Modelos DNBS / TNBS colitis: Proporcionar ideas sobre la enfermedad inflamatoria intestinal y efectos de la grasa en la dieta

Resumen

DNBS / TNBS colitis inducida ofrece un método alternativo y barato para estudiar la patobiología de la enfermedad inflamatoria del intestino. El protocolo descrito en este documento se describen la aplicación exitosa de DNBS para inducir la colitis en ratones y ratas y permite estudiar a fondo las respuestas intestinales mediados por el huésped.

Resumen

Enfermedades inflamatorias del intestino (IBD), incluyendo enfermedad de Crohn y la colitis ulcerosa, se han asociado con una base genética, y más recientemente respuestas inmunes del huésped a los agentes microbianos y ambientales. Colitis Dinitrobenceno ácido sulfónico (DNBS) inducida permite estudiar la patogénesis de la EII desencadenantes ambientales asociados, tales como el estrés y la dieta, los efectos de las terapias potenciales, y los mecanismos de la inflamación de la mucosa intestinal y lesión subyacente. En este trabajo, hemos investigado los efectos de los ácidos n-3 y n-6 ácidos grasos de la dieta sobre la respuesta inflamatoria de la mucosa del colon a la colitis inducida por DNBS en ratas. Todas las ratas fueron alimentadas con dietas idénticas con la excepción de los diferentes tipos de ácidos grasos [aceite de cártamo (SO), aceite de canola (CO), o el aceite de pescado (FO)] durante tres semanas antes de la exposición a intrarrectal DNBS. Las ratas de control dadas etanol intrarectal continuaron ganando peso durante el estudio 5 días, mientras que, las ratas tratadas con dietas lipídicas DNBS alimentados todo el lost de peso con FO y CO alimentado ratas demuestra la pérdida de peso significativa en un 48 hr y las ratas alimentadas SO por 72 hr. El aumento de peso se reanuda a las 72 h después de DNBS, y por 5 días después DNBS, el grupo FO tenido un mayor peso corporal que los SO o grupos CO. Secciones del colon recogieron 5 días después de DNBS-tratamiento mostró ulceración focal, destrucción cripta, el agotamiento de células caliciformes, y la infiltración mucosa de células inflamatorias tanto agudas y crónicas que difieren en gravedad entre los grupos de la dieta. El grupo SO alimentado mostró el daño más severo seguido por el CO, y FO alimenta grupos que mostraron el grado más leve de lesión de los tejidos. Del mismo modo, la mieloperoxidasa del colon (MPO) la actividad, un marcador de la actividad de los neutrófilos fue significativamente mayor en SO seguido de ratas CO alimentados, con FO ratas alimentadas tener significativamente menor actividad de MPO. Estos resultados demuestran el uso de la colitis inducida por DNBS, tal como se describe en este protocolo, para determinar el impacto de la dieta en la patogénesis de la EII.

Introducción

La enfermedad inflamatoria intestinal (EII) se caracteriza por la inflamación crónica recidivante en el tracto gastro-intestinal (GI), que resulta en síntomas de la diarrea, la pérdida de peso y dolor abdominal. La colitis ulcerosa (CU) y la enfermedad de Crohn (CD) son las dos formas principales de la EII, y se pueden distinguir por la ubicación de la inflamación en el tracto GI. En los pacientes con CU, la inflamación suele afectar el recto y se extiende de forma contigua a los dos puntos por un grado variable que afecta sólo a la mucosa superficial. En contraste, el CD puede afectar cualquier parte del tracto GI, aunque afecta predominantemente el íleon y ciego. CD se manifiesta frecuentemente como inflamación transmural asocia a menudo con granulomas y que conduce a estenosante (fibroestenótica) y / o penetrante (fistulizante) enfermedad. Aunque la etiología de la EII sigue siendo difícil de alcanzar, es bien aceptado que la EII es multifactorial, que implica interacciones entre los hosts del sistema inmune, susceptibilidad genética y responses a los factores ambientales y microbianos.

Hasta la fecha, se han propuesto diferentes modelos de IBD que mostrar varias respuestas clínicas, histológicas e inmunológicas propias de CU y EC. Los modelos más utilizados son ratones modificados genéticamente (, IL-10, SAMP / Yit IL-2), modelos inducidos infección (rodentium Citrobacter, Salmonella typhimurium), modelos de transferencia adoptiva (CD45 + RB altos, de transferencia de células CD62L + en ratones SCID) y modelos de colitis inducida químicamente (dextrán sulfato sódico (DSS), ácido sulfónico trinitrobenceno (TNBS), y ácido sulfónico dinitrobenceno (DNBS)). Debido a su bajo coste y rápida aparición de la enfermedad, los modelos químicos se consideran de gran valor para el estudio de diversos aspectos de la EII. Cada uno de los modelos de colitis químicos enumerados tienen ventajas y limitaciones en algunos aspectos de su clínica, inmunológica e histopatológico relevancia para la EII. DSS es uno de los métodos químicos más comunes empleadas para inducir coliTIS en los roedores ^1. Administración de 3-10% de DSS (PM: 42 kDa) durante 7-10 días en el agua de bebida de los ratones puede inducir síntomas y signos de colitis incluyendo pérdida de peso, diarrea con sangre, acortamiento del colon, ulceración de la mucosa y la infiltración de neutrófilos. Este modelo es particularmente útil para los estudios de cribado de fármacos, así como explorar los mecanismos de regeneración epitelial, el impacto de la inmunidad innata en la homeostasis de la mucosa, y el papel de la inflamación en la promoción de la displasia intestinal y el desarrollo de adenocarcinoma. Sin embargo, hay algunos inconvenientes a la modelo DSS, incluyendo la variación en la concentración de DSS es necesario para inducir la colitis en diferentes instalaciones de los animales, así como la captación de agua está irregular por los ratones y la exposición tanto, contrarios al DSS, lo que resulta en la variación en el grado, la extensión y distribución de lesión de la mucosa y ulceración en el colon. Todas estas características dan lugar a la heterogeneidad de los resultados y limitan la capacidad para comparar los resultados entre los estudios frdiferentes grupos de investigación de la OM.

Una alternativa al modelo DSS es los DNBS inducida hapteno-o modelos de colitis TNBS. Este modelo emplea la instilación rectal de la mucosa sensibilizar a agentes DNBS o TNBS, diluido en diferentes concentraciones de etanol. La administración de etanol es un requisito previo para romper la barrera de la mucosa del colon para permitir la penetración de DNBS o TNBS en la lámina propia. DNBS / TNBS entonces haptenize las proteínas del colon y del intestino microbianos localizados a ser inmunogénica, iniciando así el anfitrión innata y la respuesta inmune adaptativa. En general, este modelo se asocia con graves y algunas veces diarrea con sangre, pérdida de peso y engrosamiento de la pared intestinal sin embargo los síntomas varían dependiendo del tipo de roedor utilizado, así como el tiempo, la dosis y el grado de exposición a la DNBS o TNBS utilizado en la estudio. Distinciones importantes entre las ratas y ratones deben tenerse en cuenta, con las ventajas de menor costo para la compra y comida, así como lower de masa corporal para la disminución de los costos por los animales del tratamiento in vivo. Esto debe situarse en el curso más rápido y severo de colitis en ratones, donde los animales más frágiles y sensibles pueden llegar rápidamente a un punto final de la integridad personal.

La inflamación intestinal inicialmente resulta de etanol daño inducido a las células epiteliales intestinales, dando lugar a aumento de la permeabilidad epitelial, la penetración microbiana en la mucosa, haptenización de proteínas del huésped, todo esto resulta en la infiltración de neutrófilos, macrófagos y linfocitos T Th1 en la mucosa dañada. En comparación con DNBS, TNBS se considera una sustancia química peligrosa, debido a sus propiedades altamente oxidantes que pueden suponer un riesgo de explosión en contacto con bases, tales como el sodio y el hidróxido de potasio. Por lo tanto DNBS es considerada actualmente como una opción preferente de productos químicos sobre TNBS para inducir colitis. En los roedores, DNBS colitis es considerado como uno de los métodos más convenientes para estudiar los siguienala IBD modificadores de la enfermedad asociada:

1. La depresión y la reactivación de la colitis: Se ha demostrado que el estrés, la ansiedad y la depresión en los pacientes con EII son frecuentemente asociados con la recaída de la enfermedad. DNBS colitis es un modelo adecuado para estudiar el papel de la depresión y sus consecuencias sobre la reactivación de la colitis en ratones. El método implica típicamente la inducción inicial de la colitis por DNBS, seguido por la resolución de la colitis por dejando los ratones durante 6-8 semanas. Los ratones se administran entonces con agentes depresión causando tales como reserpina o por bulbectomy olfativa para inducir depresión seguido por pruebas de ellos para la reactivación de la colitis través de desafío con una dosis subcolitic de DNBS ^2.
2. El estrés y la reactivación de la colitis: El estrés es otro factor ambiental común que se ha vinculado a la patogénesis de la EII. Hay un creciente cuerpo de evidencia que sugiere una fuerte asociación entre el estrés crónico y la aparición de los síntomas de la UC y la CD en roedoress, así como en los seres humanos y los primates no humanos ^3. DNBS la colitis es un buen modelo para estudiar la reactivación de estrés asociada de la colitis en ratones y ratas. El método se emplea generalmente en una manera similar como se mencionó anteriormente para la depresión, excepto en el lugar de la depresión, los animales están expuestos a factores de estrés tales como Sonic y tensión de restricción ^4.
3. La inflamación neurogénica: Un número de estudios han descrito ya sea alteraciones transitorias o permanentes en el sistema nervioso entérico (ENS) estructura y la función, como se ve en muestras de tejido de modelos animales y de pacientes con EII. DNBS es un buen modelo para estudiar los efectos de la inflamación en la ENS ⁵ y estudiar tanto noradrenérgica y vías neuronales colinérgicas ^6.
4. Los mecanismos de lesión-reparación: Durante la EII patogénesis, mediadores de lesiones derivadas del huésped tales como especies de oxígeno reactivo (ROS), óxido nítrico (NO), molécula de adhesión intercelular 3 (ICAM-3), y P-selectina se han mostrado a Psentar un papel en las alteraciones del epitelio intestinal. DNBS es un excelente modelo para estudiar las lesiones causadas por la sobre regulación de estos mediadores, así como los mecanismos de reparación que se regulan mediante el uso de fármacos selectivos o inhibidores de ^7,8.
5. Inflamación transmural: Además de las aplicaciones de DNBS mencionados anteriormente, el modelo también se puede aplicar para estudiar la inflamación transmural del intestino, una característica clásica encontrado en pacientes con EC. Ambos DNBS y la colitis inducida por TNBS se asocian con la infiltración significativa de linfocitos, en la mucosa del colon haciendo estos modelos particularmente útiles para estudiar los mecanismos inmunes dependientes de células T.

En comparación con el modelo de DSS, las ventajas de DNBS y la colitis inducida por TNBS incluyen bajo costo, el rápido desarrollo de la colitis (por lo general requiere de 1-3 días para mostrar ulceración reproducible y la inflamación) y daños localizados consistente para el colon distal. Sin embargo, los inconvenientes son un requisito para unamayor nivel de conocimientos técnicos, la optimización de la dosis DNBS / TNBS, y la necesidad de anestesia para la administración rectal.

En este trabajo metodológico se estudiaron los efectos de diferentes concentraciones de n-6 y n-3 ácidos grasos poliinsaturados en la alteración de la respuesta de la mucosa del colon a la colitis inducida por DNBS en ratas mediante el aceites vegetales aceite de cártamo (SO) y el aceite de canola (CO) , y aceite de pescado (FO). Se ha demostrado que los ácidos n-6 y n-3 grasos son importantes mediadores de la enfermedad inflamatoria intestinal a través de su papel como restos acilo de fosfolípidos de la membrana celular ^9. En contraste con el potencial proinflamatorio de los ácidos grasos n-6, ácidos grasos n-3 en suficientemente alta ingesta son potencialmente agentes anti-inflamatorios potentes. Las acciones antiinflamatorias de los ácidos grasos n-3 están mediados directamente a través de la sustitución de ácido araquidónico como un sustrato de eicosanoides, inhibiendo el metabolismo del ácido araquidónico y indirectamente a través de la alteración de proinflla expresión génica proinflamatoria y la señalización celular. Los ácidos grasos n-3 también dan lugar a resolvinas, una familia de mediadores antiinflamatorios. La alta ingesta de ácidos grasos n-3 se asocia con una disminución en la producción de eicosanoides proinflamatorios, citocinas, quimiocinas, especies reactivas de oxígeno y la expresión de moléculas de adhesión. En este estudio, las ratas fueron alimentadas con dietas ad libitum idénticos en todos los nutrientes, excepto ácidos grasos, con una energía como por ciento de grasa, 20% de SO, 20% de CO, o 18% de aceite de pescado más 2% de aceite de cártamo (FO) ^10-11 . Como porcentaje de la energía diaria, la dieta SO proporciona 15% de ácido linoleico (LA), con <0,06%-α-linolénico (ALA) y no el ácido eicosapentaenoico (EPA) o el ácido docosahexaenoico (DHA), la dieta CO tenía 4,2 % LA y ALA 1,9% sin la EPA o DHA, y la dieta FO proporcionaron 1,4% de EPA, DHA 4,9%, 0,32% LA, y el 0,12% de ALA. Tres semanas después de la iniciación de las dietas de lípidos, los ratones se les administró DNBS intrarrectal o etanol al 50% y se sacrificaron 5 días después. La inflrespuesta amatorio se evaluó mediante la evaluación de la pérdida de peso, los resultados histológicos de daño y la actividad mieloperoxidasa de tejido.

Protocolo

Los procedimientos que implican sujetos animales siguen las pautas de cuidado de animales expuestos por el Cuidado de Animales y el empleo Comisión Institucional (IACUC) de la Universidad de British Columbia.

Procedimientos mencionados en este protocolo se describen para ratas y ratones, mientras que los resultados representativos se presentarán a partir de ratas Sprague-Dawley.

1. Preparación de DNBS y administración intrarrectal

1. Para la instilación rectal de DNBS en ratas, recién preparar 15-30 mg de DNBS/250 l de etanol al 50%. Para los ratones, prepare 2-6 mg de DNBS/100 l de etanol al 50%. Nota: Optimizar la concentración exacta DNBS para ser administrado en cada instalación. Ratas macho Sprague-Dawley, y C57BL / 6 ratones se prefieren para la inducción de la colitis con DNBS, sin embargo otras cepas de ratón y de rata se pueden utilizar. Los ratones y las ratas tratadas sólo con etanol al 50% se pueden utilizar como grupos de control sin embargo, dados los efectos de etanol son leves o ausente, se puede OMIt la inclusión de este grupo de estudio ^12.
2. Conecte una jeringa de 1 ml con una aguja 19 que tiene un catéter de polietileno (PE-90 - ratas o PE-50 - ratones) fijado a su fin.
3. Ligeramente anestesiar la rata o el ratón que descansa sobre una almohadilla eléctrica (por ejemplo, mediante la administración de 1,5% de isoflurano a través de cono de la nariz, los animales deben tener todavía un abrir y cerrar y los reflejos de deglución y mostrar la respiración regular). Aplique el gel lágrima a sus ojos para evitar los ojos se sequen.
4. Suavemente aplique presión con los dedos para el extremo posterior del animal para eliminar cualquier materia fecal que puede estar presente en el colon distal.
5. Introduzca suavemente el catéter por vía rectal, con el catéter alcanza aproximadamente 8 cm proximal al ano para las ratas, o 3-4 cm para ratones. Inyectar una pequeña cantidad de la solución mientras se inserta el catéter para lubricar, lo que permite una inserción más fácil. Nota: Si se siente resistencia al insertar el catéter, no continúe para insertar ya que esto puede conducir a la perforación dela pared intestinal. Retire el catéter e intentar volver a insertar suavemente, de nuevo lubricante del colon como proceder.
6. Lentamente inyectar 250 (ratas) o 100 (ratones) l de DNBS, o un volumen igual o etanol al 50% para los controles. Después de inyectar la DNBS, coloque el animal cabeza abajo durante 90 segundos para evitar la pérdida de la DNBS.
7. Después de la administración DNBS, alimentar a los animales 8% de agua de sacarosa en 0,2% de solución salina para prevenir la deshidratación durante la primera semana.
8. Observe cuidadosamente a los animales, con un seguimiento diario de la pérdida de peso y signos de deshidratación o malestar durante la duración del experimento. Nota: La pérdida de peso puede acercarse rápidamente las recomendaciones del CCPA de la pérdida de peso máximo autorizado. Desde esta mayoría deriva de la deshidratación, pérdida de peso debe ser utilizado como un indicador para la administración de solución de Ringer lactato para limitar la deshidratación. Por favor, asegúrese de consultar con el veterinario instalación en temas de salud, según proceda.

2. Collecting tejidos y Evaluación de daño histológico en DNBS ratones retados

1. En el punto de tiempo deseado después del desafío con DNBS, la eutanasia a los animales por sobredosis de isoflurano en una cámara de anestesia suplementado con suficiente oxígeno. Observar el animal hasta que se vea ninguna subida o de bajada del pecho y no hay latidos cardiacos palpable. Confirme que el animal ha sido sacrificado correctamente por la ausencia de una respuesta a pizca dedo del pie o conmovedora de la córnea, seguido por dislocación cervical.
2. Abra la cavidad abdominal y eliminar todo el intestino grueso. Abra el intestino longitudinalmente; úlceras de la mucosa macroscópicas deben ser observados aproximadamente 5-6 cm proximal desde el extremo distal del colon en ratas (2-3 cm en ratones). Nota: Después de retirar el intestino grueso, evaluar puntuaciones de daño macroscópico si se desea. Introducir las secciones de colon desde correspondiente localización anatómica de los animales de control. Nota: Las personas que califican el tejido para las puntuaciones de daño macroscópico debeser cegados a la identidad de los grupos de tratamiento. Puntuación secciones de tejido usando las siguientes o similares criterios: gravedad y el alcance de la ulceración (0-10), sumadas las puntuaciones de la ausencia o presencia de diarrea (0 ó 1), adherencias (0, 1, o 2) y el espesor de la pared del colon máxima en milímetros ^11.
3. Recoger 0,5 cm secciones proximal al sitio de daño macroscópico máxima. Snap congelar una sección de 0,5 cm en nitrógeno líquido para evaluar posteriormente la actividad mieloperoxidasa (MPO) (una medida de la infiltración de neutrófilos), y coloque la otra sección en el 10% formalina tamponada neutra para el análisis histológico. Nota: Encajar tejidos congelados para el ensayo de mieloperoxidasa se puede almacenar a -80 ° C durante un máximo de 1 mes.
4. Permita que los tejidos recogidos para el análisis histológico en el paso 2.3 para fijar en formol durante la noche, y luego se lavan con etanol al 70%. Incrustar tejidos en parafina y corte con el espesor deseado (3-5 micras), tinción con hematoxilina y eosina (HE) para la puntuación histológica.
5. Haga que dos observadores anotan al menos tres secciones de tejido de cada animal bajo un microscopio óptico para determinar las puntuaciones de los daños histológicos para cada grupo. Nota: Las personas que califican el tejido para las puntuaciones de los daños histológicos deben ser cegados a la identidad de los grupos de tratamiento. Puntuación secciones de tejido usando los siguientes o similares criterios: Extensión de infiltrado de células inflamatorias (0 = ausente, 3 = transmural), pérdida de la arquitectura de la mucosa (0 = ausente, 3 = grave), la presencia o ausencia de abscesos en las criptas (0-1) , y el agotamiento de las células caliciformes (0-3). Determinar puntaje daño histológico como la suma de estas puntuaciones ^11.

3. Realización de mieloperoxidasa (MPO) Ensayo sobre DNBS Desafiado tejido intestinal

1. Actividad MPO ensayo en los 0,5 cm segmentos colónicos obtenidos en la etapa 2.3. Homogeneizar los tejidos en tampón de homogeneización MPO (0,5% de bromuro de hexadeciltrimetil-amonio en tampón fosfato de potasio 50 mM (pH 6,0)) para dar un SEGME de colon 50 mgnt / ml de tampón de homogeneización suspensión.
2. Alícuota de la solución homogeneizada en porciones de 1 ml y centrifugar a 4 ° C durante 2 min a 10.000 x g.
3. Mezclar 100 l de cada alícuota con 2,9 ml de 50 mM de tampón de fosfato (pH 6,0) que contienen 0,167 mg / ml de o-dianisidinedihydrochloride y peróxido de hidrógeno 0,0005% en una cubeta.
4. Medir la tasa de absorbancia utilizando un espectrofotómetro a 460 nm. Nota: la actividad de MPO se define como la cantidad de enzima que degrada 1 mol / min de H ₂ O ₂ a H ₂ O a temperatura ambiente y se expresa en unidades por mg de tejido.

Resultados

Desafío de ratas (Sprague-Dawley) o ratones (C57BL / 6) con DNBS típicamente resulta en la pérdida de peso transitoria y diarrea, a veces con sangre presente en las heces. Sin embargo, factores como la genética, la dieta y la microbiota intestinal puede modificar la susceptibilidad a la colitis inducida DNBS. Por lo tanto, incluso con los animales en los experimentos deben ser de la misma institución, ya sea derivado de forma local o pedir en un solo proveedor animal. Todos los animales deben ser controlados cuidad...

Discusión

El modelo DNBS se describe en este protocolo es un modelo de colitis valiosa, de bajo costo, y reproducible que puede ser utilizado para estudiar diversos aspectos de la EII. Cuando se administra por vía rectal para ratas o ratones, DNBS induce un importante grado de inflamación y lesión tisular en el colon, se asemeja a la enfermedad de Crohn humana en términos de sus diferentes características histológicas que incluyen la infiltración transmural de polimorfonucleares y la activación de Th1 NF-kB dependiente pr...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 ml Syringe	BD Biosciences	309659
19 G Needle	BD Biosciences	305187
Polyethylene tubing PE-50	BD Biosciences	427517	for intrarectal administration in mice
Polyethylene tubing PE-90	BD Biosciences	427519	for intrarectal administration in rat
DNBS	MP Bio	150959
Tear gel	Novartis	63601662596
10% Formalin	Fisher	5F93-4
Warming pad	Kent Scientific	TPZ-0510
Ethanol	Fisher	A-962.4
Hexadecyltrimethyl-ammonium bromide	Sigma-Aldrich	H5882
Potassium phosphate buffer solution	Sigma-Aldrich	79628-
o-Dianisidine dihydrochloride	Sigma-Aldrich	D3252
30% H2O2	Sigma-Aldrich	31642	hydrogen peroxide
Spectrophotometer	BioRad	Benchmarker Plus
Light Microscope	Zeiss	Axio Image.Z1
Data analysis software program	GraphPad Software	GraphPad Prism Software Version 4.00	www.graphpad.com