DNBS / TNBS大腸炎モデル：食事脂肪の炎症性腸疾患への洞察とエフェクトを提供

要約

DNBS / TNBS誘発性大腸炎は炎症性腸疾患の病理生物学を研究するための代替手段で安価な方法を提供しています。このホワイトペーパーで説明プロトコルは、マウスとラットで大腸炎を誘発することがDNBSの成功したアプリケーションの概要を説明し、1は完全に宿主媒介腸の応答を研究することができます。

要約

クローン病および潰瘍性大腸炎を含む炎症性腸疾患（IBD）は、長い遺伝的基礎に関連して、最近、微生物及び環境因子に対する免疫応答をホストしている。ジニトロベンゼンスルホン酸（DNBS）誘発性大腸炎は、1がそのようなストレスや食生活、潜在的な治療法の効果、およびメカニズム基盤となる腸の炎症や粘膜損傷などのIBDに伴う環境のトリガーの病因を研究することができます。本論文では、ラットにおいてDNBS誘発性大腸炎に対する大腸粘膜の炎症反応に対する食餌のn-3およびn-6脂肪酸の効果を検討した。すべてのラットは、前の直腸内DNBSへの曝露に3週間脂肪酸〔サフラワー油（SO）、キャノーラ油（CO）、又は魚油（FO）】異なるタイプのを除いて同一の食餌を与えた。直腸内エタノール与えられた対照ラットはDNBS投与ラットのに対し、供給脂質の食事をすべてLOS、5日の研究の上に体重が増え続けFOとCO与えたラットは、48時間および72時間でのSO与えたラットで有意な体重減少を示すと、Tの重み。重量増加は72時間後DNBS後に再開し、5日後DNBSによって、FO基はSOまたはCO基よりも高い体重であった。結腸のセクションでは、5日後にDNBS処理が焦点潰瘍、陰窩破壊、杯細胞の枯渇、および食群の中で重要度が異なっていた両方の急性および慢性の炎症性細胞の粘膜浸潤を示した収集。 SO供給グループは、COが続き、最も深刻な被害を示し、FOは組織損傷の最も穏やかな程度を示したグループを供給した。同様に、結腸ミ​​エロ（MPO）活性は、好中球活性のマーカーは、FO与えたラットは、有意に低いMPO活性を持つ、SO、CO給餌ラットが続く中で有意に高かった。 IBDの病因に食生活の影響を判断するために、このプロトコルに概説されているようこれらの結果は、DNBS誘発性大腸炎の使用を示す。

概要

炎症性腸疾患（IBD）は、下痢、体重減少、腹痛の症状をもたらす、胃腸（GI）管における慢性再発性炎症を特徴とする。潰瘍性大腸炎（UC）およびクローン病（CD）は、IBDの2つの主要な形態であり、GI管内の炎症の位置によって区別す​​ることができる。 UC患者では、炎症は通常、直腸を伴い、うわべだけの粘膜に影響を与える変数エクステントのコロンまで連続して伸びている。それは主に回腸および盲腸に影響を与えるが、これとは対照的に、CDは、GI管の任意の部分に影響を与えることができる。貫​​炎症は、多くの場合、肉芽腫と関連し、（瘻孔）疾患をstricturing（fibrostenotic）および/または貫通に至るようにCDが頻繁に現れる。 IBDの病因はとらえどころのないままであるが、それはよく、IBDはホストの免疫システム、遺伝的感受性と責任の間で相互作用を伴う、多因子性であることが認められている環境や微生物因子に対するSES。

現在までに、IBDの異なるモデルが様々な臨床、組織学的およびUCおよびCDの特徴的な免疫応答を示すことが提案されている。最も一般的に使用されるモデルは、遺伝子改変マウス（IL-2、IL-10、SAMP / YIT）、感染誘発されたモデル（ シトロバクター·ローデン 、 ネズミチフス菌 ）、養子移入モデル（CD45 + RB高、SCIDマウスへのCD62L +細胞移入）を含むと化学的に誘導された大腸炎モデル（デキストラン硫酸ナトリウム（DSS）、トリニトロベンゼンスルホン酸（TNBS）、及びジニトロベンゼンスルホン酸（DNBS））。それらの低コストおよび疾患の迅速な開始のために、化学モデルは、IBDの様々な態様の研究に非常に貴重と考えられている。記載されている化学的大腸炎モデルのそれぞれは、IBDに対する、臨床免疫学的および組織病理学的関連性のいくつかの局面において利点だけでなく、制限があります。 DSSは、大腸菌を誘導するために使用される最も一般的な化学的方法の一つであるげっ歯類¹ TIS。 3〜10％のDSS（分子量：42 kDa）の物を投与したマウスの飲料水に7〜10日間には、症状や体重減少、血液と下痢、結腸の短縮、粘膜潰瘍および好中球の浸潤を含む大腸炎の兆候を誘導することができる。このモデルは、薬剤スクリーニングの研究だけでなく、上皮再生、粘膜恒常性に対する自然免疫の影響、および腸の異形成と腺癌の開発を促進する上で炎症の役割のメカニズムを探求するために特に有用である。そこしかしながらDSSの濃度の変化を含むDSSモデルへのいくつかの欠点が、範囲、程度のばらつきが生じる、異なる動物施設、ならびにマウスによって失わ水の取り込みおよびDSSに従って一貫性のない露光における大腸炎を誘発するために必要とされると結腸内の粘膜損傷および潰瘍の分布。これらすべての機能は、結果の不均一性につながり、研究のFR間で結果を比較する能力を制限するオム異なる研究グループ。

DSSモデルへの代替手段はハプテン誘発性DNBSや大腸炎のTNBSモデルです。このモデルは、エタノールの様々な濃度に希釈した薬剤のDNBSまたはTNBSを、増粘膜の直腸点滴を採用しています。エタノールの投与は粘膜固有層にDNBSまたはTNBSの浸透を可能にするために結腸粘膜バリアを破るの前提条件です。 DNBS / TNBSは、それによってホスト自然免疫と獲得免疫応答をトリガーする、免疫原性になるためにローカライズされた結腸と腸微生物タンパク質をハプテン化します。一般に、このモデルは、重度の、時には出血性下痢、体重減少および腸壁肥厚しかしながら、症状が用いられる齧歯動物の種類、並びにタイミング、用量およびDNBSへの曝露またはTNBSで使用さの程度に依存して変化と関連している研究。ラットとマウスの間には重要な違いは、低購入し、ボードのコストだけでなく、ロウの利点で、注意すべきであるインビボでの治療の動物あたりのコストを下げるために体重をrは。これはより脆弱で応答性の動物はすぐに人道的エンドポイントに達する可能性があり、マウスにおける大腸炎のより迅速かつ厳しいもちろん、反対に設定する必要があります。

腸の炎症は、最初に増加し、上皮透過性、粘膜への微生物の侵入、宿主タンパク質のハプテン、損傷を受けた粘膜への好中球、マクロファージおよびTh1 Tリンパ球の浸潤をもたらすこのすべてをもたらす、腸上皮細胞へのエタノール誘発損傷から生じる。 DNBSと比較して、TNBSは、ナトリウムおよび水酸化カリウムなどの塩基と接触すると爆発の危険をもたらすことができ、その酸化力の高い性質に起因する有害な化学物質として考えられている。したがってDNBSは現在、大腸炎を誘発するTNBS以上の化学物質の好ましい選択とみなされている。げっ歯類では、DNBS性大腸炎は、folloを研究するための最も便利な方法の一つとして考えられている病気の翼IBD関連する修飾子：

1. うつ病および大腸の再活性化：これは、IBD患者におけるストレス、不安およびうつ病が頻繁に疾患再発に関連していることが示されている。 DNBS大腸炎は、マウスでは大腸の再活性化にうつ病とその結果の役割を研究するのに適したモデルです。この方法は、一般的に6〜8週間のマウスを残すことによって、大腸炎の決議に続いDNBSによる大腸炎の初期誘導を伴う。次いで、マウスをDNBS ²のsubcolitic用量でのチャレンジを通じて大腸の再活性化のためにそれらをテストすることによって、その後うつ病を誘発するためにこのようなレセルピンなどのうつ病の原因薬剤または嗅球摘除により投与される。
2. ストレスや大腸の再活性化：ストレスは、IBDの病因に関連している他の一般的な環境要因である。慢性的なストレスや齧歯類におけるUCとCDの症状の発症との間に強い関連性を示唆する証拠が増えて体があるヒトとヒト以外の霊長類³中のSだけでなく、。 DNBS性大腸炎は、マウスおよびラットの両方で大腸炎のストレス関連の再活性化を研究するための優れたモデルである。うつ病の場所を除いて、うつ病のために上述したような方法は、通常、同様の方法で用いられ、動物は、例えば、音波や拘束ストレス⁴とストレッサーに曝される。
3. 神経性炎症：多数の研究が、動物モデルからIBD患者からの組織サンプルに見られるように、腸管神経系（ENS）の構造および機能に一時的または永久的な変化のいずれかを記載している。 DNBSはENS ⁵上の炎症の影響を調査し、ノルアドレナリン作動性およびコリン作動性神経経路⁶の両方を研究するための優れたモデルである。
4. 損傷修復メカニズム：IBDの病因の間、そのような活性酸素種（ROS）のような宿主由来の傷害のメディエーター、酸化窒素（NO）、細胞間接着分子-3（ICAM-3）、およびP-セレクチンは、全てのpに示されている腸上皮の破壊に関与して横たわっていた。 DNBSは、選択的な薬や阻害剤^7,8を使用することによって調節されているこれらのメディエーターの上方制御だけでなく、修復メカニズムに起因する負傷を研究するための優れたモデルです。
5. 貫​​壁性炎症：DNBSの上述の用途に加えて、モデルはまた、腸の貫壁性炎症、CDを有する患者において見出さ古典的な特徴を研究するために適用することができる。 DNBSおよびTNBS誘導性大腸炎の両方がT細胞依存性免疫機構を研究するこれらのモデルは、特に有用なものと大腸粘膜に、リンパ球の著しい浸潤と関連している。

DSSモデルと比較して、DNBSおよびTNBS誘導大腸炎の利点は、低コスト、大腸炎の急速な発展（通常は再現性の潰瘍や炎症を表示するために1-3日を要する）と遠位結腸への一貫したローカライズ損傷も含まれます。しかし欠点はのための要件である技術的専門知識、DNBS / TNBS投与量の最適化、および直腸投与のための麻酔の必要性の高いレベル。

この方法論的研究では、（SO）植物油のサフラワー油を使用したラットでDNBS誘発性大腸炎の大腸粘膜応答を変える上のn-6およびn-3多価不飽和脂肪酸の様々な濃度の影響を研究し、キャノーラ油（CO） 、および魚油（FO）。それは、n-6およびn-3脂肪酸は、細胞膜phosopholipids ⁹のアシル部分としての役割を介して腸の炎症性疾患の重要なメディエーターであることが示されている。十分に高い吸気のn-6脂肪酸の炎症誘発電位とは対照的に、n-3脂肪酸は、潜在的に強力な抗炎症剤である。 n-3脂肪酸の抗炎症作用は、proinflの変化を介して間接的にアラキドン酸代謝とを阻害する、エイコサノイド基質としてアラキドン酸の代わりを通して直接媒介されるammatory遺伝子発現および細胞シグナリング。 n-3脂肪酸はまた、レゾルビン、抗炎症性メディエーターのファミリーを生じさせる。 n-3脂肪酸の高摂取は、炎症誘発性エイコサノイド、サイトカイン、ケモカイン、反応性酸素種および接着分子の発現の産生の減少と関連している。本研究では、ラットを用いて、脂肪酸を除くすべての栄養素が同一の自由摂取飼料を与えた脂肪、20％のSO、20％CO、18％の魚油を加えた2％のベニバナ油^{（FO）10-11}からのパーセントエネルギーとして。日々のエネルギーの割合として、SO食は15％のリノール酸（LA）を提供し、<0.06％のα-リノレン酸（ALA）と無エイコサペンタエン酸（EPA）やドコサヘキサエン酸（DHA）と、COの食事は4.2を持っていた％のLa 1.9％ALAなしのEPAまたはDHAとし、FO食は1.4％のEPA、4.9％のDHA、0.32％のLa、および0.12％のALAを提供した。三週間脂質食餌の開始後に、マウスを直腸内DNBS又は50％エタノールを投与し、5日後に屠殺した。 INFLammatory応答は、体重減少、組織学的損傷スコアおよび組織ミエロペルオキシダーゼ活性の評価により評価した。

プロトコル

動物を対象とする手順は、ブリティッシュ·コロンビア大学の施設内動物管理使用委員会（IACUC）によって概説動物管理のガイドラインに従ってください。

代表的な結果は、Sprague-Dawleyラットから提示される一方、このプロトコルに記載された手順は、ラットとマウスの両方について説明する。

1。 DNBSおよび直腸内投与の準備

1. ラットでのDNBSの直腸点滴のために、新たに50％エタノールのDNBS/250μlを15〜30ミリグラムを準備します。マウスの場合、50％エタノールのDNBS/100μLの2-6ミリグラムを準備します。注：各施設で投与すべき正確なDNBS濃度を最適化します。雄Sprague-Dawleyラット、およびC57BL / 6マウスが、他のマウスおよびラットの系統を使用することができる、DNBS大腸炎の誘発のために好ましい。対照群しかしながらつは、OMIをすることができるエタノールの影響を与えられた軽度または不在でのみ50％エタノールで処理したマウスおよびラットを使用することができる研究のための¹²本の群の包含はt。
2. その端部に固定ポリエチレンカテーテル（マウス - - ラットまたはPE-50 PE-90）を持つ19のG針に1ミリリットルの注射器を取り付けます。
3. 軽く加熱パッド上のラットまたはマウスの休憩麻酔（ノーズコーンを経由して1.5％イソフルランを投与することにより、 たとえば 、動物がまだ点滅し、嚥下反射神経を持っており、定期的な呼吸が表示されるはずです）。乾燥の目を避けるために、その目には涙のゲルを適用します。
4. 穏やかに遠位結腸に存在する可能性のある糞便を除去するために、動物の後端に指先で圧力を加える。
5. 優しくカテーテルがラット肛門、またはマウス3〜4 cmの約8センチの近位に達すると、直腸内にカテーテルを挿入します。容易な挿入を可能にする、潤滑するためにカテーテルを挿入しながら、少量の溶液を注入する。注意：カテーテルを挿入しながら、任意の抵抗を感じている場合、これは穿孔につながる可能性として挿入していきません腸壁。カテーテルを外し、静かに再挿​​入しようとすると、再び先に進むように、コロンの潤滑。
6. ゆっくりと250（ラット）または100（マウス）DNBSμlの、または対照のために等量の50％エタノールを注入する。 DNBSを注入した後、DNBSの損失を避けるために90秒のための動物のヘッドダウンを配置。
7. DNBS投与後、最初の週の間の脱水を防ぐために、0.2％の食塩水に動物を8％ショ糖水を供給する。
8. 慎重に体重減少と実験期間脱水や苦痛の徴候を毎日監視して、動物を観察します。注：重量損失が急激に最大許容重量損失のCCAC勧告に近づくことができる。これは主に脱水に由来するので、体重減少、脱水を制限するために、乳酸加リンゲル液を投与するための指標として使用されるべきである。必要に応じて、健康問題でのファシリティ獣医師に相談するようにしてください。

2。 CO組織をllectingとDNBSチャレンジしたマウスにおける組織学的損傷の評価

1. DNBSでの攻撃後に所望の時点で、十分な酸素を補給し、麻酔室にイソフルランで過剰投与により動物を安楽死させる。全く上昇や胸の落下が見られなくなるまで動物を観察し、触知可能なハートビートがありません。確定した動物は正常に頸椎脱臼に続いてつま先のピンチや角膜の感動的に反応し、存在しないことによって安楽死させてきた。
2. 腹腔を開き、全体の大腸を削除します。縦方向に腸を開き、巨視的粘膜潰瘍がラットで、コロン（マウス2-3 CM）の先端から約5〜6センチの近位を観察する必要があります。注：必要に応じて、大腸を除去した後、肉眼的損傷のスコアを評価します。対照動物から解剖学的位置の対応から、大腸のセグメントを収集します。注：個人が巨視的な損傷スコアのために組織をスコアする必要があり治療群の正体を知らされていないこと。下記または同様の基準を用いて組織切片をスコア：下痢の存在下または非存在についてスコア（0または1）、癒着（0,1,2）と最大結腸壁の厚さと合計潰瘍（0-10）の重症度および程度、ミリメートル^11。
3. 最大巨視的損傷部位の近位0.5センチメートルセクションを集める。スナップ保存ミエロペルオキシダーゼ（MPO）活性（好中球浸潤の尺度）を評価し、組織学的分析のために10％中性緩衝ホルマリン中の他のセクションを配置するために液体窒素に1 0.5センチメートル部をフリーズ。注：ミエロペルオキシダーゼアッセイのためのスナップ凍結した組織は、最大1ヶ月間-80℃で保存することができる。
4. ステップ2.3に組織学的分析のために採取した組織は一夜ホルマリンに固定し、その後、70％エタノールで洗浄することができます。パラフィンに組織を埋め込み、所望の厚さ（3〜5ミクロン）、組織学的スコアリングヘマトキシリン​​およびエオシン（HE）で染色さにカット。
5. 二人の観察者が各グループの組織学的損傷スコアを決定するために、光学顕微鏡下で各動物から少なくとも三つの組織切片のスコア有する。注：組織学的損傷スコアのために組織をスコア個人が治療群の正体を知らされなければならない。炎症細胞浸潤の程度（0 =なし、3 =貫）、粘膜構造の損失（0 =なし、3 =重度）、プレゼンスや陰窩膿瘍が存在しない場合（0-1）：次または同様の基準を用いて組織切片のスコア、および杯細胞の減少（0-3）。これらのスコア¹¹の合計として組織学的損傷スコアを決定します。

3。腸組織をチャレンジドDNBSにミエロ（MPO）アッセイを実施

1. ステップ2.3で得られた0.5センチメートル結腸セグメントにおけるアッセイMPO活性。 50mgの結腸segmeを得MPOホモジナイズ緩衝液（50 mMリン酸カリウム緩衝液（pH6.0）中0.5％ヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミド）で組織をホモジナイズNT / mlの均質化緩衝液懸濁液。
2. 万X gで2分間4℃で1ずつ遠心に均質化されたソリューションを分取。
3. O-dianisidinedihydrochlorideの0.167 mg / mlのキュベット中の0.0005％の過酸化水素を含む2.9ミリリットルの50mMリン酸緩衝液（pH6.0）で各アリコートを100μlを混合します。
4. 460nmで分光光度計を用いて吸光度の割合を測定します。注：MPO活性は、室温で、H ₂ OとH ₂ O ₂の1モル/分を分解する酵素の量として定義され、組織当たりのmg単位で表される。

結果

DNBSラット（スプラーグドーリー）またはマウス（C57BL / 6）の課題は、典型的には、時々、便中の血液に存在すると、一過性の体重減少および下痢を​​もたらす。しかし、このような遺伝学、食事や腸の細菌叢などの要因がDNBS誘発性大腸炎に対する感受性を変更することができます。そのため、実験に含めた動物は、ローカルに由来するか1動物のサプライヤーから注文さのどちらか、同じ...

ディスカッション

このプロトコルに記載DNBSモデルは、IBDの様々な側面を研究するために利用することができる、貴重な安価で、かつ再現性の大腸炎モデルである。ラットやマウスに直腸内投与した場合、DNBSは多核白血球の経壁浸潤および主要なNF-κB依存性のTh1活性化を含めた様々な組織学的特徴の面で人間のクローン病に似た、結腸内の炎症および組織損傷の実質的な程度を誘導する。

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資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 ml Syringe	BD Biosciences	309659
19 G Needle	BD Biosciences	305187
Polyethylene tubing PE-50	BD Biosciences	427517	for intrarectal administration in mice
Polyethylene tubing PE-90	BD Biosciences	427519	for intrarectal administration in rat
DNBS	MP Bio	150959
Tear gel	Novartis	63601662596
10% Formalin	Fisher	5F93-4
Warming pad	Kent Scientific	TPZ-0510
Ethanol	Fisher	A-962.4
Hexadecyltrimethyl-ammonium bromide	Sigma-Aldrich	H5882
Potassium phosphate buffer solution	Sigma-Aldrich	79628-
o-Dianisidine dihydrochloride	Sigma-Aldrich	D3252
30% H2O2	Sigma-Aldrich	31642	hydrogen peroxide
Spectrophotometer	BioRad	Benchmarker Plus
Light Microscope	Zeiss	Axio Image.Z1
Data analysis software program	GraphPad Software	GraphPad Prism Software Version 4.00	www.graphpad.com