Синтез интеин-опосредованной искусственного белка гидрогеля

Резюме

Мы представляем синтез сплит-интеин опосредованного белка гидрогеля. Строительные блоки этом гидрогель две белковые Сополимеры каждая из которых содержит субъединицу тримерного белка, который служит в качестве сшивающего агента и одной половине разделенной интеина. Смешивание двух сополимеров белка вызывает интеин реакцию транс-сплайсинга, уступая полипептидную блок, объединяющаяся в гидрогеля. Этот гидрогель весьма рН и температуры стабильной, совместимый с органическими растворителями, и легко включает в себя функциональные глобулярных белков.

Аннотация

Мы представляем синтез высокостабильного гидрогеля белка при посредничестве сплит-интеин катализируемой белком реакции транс-сплайсинга. Строительные блоки этом гидрогель две белковые блок-сополимеры, содержащие каждый субъединицу тримерного белок, который служит в качестве сшивающего агента и одной половине разделенной интеина. Высоко гидрофильный статистического клубка вставлен в один из блок-сополимеров для удержания воды. Смешение двух блочных белок сополимеров вызывает интеин реакцию транс-сплайсинга, уступая полипептидную блок с сшивателей с обоих концов, что быстро объединяющаяся в гидрогеля. Этот гидрогель является очень стабильным при обеих кислотных и основных условиях, при температурах до 50 ° C, и в органических растворителях. Гидрогелевые быстро реформы после разрыва сдвига, вызванных. Включение в "Док-станция для пептида" в гидрогель строительного блока позволяет удобно включение «стыковки белка"-меченых белков-мишеней.Гидрогель совместим с роста среды культуры ткани, поддерживает диффузию молекул 20 кДа, и дает возможность иммобилизации биологически активных глобулярных белков. Применение интеин-опосредованного белком гидрогеля в качестве органического растворителя, совместимого биокатализатора была продемонстрирована путем инкапсуляции пероксидаза хрена фермента и подтверждающих его активность.

Введение

Гидрогели, сделанные полностью из белков нести потенциал, чтобы значительно продвинуться таких различных областях, как тканевой инженерии, доставки лекарств и biofabrication ^1. Они предлагают преимущества перед традиционными синтетические полимерные гидрогели включая биосовместимости и потенциал для неинвазивного поддержки включения биологически активных глобулярных белков.

В этой работе мы описываем развитие нового белка гидрогеля, образованного с помощью сплит-интеин опосредованного белка реакции транс-сплайсинга и его применение в качестве белка иммобилизации эшафот (рис. 1). Строительные блоки для этой гидрогеля два белка блок-сополимеры каждая из которых включает N-или С-концевой фрагмент раскола интеин (в и IC) и субъединицы мультимерного белка сшивателя. DnaE интеин от Nostoc punctiforme (НПУ) использовали в качестве раскола интеина ^2,3 и небольшой тримера белка (12 кДа) CutA от Pyrococcus horikoshii </ EM> был использован в качестве сшивающего агента белка ^4,5. Различные сшивающие агенты соединены через интеин катализируемой реакции транс-сплайсинга, что приводит к образованию высоко сшитого белкового (гидрогель). НПУ интеин был выбран из-за его быстро кинетики реакции (T _1/2 = 63 сек) и высоким выходом транс-сплайсинга (близко к 80%) ^2,3. Белок CutA был выбран в качестве сшивающего агента из-за его высокой стабильности. CutA тримеры иметь температуру денатурации ближайшем 150 ° С и удерживать тримерную структуру четвертичного в растворах, содержащих целых 5 М гуанидина гидрохлорид ^4,6. С субъединицы обмен между различными сшивателей является одной из основных причин физического гидрогеля эрозии поверхности ^7, очень сильное взаимодействие взаимодействие субъединицы в CutA должны препятствовать такие обмены субъединиц, что приводит к более стабильной гидрогеля. Один из этих блоков содержит также высоко гидрофильный пептид S-фрагмент в качестве середине блока, чтобы облегчить водуУдержание ^8.

Смешивание двух строительных блоков гидрогель инициирует реакцию транс-сплайсинга между IN и IC интеин фрагментов, создавая более длительный полипептидную цепь с сшивающими агентами на обоих терминалах. Сшивающие агенты из нескольких таких молекулярных единиц взаимодействуют друг с другом, образуя высоко сшитого сети гидрогеля (рис. 1А). Конкретный "док-станцией пептид" (DSP) включен в один из гидрогеля строительных блоков для облегчения стабильного иммобилизации "док" белка (DP)-меченый белок-мишень в гидрогеле. Использование раскола интеин опосредовать сборку гидрогеля не только обеспечивает дополнительную гибкость для синтеза белка гидрогель, но также обеспечивает высокую плотность, равномерную загрузку целевого белка в течение всего гидрогеля, как целевые белки загружены до образования гидрогеля.

Белок гидрогель интеин опосредованного весьма станцииBLE в водном растворе с небольшим до исключения любых эрозии после 3 месяцев при комнатной температуре. Стабильность сохраняется в широком диапазоне рН (6-10) и температурах (4-50 ° С), а гидрогель также совместим с органическими растворителями. Этот гидрогель используется для иммобилизации двух глобулярных белков: зеленый флуоресцентный белок (GFP) и пероксидазы хрена (HRP). Гидрогель улавливания последний белок используется для выполнения Биокатализ в органическом растворителе.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

1. Плазмиды Строительство

ПРИМЕЧАНИЕ: Все гены были усилены при стандартных реакций ПЦР с использованием Phusion High-Fidelity ДНК-полимеразы согласно спецификациям изготовителя. Праймеры, используемые для клонирования были описаны ранее ^9. Все конструкции приведены в таблице 1.

1. Для генерации CutA-NpuN (N, Таблица 1):
   1. ПЦР-амплификации CutA и NpuN гены от плазмид pET30-CutA-Tip1 ¹⁰ и KanR-IntRBS-NpuNC-CFN ^11, соответственно, с использованием соответствующих праймеров.
   2. Дайджест эти фрагменты с соответствующими ферментами рестрикции и последовательно вставить эти фрагменты в вектор pET26b между промотором Т7 и С-концевой 6xHistidine тега, чтобы генерировать N (рис. 2а).
2. Для генерации NpuC-S-CutA (С, Таблица 1):
   1. ПЦР-амплификации NpuC, CutA и S фрагментацият [AG ₃ (ПЭГ)] ₁₀ из плазмиды KanR-IntRBS-NpuNC-CFN ^11, pET30-CutA-Tip1 ¹⁰ и ₁₀ переменного тока pQE9 РППА ^12, соответственно, с использованием соответствующих праймеров.
   2. Дайджест эти фрагменты с соответствующими ферментами рестрикции и последовательно вставить эти фрагменты в вектор pET26b между промотором Т7 и С-концевой 6xHistidine, чтобы генерировать C (фиг.2В).
3. Для генерации NpuC-S-SH3 _{Лига-CutA} (С-SH3 _Лига, таблица 1):
   1. ПЦР-амплификации CutA с использованием праймеров, содержащих SH3 _Лига (PPPALPPKRRR) и гибкий линкер (GGGGS) ₂ генерировать фрагмент SH3 _{Лига-CutA.}
   2. Замените ген CutA от C с фрагмент SH3 _{маяк-CutA.}
4. Для генерации SH3-GFP (табл. 1):
   1. Амплификации гена SH3 из плазмиды pJD757 ^13, используясоответствующие грунтовки.
   2. Предохранитель этот фрагмент с геном GFP и вставьте ее в вектор pET26b между промотором Т7 (рис. 2С) и С-концевой 6xHistidine тега.

2. Экспрессия белка

1. Преобразование 50 мкл компетентного химически кишечной палочки BL21 (DE3) с соответствующей экспрессионной плазмиды.
2. После трансформации серийно разбавленных эти клетки, и пластины их на Лурии-Бертани (LB) / агаровые пластинки, содержащие 50 мкг / мл канамицина.
3. Инкубируют планшеты, содержащие трансформированные клетки при 37 ° С в течение ~ 15 часов.
4. После инкубации выбрать пластину, содержащую 50-100 колоний и ресуспендируют всех колоний в 5 мл LB бульоне.
5. Передача подвеска на 1 л LB бульоне, содержащем канамицин (50 мкг / мл) и клетки расти при 37 ° С при встряхивании при 250 оборотах в минуту. Монитор оптической плотности при 600 нм (OD _600). не расти культуру, пока OD ₆₀₀ ~ 0,8.
   1. Для C и C-SH3 _LIG, индуцируют экспрессию белка добавлением изопропилового β-D-1-тиогалактопиранозида (IPTG) в культуре (1 мМ конечной концентрации) и инкубируют культуры при 37 ° С в течение 4 часов при встряхивании со скоростью 250 оборотов в минуту.
   2. Для N и SH3-GFP, охладить культуру ~ 18 ° C путем погружения культуральной колбы на бане с ледяной водой для ~ 5 мин. Индуцируют экспрессию белка путем добавления IPTG к культуре (1 мМ конечной концентрации) и инкубируют культуры при 18 ° С в течение 14-18 часов при встряхивании со скоростью 250 оборотов в минуту.
6. После экспрессии белка, центрифуге культуры в 6000 х г в течение 20 мин при 4 ° С, чтобы собрать осадок. Магазин клеточный осадок при -80 ° С до использования.

3. Protein Purification

1. Очистка N (денатурирующих условиях)
   1. Ресуспендируют осадок клеток в буфере А (табл. 2) при 10 мл / г влажного гранул.
   2. Иммерсе пеллет суспензии на лед ной бане и разрушать клетки путем обработки ультразвуком (Amp 10, с 1 сек импульса и паузы 6 сек в течение 1 мин).
   3. Центрифуга лизата при 16000 х г в течение 20 мин при 4 ° С.
   4. Удалите супернатант. Ресуспендируют гранул в буфере DA (содержащий 8 М мочевину) и центрифуги суспензии при 16000 мкг в течение 20 мин при 4 ° С.
   5. Pass супернатанта через колонку с 5 мл Ni-нитрилотриуксусной кислоты (NTA), предварительно уравновешенную буфером DA.
   6. Столбец Промыть 30 мл буфера DA дополненной 45 мМ имидазола. Элюции очищенного белка с использованием 20 мл буфера с добавлением DA 150 мМ имидазола.
   7. Уменьшение концентрации мочевины в образце белка, чтобы <1 мм либо одним из следующих методов, указанных в 3.1.7.1 или 3.1.7.2:
      1. Диализировать белка в DPBS буфера (табл. 2) при 4 ° С в течение ночи с использованием трубки с <20 кДа отсечкой.
      2. Центрифуга очищенного белка в 30 & #160; кДа ультра-фильтрации колонка спин при 2800 х г, 4 ° С, пока объем не менее 1 мл. Добавить 14 мл DPBS буфера в колонну для разбавления образца белка. Повторите центрифугирования / разведение шаги еще три раза.
   8. После замены буфера добавить дитиотреитола (DTT) в очищенного белка (конечная 2 мм) и белкового концентрата до ~ 100 мг / мл центрифугированием через 30 кДа ультра-фильтрации колонку вращаются на 2800 мкг, 4 ° С.
   9. не Аликвотировать концентрированный белок и хранить при -80 ° С до использования.
2. Очистка C и C-SH3 _LIG (родной условие)
   1. Ресуспендируют осадок клеток в буфере B (рН 6,0) (табл. 2) с добавлением 1x коктейль ингибитора протеазы на 10 мл / г влажного гранул. С помощью кислотного буфера, чтобы минимизировать протеолитический распад белка-мишени.
   2. Лишить клеточной суспензии ультразвуком, как описано в п. 3.1.2. Центрифуга Lysели 16000 х г в течение 20 мин при 4 ° С и сохранить супернатант.
   3. Пропускают растворимый лизат через 5-мл колонке Ni-NTA, предварительно уравновешенную буфером В.
   4. Wash колонка с буфером B с добавлением 45 мМ имидазола, и элюирования целевого белка в 20 мл буфера В с добавлением 150 мМ имидазола.
   5. Для C, перейдите к шагу 3.2.6. Для С-SH3 _LIG, провести дополнительную ионообменной стадию очистки для удаления частично деградированных белок, как указано в пунктах 3.2.5.1 для 3.2.5.3
      1. Снизить концентрацию NaCl в С-SH3 _LIG к <1 мм в соответствии с процедурой, описанной в п. 3.1.7.
      2. Загрузка целевого белка на мл анионит бисером агарозном колонке 5 матрицы, предварительно уравновешенную фосфатным буфером натрия (50 мМ, рН 7,0).
      3. Элюировать целевой белок из колонки с помощью градиента работает из раствора, содержащего 10 мМ Трис-HCl, рН 8,0 bufféR к раствору, содержащему тот же буфер с добавлением 1 М NaCl. Отбирают образцы в течение белка элюирования и образцы бассейна с высокой чистоты на основе додецилсульфат полиакриламидного гель-электрофореза натрия (SDS-PAGE).
   6. Буферного обмена очищенного белка в DPBS буфера, как описано в 3.1.7.
   7. Добавить DTT к очищенного белка (конечная концентрация 2 мМ) и концентрат белка до ~ 100 мг / мл с использованием ультрафильтрации спин колонки 30 кДа, как описано в 3.1.8. Аликвоты и хранят концентрированного белкового при -80 ° С до использования.
3. Очистка SH3-GFP
   1. Ресуспендируют осадок клеток с использованием буфера А при 10 мл / г влажного гранул.
   2. Лишить гранул подвеску с помощью ультразвука, как описано в п. 3.1.2.
   3. Центрифуга лизата при 16000 х г в течение 20 мин при 4 ° С и собирают супернатант.
   4. Pass супернатанта (растворимый лизат) с помощью 5-мл колонке Ni-NTA, предварительно уравновешеннуюБуфер А.
   5. Промывной колонны 30 мл буфера А с добавлением 45 мМ имидазола. Элюции очищенного белка с использованием 20 мл буфера А с добавкой 150 мМ имидазола.
   6. Буферного обмена очищенного белка в DPBS буфера, используя подход, аналогичный тому, который описан в 3.1.7 и концентрат белка до ~ 150 мг / мл с использованием ультрафильтрации спин колонки 30 кДа, как описано в 3.1.8.
   7. Аликвоты и хранят очищенный белок при -80 ° С до использования.
4. Анализ с помощью ДСН-ПААГ очищенных образцов, содержащих CutA
   1. Развести каждый очищенного белка в дважды дистиллированной воды, чтобы уменьшить концентрацию NaCl до ~ 1 мМ. При этой концентрации NaCl, большинство белков CutA тримера работать в качестве мономеров на ПААГ с ДСН.
   2. Смешайте образцы с 2x SDS буфере для образцов (0,5 М Трис-HCl, рН 6,8, 20% глицерина, 10% вес / объем ДСН, 0,1% вес / объем бром-фенола синий, 2% β-меркаптоэтанола), инкубировали при 95 ° С в течение 5 мин.
   3. Загрузите СэмаPles на 12% SDS-PAGE гель. Провести электрофорез при постоянном напряжении 200 В для ~ 50 мин.
   4. Заметим, белок в геле при окрашивании кумасси бриллиантовым голубым R250 следующие стандартные протоколы (рис. 1с).

4. Гидрогель Формирование

Примечание: Пример гидрогели, сделанные в этом исследовании содержится 1,6 мМ каждого из гидрогеля строительного блока, если не указано иное. Эта концентрация белка дает мягкий и стабильный гидрогель. ВНИМАНИЕ: азид натрия (NaN ₃₎ добавляют в гидрогеле до конечной концентрации 0,5% вес / об, чтобы предотвратить бактериальное заражение. NaN ₃ является высокотоксичным и должны быть обработаны с особой тщательностью, как указано в паспорте безопасности продукта.

1. Рассчитать объем для каждого из сконцентрированных белков, необходимых для достижения конечной концентрации 1,6 мМ в 100 мкл образца гидрогеля. Например:
   Концентрация N:100 мг / мл
   Молекулярная масса N: 26,3 кДа (см. таблицу 1)
   Желаемый Объем: 100 мкл Желаемый Концентрация: 1,6 мм
   
2. Чтобы сделать 100 мкл гидрогель (1,6 мм), перемешивают С (х мкл, объем рассчитывается по 4,1) с 5% NaN ₃ (10 мкл), 100 мМ DTT (5 мкл) и N (Y мкл, объем вычисляются в соответствии с 4.1) внутри стеклянного флакона 2 мл.
3. Добавить DPBS буфер ((85 - х - у) мкл) в пробирку для достижения конечного объема 100 мкл, и вручную смешивать все компоненты через вихревое движение с помощью пипетки. Примечание: раствор становится очень вязким при смешивании.
4. Центрифуга смесь в течение 2 мин при 8000 мкг, чтобы удалить пузырьки воздуха.
5. Выдержите смесь при комнатнойТемпература ночь, чтобы реакция интеин транс-сплайсинга достичь к завершению. Подтвердите образование гидрогеля, повернув трубку с ног на голову. Белки не будет течь, если гидрогель образуется.
6. Расчетный выход интеин транс-сплайсинга, проверяя образцы (0,5 мкл каждый), собранных перед стадией 4,2 и 4,5 после шага на SDS-PAGE геле, как описано в 3,4 (рис. 1в).

5. Иммобилизация GFP через док-белка (DP) и док-станции пептид (DSP) Взаимодействие

1. Чтобы 50 мкл GFP функциональными гидрогель с (1.2 мм), объединить С-SH3 _Лига (х мкл, рассчитывается в соответствии с 4.1) и SH3-GFP (у мкл, рассчитывается в соответствии с 4.1) в молярном соотношении 1:1 в 1,7 трубки микроцентрифужных мл и инкубируют смесь при комнатной температуре в течение 30 мин.
2. Добавить 5% NaN ₃ (5 мкл), 100 мМ DTT (2,5 мкл), (42.5 - х - у) мкл DPBS в той же пробирке. Добавить п (у мкл, рассчитанный в соответствии с 4.1) для достижения 1:01 молярное отношение N и С-SH3 _LIG. Смешайте образец с помощью пипетки на вихревое движение.
3. Центрифуга смеси при 8000 х г в течение 2 мин и инкубировать смеси при комнатной температуре в течение ночи в темноте. Гидрогель инкапсуляции SH3-GFP формы во время инкубации.

6. Использование 1,6 мм гидрогеля в качестве иммобилизации строительные леса для ферментативной реакции в органическом растворе

1. Используйте HRP как модель фермента. Подготовка исходного раствора HRP (28 мг / мл или 0,63 мМ) в DPBS.
2. Чтобы сделать 30 мкл гидрогель (1,6 мм) улавливания HRP, комбинат С (х мкл, рассчитывается в соответствии с 4.1) с HRP (2 мкл), 5% NaN ₃ (3 мкл) и DVB-T (1,5 мкл 100 мМ) внутри 1,7 мл центрифужные пробирки.
3. Добавить п (у </ EM> мкл, рассчитывается в соответствии с 4.1) и DPBS (23,5 - х - у) мкл. Смешайте с кончика пипетки с вихревое движение.
4. Центрифуга смеси при 8000 х г в течение 2 мин и инкубировали при комнатной температуре в течение ночи.
   ВНИМАНИЕ: регенты, используемые для следующей анализа активности являются высокотоксичными. Используйте конкретные рекомендации по обеспечению безопасности на соответствующие Сертификаты безопасности материалов.
5. Для ферментативной реакции, погрузите гидрогель в 1 мл коктейля реакции, содержащих N, N-диметил-п-фенилендиамина (5,8 мм), фенол (5,8 мм) и трет-бутилгидропероксид (2,9 мм) в н-гептана ^14. Вручную нарушить гель с использованием пипетки, чтобы увеличить площадь контактной поверхности гидрогеля и растворителя.
6. Обнаружение HRP продукт, в индофеноле типа красителя, путем измерения оптической поглощение образцов, взятых в разное время при 546 нм в ридере (рис. 5).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Схема для интеин-опосредованного формирования белок гидрогель представлен на фиг.1А. Строительные блоки гидрогеля являются белок сополимеры CutA-NpuN (N) и NpuC-S-CutA (C) (рис. 1А, таблица 1). NpuN / C являются N-/C-fragments из естественно разделить DnaE интеин от Nostoc punctiforme (НПУ). CutA является с...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

В этой работе мы показали, синтез высокостабильного интеин-опосредованной белка гидрогеля. Использование раскола интеин позволяет гидрогель быть условно образованный в ответ на смешении двух жидкофазных компонентов. В частности, раскол интеин ковалентно связывает два жидкофазных с?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Phusion High Fidelity DNA polymerase	New England BioLabs	M0530S
Competent Escherichia coli BL21 (DE3)	New England BioLabs	C2527I
Luria Bertani	VWR	90003-350
Bacto Agar Media	VWR
Kanamycin sulfate	VWR
IPTG	VWR	EM-5820
Imidazole	VWR	EM-5720
Urea	VWR	EM-9510
Dithiothreitol (DTT)	Fisher	BP172-5
Protease Inhibitor cocktail	Roche Applied Science	11836153001
DPBS	VWR	82020-066
Brilliant Blue R	Acros Organics	A0297990
Sodium Azide	Fisher	AC190380050	Caution, highly toxic
Horseradish peroxidase	Sigma	P8125-5KU
N,N-dimethyl-p-phenylene diamine	Fisher	AC408460250	Caution, highly toxic
phenol	Fisher	AC149340500	Caution, highly toxic
tert-butyl hydroperoxide	Fisher	AC180340050	Caution, highly toxic
n-heptane	Acros Organics	120340010
[header]
Shaker/Incubator	Fisher Scientific	Max Q 6000
Centrifuge	Sorvall	RC 6
Sonicator	QSonica	Misonix 200
Ultrafiltration Tubes	Amicon Ultra	UFC903024
Ni Sepharose High Performance HisTrap column	GE Healthcare Life Sciences	17-5248-01
HiTrap SP Sepharose FF ion exchange column	GE Healthcare Life Sciences	17-5156-01
Plate reader	Molecular Devices	SpectraMax Gemini EM