDa כפי שמתואר ב3.1.8. Aliquot ולאחסן מרוכז חלבון ב-80 מעלות צלזיוס עד לשימוש.
  3. טיהור SH3-GFP
    1. כדורי תא resuspend באמצעות הצפת ב10 מיליליטר / גרם של גלולה רטובה.
    2. לשבש השעיה גלולה ידי sonication כמתואר ב3.1.2.
    3. צנטריפוגה lysate XG 16,000 ל20 דקות ב 4 ° C ולאסוף את supernatant.
    4. להעביר את supernatant (lysate מסיס) דרך עמודת Ni-נ.ת. ע 5 מ"ל equilibrated בעבר עםא חיץ
    5. לשטוף טור עם 30 מיליליטר של הצפת בתוספת 45 imidazole מ"מ. Elute חלבון מטוהר באמצעות 20 מיליליטר של הצפת בתוספת 150 imidazole מ"מ.
    6. חיץ להחליף חלבונים המטוהרים למאגר DPBS באמצעות גישה דומה לזה שתואר ב3.1.7 ולרכז את החלבון ל~ 150 מ"ג / מיליליטר באמצעות טור ספין Ultra-סינון 30 kDa כפי שמתואר ב3.1.8.
    7. Aliquot ולאחסן מטוהרים חלבון ב -80 מעלות צלזיוס עד לשימוש.
  4. SDS-PAGE ניתוח של דגימות מטוהרים המכילות CutA
    1. לדלל כל חלבון מטוהר במים מזוקקים כפולים כדי להפחית את ריכוז NaCl ל~ 1 מ"מ. בריכוז NaCl זה, רוב חלבוני trimer CutA לרוץ כמו מונומרים על ג'לי-SDS.
    2. מערבבים את הדגימות עם חיץ מדגם SDS 2x (0.5 M טריס-HCl, pH 6.8, 20% גליצרול, 10% w / v SDS, 0.1% w / 2% β-mercaptoethanol bromo-פנול v הכחול,), טופחו על 95 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
    3. טען את סםPles על 12% ג'ל SDS-PAGE. לבצע אלקטרופורזה במתח מתמיד של 200 V ל~ 50 דקות.
    4. שים לב לחלבון בג'לים על ידי צביעה עם R250 הכחול המבריק Coomassie הבא הפרוטוקולים סטנדרטיים (איור 1 ג).

4. גיבוש הידרוג'ל

הערה: הידרוג המדגם שנעשה במחקר זה מכיל 1.6 מ"מ של כל אבן בניין הידרוג'ל אלא אם צוין אחרת. ריכוז חלבון זה מניב הידרוג'ל רך ויציב. זהירות: יזיד הנתרן (NAN 3) הוא הוסיף להידרוג'ל לריכוז סופי של .0.5% w / v כדי למנוע זיהום חיידקים. NaN 3 הוא רעילים מאוד ויש לטפל בם בזהירות רבה כפי שצוינו בגיליון בטיחות חומר.

  1. לחשב את הנפח של כל אחד מהחלבונים מרוכזים הדרושים להשגת ריכוז סופי של 1.6 מ"מ בהידרוג'ל מדגם μl 100. לדוגמא:
    ריכוז של N:100 מ"ג / מיליליטר
    משקל מולקולרי של N: 26.3 kDa (ראה טבלת 1)
    ריכוז 100 μl רצוי:: נפח רצוי 1.6 מ"מ
    figure-protocol-11391
  2. כדי להפוך הידרוג'ל μl 100 (1.6 מ"מ), ומערבב C (x μl, נפח מחושב לפי 4.1) עם 5% 3 NaN (10 μl), המחושב 100 מ"מ DTT (5 μl) ו-N (μl y, נפח פי 4.1) בתוך בקבוקון זכוכית 2 מיליליטר.
  3. הוסף חוצץ DPBS ((85 - x - μl y)) לבקבוקון כדי להשיג נפח סופי של μl 100, ומערבבים באופן ידני את כל המרכיבים באמצעות תנועות סיבוביות באמצעות קצה פיפטה. הערה: הפתרון הופך צמיג מאוד על ערבוב.
  4. צנטריפוגה את התערובת במשך 2 דקות ב 8,000 XG כדי להסיר בועות האוויר.
  5. דגירה את התערובת בחדרטמפרטורה בלילה כדי לאפשר תגובת intein טרנס השחבור להגיע לסיום. לאשר הקמת הידרוג'ל ידי הפיכת צינור הפוכה. החלבונים לא יזרמו אם הידרוג'ל נוצר.
  6. להעריך את תשואת intein טרנס השחבור על ידי בדיקת דגימות (0.5 μl כל אחד) שנאספו לפני שלב 4.2 ואחרי שלב 4.5 על ג'ל SDS-PAGE, כפי שתואר ב3.4 (תרשים 1C).

5. חוסר תנועה של ה-GFP באמצעות חלבון עגינה (DP) ותחנת עגינה לפפטיד אינטראקציה (DSP)

  1. כדי להפוך הידרוג'ל פונקציונליות GFP 50 μl (1.2 מ"מ), לשלב lig C-SH3 (x μl, המחושב על פי 4.1) וSH3-GFP (μl y, מחושב לפי 4.1) ב1:1 טוחנת ב1.7 צינור מיליליטר microcentrifuge דגירה את התערובת בטמפרטורת חדר למשך 30 דקות.
  2. הוסף 5% NaN 3 (5 μl), 100 מ"מ DTT (2.5 μl), (42.5 - x - y DPBS μl) לאותו צינור. הוספת N (μl y, מחושב לפי 4.1) כדי להשיג יחס של 1:1 טוחנת של lig N ו-C-SH3. מערבבים את הדגימה באמצעות פיפטה קצה על ידי תנועות סיבוביות.
  3. צנטריפוגה את התערובת על 8,000 XG במשך 2 דקות ו דגירה את התערובת בטמפרטורת חדר למשך הלילה בחושך. הידרוג'ל encapsulating צורות SH3-GFP במהלך דגירה.

6. שימוש ב1.6 מ"מ Hydrogel כפיגום קיבוע לתגובה האנזימטית בממס אורגני

  1. השתמש HRP כאנזים מודל. הכן פתרון מניות של HRP (מ"ג 28 / מיליליטר או 0.63 מ"מ) בDPBS.
  2. כדי להפוך הידרוג'ל μl 30 (1.6 מ"מ) כולאים HRP, לשלב C (x μl, המחושב על פי 4.1) עם HRP (2 μl), 5% NaN 3 (3 μl) וDTT (1.5 μl של 100 מ"מ) בתוך צינור צנטריפוגות 1.7 מיליליטר.
  3. הוספת N (y <μl / em>, המחושב על פי 4.1) וDPBS (23.5 - μl y) - x. מערבבים עם קצה פיפטה עם תנועות סיבוביות.
  4. צנטריפוגה את התערובת על 8,000 XG במשך 2 דקות ו דגירה בטמפרטורת חדר למשך הלילה.
    זהירות: העוצרים משמשים עבור assay הפעילות הבא הם רעילות ביותר. השתמש בהמלצות בטיחות ספציפיות על ידי גיליונות נתוני בטיחות חומרים המתאימים.
  5. לתגובה האנזימטית, להטביע את הידרוג'ל ב 1 מיליליטר של קוקטייל תגובה המכיל N, N-diamine דימתיל-P-phenylene (5.8 מ"מ), פנול (5.8 מ"מ) וhydroperoxide טרט בוטיל (2.9 מ"מ) בn-heptane 14. ידני לשבש את הג'ל באמצעות קצה פיפטה כדי להגדיל את שטח הפנים של מגע הידרוג'ל והממס.
  6. זיהוי מוצר HRP, צבע indophenol סוג, על ידי מדידת הספיגה האופטית של דגימות שנלקחו בזמנים שונים ב546 ננומטר בקורא צלחת (איור 5).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

סכמטי להיווצרות החלבון הידרוג'ל intein תיווך מוצג באיור 1 א. אבני הבניין של הידרוג'ל הוא חלבון קופולימרים CutA-NpuN (N) וNpuC-S-CutA (ג) (איור 1 א, טבלת 1). NpuN / C הוא N-/C-fragments של DnaE לפצל באופן טבעי intein מpunctiforme Nostoc (NPU). CutA הוא חלבון trimeric יציב מPyrococcus horikoshii 4,5. ?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

בעבודה זו, שהדגמנו את הסינתזה של חלבון הידרוג'ל intein תיווך מאוד יציב. השימוש בפיצול intein מאפשר הידרוג'ל להיווצר בתנאים בתגובה לערבוב של שני מרכיבי נוזל שלב. באופן ספציפי, פיצול intein קוולנטית מחבר בין שני אבני בניין נוזל שלב באמצעות תגובת טרנס שחבור, מניב יחידת פ?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

אין אינטרסים כלכליים מתחרים קיימים.

Acknowledgements

המחברים מבקשים להודות ד"ר דוד Tirrell (קלטק) למתנה מסוגו של פלסמיד pQE9 AC 10 12 Atrp, ד"ר טום מויר (אוניברסיטת פרינסטון) למתנה מסוגו של פלסמיד 11 KanR-IntRBS-NpuNC-CFN, ד"ר Takehisa מאטסודה (קאנאזאווה מכון טכנולוגי, האקאסאן, אישיקאווה, יפן) למתנה מסוגו של פלסמיד pET30-CutA-Tip1 10, וד"ר ג'יי ד Keasling (UC ברקלי) למתנה מסוגו של פלסמיד 13 pJD757 . עבודה זו נתמכה בחלקו על ידי הקרן הלאומית למדע הקריירה, חיל האוויר האמריקאי ייפ ונורמן הקמן מתקדם תכנית המחקר.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments

Phusion High Fidelity DNA polymerase

New England BioLabs

M0530S

Competent Escherichia coli BL21 (DE3)

New England BioLabs

C2527I

Luria Bertani

VWR

90003-350

Bacto Agar Media

VWR

Kanamycin sulfate

VWR

IPTG

VWR

EM-5820

Imidazole

VWR

EM-5720

Urea

VWR

EM-9510

Dithiothreitol (DTT)

Fisher

BP172-5

Protease Inhibitor cocktail

Roche Applied Science

11836153001

DPBS

VWR

82020-066

Brilliant Blue R

Acros Organics

A0297990

Sodium Azide

Fisher

AC190380050

Caution, highly toxic

Horseradish peroxidase

Sigma

P8125-5KU

N,N-dimethyl-p-phenylene diamine

Fisher

AC408460250

Caution, highly toxic

phenol

Fisher

AC149340500

Caution, highly toxic

tert-butyl hydroperoxide

Fisher

AC180340050

Caution, highly toxic

n-heptane

Acros Organics

120340010

[header]

Shaker/Incubator

Fisher Scientific

Max Q 6000

Centrifuge

Sorvall

RC 6

Sonicator

QSonica

Misonix 200

Ultrafiltration Tubes

Amicon Ultra

UFC903024

 Ni Sepharose High Performance HisTrap column

GE Healthcare Life Sciences

17-5248-01

HiTrap SP Sepharose FF ion exchange column

GE Healthcare Life Sciences

17-5156-01

Plate reader

Molecular Devices

SpectraMax Gemini EM

References

  1. Banta, S., Wheeldon, I. R., Blenner, M. Protein Engineering in the Development of Functional Hydrogels. Ann. Rev. Biomed. Eng. 12, 167-186 (2010).
  2. Iwai, H., Zuger, S., Jin, J., Tam, P. H. Highly efficient protein trans-splicing by a naturally split DnaE intein from Nostoc punctiforme. FEBS Lett. 580, 1853-1858 (2006).
  3. Zettler, J., Schutz, V., Mootz, H. D. The naturally split Npu DnaE intein exhibits an extraordinarily high rate in the protein trans-splicing reaction. FEBS Lett. 583, 909-914 (2009).
  4. Tanaka, Y., et al. Structural implications for heavy metal-induced reversible assembly and aggregation of a protein: the case of Pyrococcus horikoshii CutA. FEBS Lett. 556, 167-174 (2004).
  5. Sawano, M., et al. Thermodynamic basis for the stabilities of three CutA1s from Pyrococcus horikoshii,Thermus thermophilus, and Oryza sativa, with unusually high denaturation temperatures. Biochemistry. 47, 721-730 (2008).
  6. Tanaka, T., et al. Hyper-thermostability of CutA1 protein, with a denaturation temperature of nearly 150 degrees C. FEBS Lett. 580, 4224-4230 (2006).
  7. Shen, W., Zhang, K., Kornfield, J. A., Tirrell, D. A. Tuning the erosion rate of artificial protein hydrogels through control of network topology. Nat. Mater. 5, 153-158 (2006).
  8. McGrath, K. P., Fournier, M. J., Mason, T. L., Tirrell, D. A. Genetically directed syntheses of new polymeric materials. Expression of artificial genes encoding proteins with repeating -(AlaGly)3ProGluGly- elements. J. Am. Chem. Soc. 114, 727-733 (1992).
  9. Ramirez, M., Guan, D., Ugaz, V., Chen, Z. Intein-triggered artificial protein hydrogels that support the immobilization of bioactive proteins. J. Am. Chem. Soc. 135, 5290-5293 (2013).
  10. Ito, F., et al. Reversible hydrogel formation driven by protein-peptide-specific interaction and chondrocyte entrapment. Biomaterials. 31, 58-66 (2010).
  11. Lockless, S. W., Muir, T. W. Traceless protein splicing utilizing evolved split inteins. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 10999-11004 (2009).
  12. Shen, W., Lammertink, R. G. H., Sakata, J. K., Kornfield, J. A., Tirrell, D. A. Assembly of an artificial protein hydrogel through leucine zipper aggregation and disulfide bond formation. Macromolecules. 38, 3909-3916 (2005).
  13. Dueber, J. E., et al. Synthetic protein scaffolds provide modular control over metabolic flux. Nat. Biotechnol. 27, (2009).
  14. Bruns, N., Tiller, J. C. Amphiphilic network as nanoreactor for enzymes in organic solvents. Nano Lett. 5, 45-48 (2005).
  15. Das, D., et al. Water gelation of an amino acid-based amphiphile. Chem. Eur. J. 12, 5068-5074 (2006).
  16. Cao, Y., Li, H. Engineering tandem modular protein based reversible hydrogels. Chem. Commun. , 4144-4146 (2008).
  17. Wu, X., et al. Structural basis for the specific interaction of lysine-containing proline-rich peptides with the N-terminal SH3 domain of c-Crk. Structure. 3, 215-226 (1995).
  18. Nguyen, J. T., Turck, C. W., Cohen, F. E., Zuckermann, R. N., Lim, W. A. Exploiting the basis of proline recognition by SH3 and WW domains: Design of n-substituted inhibitors. Science. 282, 2088-2092 (1998).
  19. Olsen, B. D., Kornfield, J. A., Tirrell, D. A. Yielding Behavior in Injectable Hydrogels from Telechelic Proteins. Macromolecules. 43, 9094-9099 (2010).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

intein83

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved