Síntese de uma proteína artificial intein mediada Hidrogel

Resumo

Apresentamos a síntese de um hidrogel mediada-intein desdobramento da proteína. Os blocos de construção da presente hidrogel são dois copolímeros de proteínas, cada uma contendo uma subunidade de uma proteína trimérica, que serve como um agente de ligação cruzada e uma metade de um intein dividida. A mistura dos dois copolímeros de proteínas desencadeia uma reacção de splicing trans intein, obtendo-se uma unidade de poliptido que se auto-monta para um hidrogel. Este hidrogel é altamente pH e temperatura estáveis, compatíveis com solventes orgânicos, e facilmente incorpora proteínas globulares funcionais.

Resumo

Apresentamos a síntese de uma proteína de hidrogel altamente estável mediada por um catalisado-intein dividida proteína reacção de splicing trans. Os blocos de construção da presente hidrogel são dois copolímeros em bloco de proteínas, cada uma contendo uma subunidade de uma proteína trimérica, que serve como um agente de ligação cruzada e uma metade de um intein dividida. Uma bobina aleatório altamente hidrofílico é inserida em um dos copolímeros em bloco de retenção de água. A mistura dos dois copolímeros em bloco a proteína desencadeia uma reacção de splicing trans intein, obtendo-se uma unidade de polipeptídeo com agentes de reticulação em ambas as extremidades que rapidamente auto-monta em um hidrogel. Este hidrogel é muito estável tanto em condições ácidas e básicas, a temperaturas até 50 ° C, e em solventes orgânicos. O hidrogel rapidamente reformas após ruptura induzida por cisalhamento. Incorporação de um "encaixe estação peptídeo" para o bloco de construção de hidrogel permite incorporação conveniente de "proteína de ancoragem", marcado proteínas-alvo.O hidrogel é compatível com o meio de crescimento de cultura de tecidos, suporta a difusão de moléculas de 20 kDa, e permite a imobilização de proteínas globulares bioactivos. A aplicação do hidrogel proteína intein-mediada como um biocatalisador compatível com solvente orgânico foi demonstrada por encapsular a enzima peroxidase de rábano silvestre e corroborar a sua actividade.

Introdução

Os hidrogéis feitos inteiramente de proteínas carregam o potencial para avançar significativamente campos tão diversos como a engenharia de tecidos, distribuição de medicamentos e biofabrication ^1. Eles oferecem vantagens sobre os hidrogéis de polímero sintético tradicionais, incluindo biocompatibilidade e o potencial para apoiar de forma não invasiva a incorporação de proteínas globulares bioactivos.

Neste trabalho, nós descrevemos o desenvolvimento de um novo hidrogel de proteína formada por meio de uma resposta mediada intein dividida proteína reacção de splicing trans e sua aplicação como suporte de imobilização de proteína (Figura 1). Os blocos de construção para esta hidrogel são dois copolímeros em bloco de proteína, compreendendo cada fragmento o N-ou C-terminal de uma divisão intein (IN e IC) e uma subunidade de uma proteína multimérica reticulador. O DNAE intein de Nostoc punctiforme (NPU) foi usada como o grupo intein ^2,3 e uma pequena proteína trimérica (12 kDa) a partir de CUTA Pyrococcus horikoshii </ Em> foi usado como o agente de ligação cruzada de proteínas ^{a 4,5.} Diferentes agentes de reticulação são unidas por meio de reacção de splicing trans intein catalisada, levando à formação de uma rede de proteínas altamente reticulado (hidrogel). NPU intein foi escolhido por causa de sua cinética de reação rápida (t _1/2 = 63 seg) e alto rendimento trans-splicing (perto de 80%) ^2,3. A proteína CUTA foi escolhido como o agente de ligação cruzada, devido à sua elevada estabilidade. Trímeros CUTA têm uma temperatura de desnaturação de perto de 150 ° C e manter a estrutura quaternária trimérico em soluções contendo tanto como 5 M de cloridrato de guanidina ^4,6. Desde subunidade troca entre os diferentes agentes de reticulação é um dos principais contribuintes da superfície hidrogel físico erosão ^7, a interação entre subunidade muito forte em Cuta deve desencorajar tais trocas de subunidades, levando a um hidrogel mais estável. Um desses blocos de construção também contém um peptídeo S-fragmento altamente hidrofílico como o meio-bloco para facilitar a águaretenção ^8.

A mistura dos dois blocos de construção de hidrogel inicia uma reacção de splicing trans entre a IN e IC intein fragmentos, gerando uma corrente mais polipeptídeo com agentes de ligação cruzada em ambos os terminais. Reticuladores de várias de tais unidades moleculares interagir uns com os outros, formando uma rede de hidrogel altamente reticulado (Figura 1A). Um específico "encaixe estação péptido" (DSP) é incorporado um dos blocos de construção de hidrogel a fim de facilitar a imobilização estável de uma "proteína de ancoragem" (DP) marcado com proteína alvo no hidrogel. O uso de uma divisão intein para mediar a montagem de hidrogel não só fornece flexibilidade adicional para a síntese de proteína de hidrogel, mas também permite alta densidade, carga uniforme da proteína alvo ao longo de todo o hidrogel, tal como as proteínas alvo são carregados antes da formação do hidrogel.

O hidrogel de proteínas mediada por intein é altamente stable em solução aquosa, com pouco ou nenhuma erosão detectável após 3 meses à temperatura ambiente. A estabilidade é mantida numa vasta gama de valores de pH (6-10) e de temperaturas (4-50 ° C), e o hidrogel é também compatível com solventes orgânicos. Este hidrogel é utilizado para a imobilização das duas proteínas globulares: a proteína fluorescente verde (GFP) e a peroxidase de rábano (HRP). Hidrogel aprisionando a última proteína é usada para executar biocatálise em um solvente orgânico.

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Protocolo

1. Plasmídeo Construção

NOTA: Todos os genes foram amplificados em reações de PCR padrão usando Phusion High-Fidelity DNA polimerase por especificações do fabricante. Os iniciadores utilizados para a clonagem foram descritas anteriormente ^9. Todas as construções estão listadas na Tabela 1.

1. Para gerar cuta-NpuN (N, Tabela 1):
   1. PCR amplificar genes CUTA e NpuN de plasmídeos pET30-cuta-Tip1 ¹⁰ e KanR-IntRBS-NpuNC ^CFN-11, respectivamente, utilizando os iniciadores adequados.
   2. Digerir estes fragmentos com as enzimas de restrição adequadas, e inseri sequencialmente estes fragmentos no vector pET26b entre o promotor T7 e uma marca de 6xHistidine C-terminal para gerar N (Figura 2A).
2. Para gerar NpuC-S-cuta (C, Tabela 1):
   1. PCR amplificar NpuC, Cuta e S fragmentaçãoT [AG ₃ (PEG)] ₁₀ a partir do plasmídeo KanR-IntRBS-NpuNC ^CFN-11, pET30-cuta-Tip1 ¹⁰ e pQE9 AC ₁₀ PRTA ^12, respectivamente, utilizando os iniciadores adequados.
   2. Digerir estes fragmentos com as enzimas de restrição adequadas, e inseri sequencialmente estes fragmentos no vector pET26b entre o promotor T7 e uma 6xHistidine C-terminal para gerar C (Figura 2B).
3. Para gerar NpuC-S-SH3 _lig-Cuta (C-SH3 _lig, Tabela 1):
   1. PCR amplificar Cuta usando primers contendo um _lig SH3 (PPPALPPKRRR) e um ligante flexível (GGGGS) ₂ para gerar fragmento SH3 _lig-cuta.
   2. Substitua o gene Cuta de C com fragmento SH3 _lig-cuta.
4. Para gerar SH3-GFP (Tabela 1):
   1. Amplificar o gene a partir do plasmídeo SH3 pJD757 ¹³ usando oiniciadores apropriados.
   2. Fundir este fragmento com o gene GFP e inseri-la no vector pET26b entre o promotor T7 (Figura 2C) e uma etiqueta de 6xHistidine C-terminal.

2. Protein Expression

1. Transformar 50 ul de quimicamente competente de Escherichia coli BL21 (DE3) com o plasmídeo de expressão apropriado.
2. Após a transformação, serialmente diluídas estas células, e placa-los em meio Luria-Bertani (LB) / placas de agar contendo 50 ug / ml de canamicina.
3. Incubar as placas que contêm células transformadas a 37 ° C durante ~ 15 horas.
4. Após a incubação, pegar uma placa que contém 50-100 colônias e ressuspender todas as colônias em 5 ml de caldo LB.
5. Transferência de suspensão de 1 L de caldo LB contendo canamicina (50 ug / ml) e as células crescer a 37 ° C com agitação a 250 rpm. Monitorar a absorvância a 600 nm (OD _600). Crescer cultura até OD ₆₀₀ ~ 0,8.
   1. Para C e C-SH3 _lig, induzir a expressão da proteína por adição de isopropil β-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG) para a cultura (1 mM concentração final) e incubar a cultura a 37 ° C durante 4 horas, agitando a 250 rpm.
   2. Para N e SH3-GFP, arrefecer a cultura a ~ 18 ° C por imersão do frasco de cultura em um banho de água gelada durante ~ 5 min. Induzir a expressão da proteína por adição de IPTG à cultura (concentração final 1 mM) e incuba-se a cultura a 18 ° C durante 14-18 h, agitando a 250 rpm.
6. Após expressão de proteína, centrifugar a cultura a 6.000 x g durante 20 min a 4 ° C para recolher o sedimento. Pellet celular armazenar a -80 ° C até à sua utilização.

3. Purificação de Proteínas

1. Purificação de N (condições de desnaturação)
   1. Os sedimentos de células ressuspender em tampão A (Tabela 2) em 10 ml / g de sedimento húmido.
   2. Immerso e a suspensão da pelota em um banho de gelo-água e romper as células por ultra-sons (10 Amp, com um segundo pulso e 6 seg pausa durante 1 min).
   3. Centrifuga-se o lisado a 16.000 x g durante 20 min a 4 ° C.
   4. Desprezar o sobrenadante. Ressuspender o sedimento em tampão de DA (contendo 8 M de ureia) e centrifugar a suspensão a 16.000 xg durante 20 min a 4 ° C.
   5. Passe o sobrenadante através de uma coluna de 5 ml de ácido Ni-nitrilotriacético (NTA) previamente equilibrada com DA buffer.
   6. Lavar coluna com 30 ml de tampão DA suplementado com 45 mM de imidazole. Eluir a proteína purificada, utilizando 20 ml de tampão DA suplementado com 150 mM de imidazole.
   7. Reduzir a concentração de ureia na amostra de proteína para <1 mM, por qualquer um dos métodos a seguir indicados no 3.1.7.1 ou 3.1.7.2:
      1. Dializar proteína em tampão de DPBS (Tabela 2), a 4 ° C durante a noite utilizando tubos com <20 kDa de corte.
      2. Centrífuga proteína purificada em um 30 & #160; kDa ultra-filtração coluna de centrifugação a 2,800 xg, 4 ° C até que o volume é inferior a 1 ml. Adicionar 14 ml de tampão de DPBS à coluna para diluir a amostra de proteína. Repita a centrifugação / diluição passos mais três vezes.
   8. Após troca de tampão, adicionar o ditiotreitol (DTT) para a proteína purificada (final 2 mM) e concentrado de proteína de ~ 100 mg / ml por centrifugação através de uma ultra-filtração coluna de centrifugação de 30 kDa a 2800 xg, a 4 ° C.
   9. Alíquota da proteína concentrada e armazenar a -80 ° C até à sua utilização.
2. Purificação de C e C-SH3 _lig (condição nativa)
   1. Os sedimentos de células ressuspender em tampão B (pH 6,0) (Tabela 2) suplementado com 1x cocktail inibidor de protease a 10 ml / g de sedimento húmido. Utilize tampão acidico para minimizar a degradação proteolítica da proteína alvo.
   2. Interromper a suspensão de células por ultra-sons como descrito em 3.1.2. Centrifugar as lisComeram a 16.000 xg durante 20 min a 4 ° C e manter-se o sobrenadante.
   3. Passar o lisado solúvel por meio de uma de 5 ml de coluna de Ni-NTA, previamente equilibrada com tampão B.
   4. Lavar a coluna com tampão B complementado com imidazole 45 mM, e elui-se a proteína alvo em 20 ml de tampão B complementado com imidazole 150 mM.
   5. Para C, pule para o passo 3.2.6. Para C-SH3 _lig, realizar uma etapa de purificação de troca iônica adicional para remover proteína parcialmente degradada como dado em passos 3.2.5.1 para 3.2.5.3
      1. Reduzir a concentração de NaCl no C-SH3 _lig a <1 mM, seguindo o procedimento descrito em 3.1.7.
      2. Carregar a proteína alvo em um permutador de aniões 5 ml de contas de agarose a coluna de matriz, previamente equilibrada com tampão fosfato de sódio (50 mM, pH 7,0).
      3. Proteína alvo eluem a partir da coluna, executando um gradiente a partir de uma solução contendo 10 mM Tris-HCl pH 8,0 buffer a uma solução contendo o mesmo tampão suplementado com 1 M de NaCl. Retirar amostras durante a eluição da proteína e amostras de piscina com a pureza mais elevada com base em dodecil sulfato de gel de poliacrilamida de sódio (SDS-PAGE).
   6. Troca de tampão a proteína purificada em tampão de DPBS, como descrito em 3.1.7.
   7. Adicionar DTT para a proteína purificada (concentração final 2 mM) e concentra-se a proteína a ~ 100 mg / ml, utilizando uma coluna de spin de ultra-filtração de 30 kDa, tal como descrito em 3.1.8. Alíquotas e armazenamento de concentrado de proteína de -80 ° C até à sua utilização.
3. Purificação de SH3-GFP
   1. Os sedimentos de células Ressuspender utilizando tampão A, a 10 ml / g de sedimento húmido.
   2. Disrupt suspensão pellet por sonicação como descrito no ponto 3.1.2.
   3. Centrifuga-se o lisado a 16.000 x g durante 20 min a 4 ° C e recolher o sobrenadante.
   4. Passa-se o sobrenadante (lisado solúvel) por meio de um 5 ml de coluna de Ni-NTA equilibrada previamente comTampão A.
   5. Lavar coluna com 30 ml de tampão A suplementado com 45 mM de imidazole. Eluir a proteína purificada, utilizando 20 ml de tampão A suplementado com 150 mM de imidazole.
   6. Troca de tampão a proteína purificada em tampão de DPBS utilizando uma metodologia semelhante ao descrito no 3.1.7 e concentrar a proteína de ~ 150 mg / ml, utilizando uma coluna de spin de ultra-filtração de 30 kDa, tal como descrito em 3.1.8.
   7. Alíquotas e armazenamento de proteína purificada a -80 ° C até à sua utilização.
4. A análise de SDS-PAGE de amostras purificadas contendo CUTA
   1. Dilui-se cada proteína purificada em água duplamente destilada para reduzir a concentração de NaCl para ~ 1 mM. A esta concentração de NaCl, a maioria das proteínas CUTA trímeros executado como monómeros sobre os géis de SDS-PAGE.
   2. Misturar as amostras com tampão de amostra 2x SDS (0,5 M Tris-HCl, pH 6,8, 20% de glicerol, 10% w / v de SDS, 0,1% w / v de bromo-fenol azul, 2% β-mercaptoetanol), incubados a 95 ° C durante 5 min.
   3. Carregue o sampios num gel de SDS-PAGE a 12%. Realizar eletroforese a uma tensão constante de 200 V para ~ 50 min.
   4. Observar proteína nos géis por coloração com azul brilhante de Coomassie R250 a seguir os protocolos padrão (Figura 1C).

4. Formação Hidrogel

NOTA: os hidrogéis de amostras efectuadas neste estudo contêm 1,6 mM de cada bloco de construção hidrogel salvo indicação em contrário. Esta concentração de proteína produz um hidrogel macia e estável. ATENÇÃO: A azida de sódio (NaN ₃₎ é adicionado ao hidrogel para uma concentração final de 0,5% w / v para evitar a contaminação bacteriana. NaN ₃ é altamente tóxico e deve ser manuseado com muito cuidado, como indicado na Ficha de Segurança.

1. Calcular o volume de cada uma das proteínas concentradas necessários para alcançar uma concentração final de 1,6 mM em um hidrogel 100 ul de amostra. Por exemplo:
   A concentração de N:100 mg / mL
   Peso molecular de N: 26,3 kDa (ver Tabela 1)
   Concentração 100 l desejado:: volume desejado de 1,6 mM
   
2. Para tornar um hidrogel 100 ul (1,6 mM), mistura C (x ul, o volume calculado de acordo com 4.1) com 5% de NaN ₃ (10 mL), DTT 100 mM (5 mL) e N (y ul, o volume calculado de acordo com a 4,1) dentro de um frasco de vidro de 2 ml.
3. Adicionar tampão de DPBS ((85 - x - y) ul) para o frasco de forma a alcançar um volume final de 100 ul, e misturar todos os componentes manualmente através de um movimento rotativo utilizando uma ponta de pipeta. Nota: A solução torna-se muito viscosa ao ser misturado.
4. Centrifugar a mistura durante 2 min a 8000 xg para remover as bolhas de ar.
5. Incubar a mistura de quartotemperatura durante a noite para permitir que a reacção de splicing trans intein para atingir a conclusão. Confirme formação hidrogel girando tubo de cabeça para baixo. As proteínas não fluirá se um hidrogel é formado.
6. Estimar o rendimento intein trans-splicing, verificando amostras (0,5 ul cada) recolhidos antes do passo 4.2 e após a etapa 4.5 em um gel de SDS-PAGE, como descrito no ponto 3.4 (Figura 1C).

5. Imobilização de GFP via proteína de ancoragem (DP) e Docking Station Peptide (DSP) Interação

1. Para fazer com que um 50 ul funcionalizada-GFP hidrogel (1,2 mM), combinar C-SH3 _{de Nata} (x ul, calculado de acordo com 4.1) e SH3-GFP (y ul, calculado de acordo com 4.1) em razão molar de 1:1 em um 1,7 ml tubo de microcentrífuga e incubar-se a mistura à temperatura ambiente durante 30 min.
2. Adicionam-se 5% _{de NaN3} (5 mL), DTT 100 mM (2,5 mL), (42,5 - x - y) DPBS ul para o mesmo tubo. Adiciona-se N (y ul, calculado de acordo com a 4.1) para se atingir uma proporção de 1:1 molar de N e C-SH3 _lig. Misturar a amostra usando uma ponteira por um movimento giratório.
3. Centrifugar a mistura a 8.000 x g durante 2 min e incubar-se a mistura à temperatura ambiente durante a noite no escuro. Um hidrogel encapsulando formas SH3-GFP durante a incubação.

6. Uso de Hidrogel 1,6 mM como um andaime para Imobilização Reação enzimática em solvente orgânico

1. Use o HRP como uma enzima modelo. Prepara-se uma solução estoque de HRP (28 mg / ml ou 0,63 mM) em DPBS.
2. Para tornar um hidrogel 30 ul (1,6 mM) aprisionamento HRP, combinam C (x ul, calculado de acordo com 4.1) com HRP (2 mL), 5% de NaN ₃ (3 mL) e DTT (1,5 mL de 100 mM) no interior de um 1,7 ml tubo de centrifugação.
3. Adiciona-se N (y </ Em> il, calculados de acordo com 4.1) e DPBS (23,5 - x - y) mL. Misture com a ponta da pipeta com um movimento giratório.
4. Centrifugar a mistura a 8.000 x g durante 2 min e incubar à temperatura ambiente durante a noite.
   ATENÇÃO: os regentes utilizados para o ensaio seguinte atividade são altamente tóxicos. Use as recomendações de segurança específicas das respectivas fichas de segurança.
5. Por reacção enzimática, submergir o hidrogel em 1 ml de cocktail de reacção contendo N, diamina de N-dimetil-p-fenileno (5,8 mM), fenol (5,8 mM) e hidroperóxido de terc-butilo (2,9 mM) em n-heptano ^14. Interromper manualmente o gel utilizando uma ponteira para aumentar a área da superfície de contato do hidrogel e do solvente.
6. Detectar produto HRP, um corante do tipo indofenol, por medição da absorvância óptica de amostras tomadas a diferentes tempos a 546 nm num leitor de placas (Figura 5).

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Resultados

Um esquema para a formação do hidrogel de proteína intein mediada é apresentado na Figura 1A. Os blocos de construção de hidrogel são os copolímeros de proteína cuta-NpuN (N) e NpuC-S-cuta (C) (Figura 1A, Tabela 1). NpuN / C são os N-/C-fragments do DNAE dividir naturalmente intein de Nostoc punctiforme (NPU). Cuta é uma proteína trimérica estável de Pyrococcus horikoshii ^4,5. Mistura de purificada N e C, na presença do agente redutor DTT induz a forma...

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Discussão

Neste trabalho, nós demonstramos a síntese de uma proteína de hidrogel intein mediada altamente estável. O uso de uma divisão permite intein o hidrogel ser condicionalmente formada em resposta à mistura de dois componentes em fase líquida. Especificamente, a divisão intein covalentemente liga dois blocos em fase líquida através de uma reação de trans-splicing, produzindo uma unidade polipeptídeo ladeado por reticulação unidades que, por sua vez auto monta em um hidrogel. A formação induzida por...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Phusion High Fidelity DNA polymerase	New England BioLabs	M0530S
Competent Escherichia coli BL21 (DE3)	New England BioLabs	C2527I
Luria Bertani	VWR	90003-350
Bacto Agar Media	VWR
Kanamycin sulfate	VWR
IPTG	VWR	EM-5820
Imidazole	VWR	EM-5720
Urea	VWR	EM-9510
Dithiothreitol (DTT)	Fisher	BP172-5
Protease Inhibitor cocktail	Roche Applied Science	11836153001
DPBS	VWR	82020-066
Brilliant Blue R	Acros Organics	A0297990
Sodium Azide	Fisher	AC190380050	Caution, highly toxic
Horseradish peroxidase	Sigma	P8125-5KU
N,N-dimethyl-p-phenylene diamine	Fisher	AC408460250	Caution, highly toxic
phenol	Fisher	AC149340500	Caution, highly toxic
tert-butyl hydroperoxide	Fisher	AC180340050	Caution, highly toxic
n-heptane	Acros Organics	120340010
[header]
Shaker/Incubator	Fisher Scientific	Max Q 6000
Centrifuge	Sorvall	RC 6
Sonicator	QSonica	Misonix 200
Ultrafiltration Tubes	Amicon Ultra	UFC903024
Ni Sepharose High Performance HisTrap column	GE Healthcare Life Sciences	17-5248-01
HiTrap SP Sepharose FF ion exchange column	GE Healthcare Life Sciences	17-5156-01
Plate reader	Molecular Devices	SpectraMax Gemini EM