מודלים DNBS / TNBS קוליטיס: מתן תובנות מחלת מעי דלקתי והשפעות של התזונה שומן

Summary

קוליטיס המושרה DNBS / TNBS מציע אלטרנטיבה ושיטה זולה ללמוד pathobiology של מחלות מעי דלקתיות. הפרוטוקול שנדון במאמר זה מתאר את היישום המוצלח של DNBS כדי לגרום לדלקת מעי גסה בעכברים וחולדות ומאפשר לאדם ללמוד ביסודיות את תגובות מעיים בתיווך מארחת.

Abstract

מחלות מעי דלקתיות (IBD), כוללים מחלת קרוהן וקוליטיס כיבית, כבר מזמן מזוהות עם בסיס גנטי, ולאחרונה לארח את תגובה חיסונית לסוכני חיידקים וסביבתיים. קוליטיס Dinitrobenzene חומצת sulfonic (DNBS) מושרה מאפשר אחד כדי ללמוד את הפתוגנזה של גורמים סביבתיים הקשורים IBD כגון מתח ודיאטה, את ההשפעות של טיפולים פוטנציאליים, ואת מנגנוני פציעת דלקת ברירית מעי בסיסית. במאמר זה, אנחנו בדקנו את ההשפעות של חומצות n-3 ו-n-6 חומצות שומן תזונתיות בתגובה הדלקתית ברירית המעי הגס לקוליטיס-Induced DNBS בחולדות. כל החולדות קבלו תזונה זהה למעט סוגים שונים של חומצות שומן מ[ שמן חריע (SO), שמן קנולה (CO), או שמן דגים (FO)] במשך שלושה שבועות לפני החשיפה לintrarectal DNBS. חולדות בקרה נתון אתנול intrarectal המשיכו לעלות במשקל על המחקר של 5 ימים, ואילו, חולדות שטופלו DNBS דיאטות שומנים האכילו את כל losמשקל לא עם חולדות FO וCO הפד הוכחת ירידה משמעותית במשקל על ידי 48 שעות וחולדות שהוזנו זאת על ידי 72 שעה. עלייה במשקל התחדשה לאחר 72 ההודעה hr DNBS, ועל ידי 5 הודעה ימי DNBS, קבוצת FO הייתה משקל גוף גבוה מכך או קבוצות CO. סעיפים במעי הגס שנאספו 5 ימים לאחר DNBS הטיפול הראה כיב מוקד, הרס קריפטה, דלדול תא גביע, וחדירה רירית של שני תאים דלקתיים חריפים וכרוניים, שהשוני בחומרה בין קבוצות דיאטה. הקבוצה כל כך שיגע הראתה נזק החמור ביותר ואחריו CO, וFO האכיל קבוצות שהראו את המידה המתונה ביותר של פגיעה ברקמות. כמו כן, פעילות myeloperoxidase הגס (MPO), סמן של פעילות נויטרופילים היה גבוהה באופן משמעותי בכל כך אחרי חולדות CO הפד, עם חולדות שהוזנו FO שיש פעילות MPO נמוכה באופן משמעותי. תוצאות אלו מראות את השימוש של קוליטיס-Induced DNBS, כפי שתואר בפרוטוקול זה, על מנת לקבוע את ההשפעה של תזונה בפתוגנזה של מחלת מעי דלקתי.

Introduction

מחלות מעי דלקתיות (IBD) מאופיינת בדלקת כרונית התקפי בדרכי העיכול (GI), וכתוצאה מכך תסמינים של שלשולים, ירידה במשקל, וכאבי בטן. קוליטיס כיבית (UC) ומחלת קרוהן (CD) הם שתי הצורות העיקריות של מחלת מעי דלקתי, ויכול להיות מכובד על ידי המיקום של הדלקת בתוך מערכת העיכול. בחולי UC, הדלקת כרוכה בדרך כלל פי הטבעת והוא משתרע בסמיכות את המעי הגס הלמשפיעה על הרירית השטחית רק מידה משתנה. לעומת זאת, CD יכול להשפיע על כל חלק של מערכת העיכול, למרות שזה בעיקר משפיע על המעי וcecum. תקליטור לעתים קרובות בא לידי ביטוי כדלקת transmural קשור לעתים קרובות עם גרנולומות ומובילה לstricturing (fibrostenotic) ו / או חדירת מחלה (fistulizing). למרות אטיולוגיה של IBD נותרת חמקמקה, מקובל גם כי IBD תלוי בכמה גורמים, הכולל אינטראקציות בין המארחים מערכת חיסונית, רגישות גנטית וresponses לגורמים סביבתיים וחיידקים.

עד כה, מודלים שונים של IBD הוצעו שמציגים תגובות קליניות, היסטולוגית וחיסוניות שונות אופייניות לUC ו-CD. הדגמים הנפוצים ביותר כוללים עכברים מהונדסים גנטי (IL-2, IL-10 SAMP / yit,) מודלים מושרה, זיהום (rodentium Citrobacter, typhimurium סלמונלה), מודלים העברת מאמצת (CD45 + RB גבוה, העברה לתא CD62L + לעכברים SCID) ו מודלים קוליטיס כימי שגרמו (Dextran נתרן סולפט (DSS), חומצת sulfonic Trinitrobenzene (TNBS), וחומצת sulfonic Dinitrobenzene (DNBS)). בשל העלות הנמוכה שלהם והתפרצות מהירה של מחלה, מודלים כימיים נחשבים לא יסולא בפז לחקר היבטים השונים של מחלת מעי דלקתי. לכל אחד מדגמי קוליטיס הכימיים המפורטים יתרונות כמו גם מגבלות בהיבטים מסוימים של הרלוונטיות הקלינית, חיסונית וhistopathological למחלת המעי דלקתית. DSS הוא אחת מהשיטות כימיות הנפוצות ביותר המועסקות כדי לגרום coliTIS במכרסמים ^1. מנהל של 3-10 DSS% (MW: 42 KDA) ל7-10 ימים במי השתייה של עכברים יכול לגרום לסימפטומים וסימנים של דלקת המעי הגס, כולל ירידה במשקל, שלשולים עם דם, קיצור מעי הגס, כיבים ברירית וחדירת נויטרופילים. מודל זה שימושי במיוחד עבור מחקרי הקרנת סמים, כמו גם לבחון את מנגנוני התחדשות אפיתל, את ההשפעה של חסינות מולדת על הומאוסטזיס הרירי, ואת התפקיד של דלקת בקידום דיספלזיה במעי והתפתחות אדנוקרצינומה. יש עם זאת כמה חסרונות למודל DSS, כולל וריאציה בריכוז של DSS הדרוש כדי לגרום לקוליטיס במתקנים שונים של בעלי חיים, כמו גם ספיגת מים עולים בקנה אחד על ידי עכברים וחשיפה ובכך עולה בקנה אחד לDSS, וכתוצאה מכך הווריאציה בתואר, במידה ו הפצה של פגיעה ברירית וכיבים במעי הגס. כל התכונות הללו יובילו לההטרוגניות של תוצאות ולהגביל את היכולת להשוות את התוצאות על פני fr לימודיםקבוצות מחקר שונות אום.

אלטרנטיבה למודל DSS היא DNBS-Induced hapten או המודלים TNBS של קוליטיס. מודל זה מעסיק החדרה רקטלית של רירית רגישות DNBS סוכנים או TNBS, בדילול מלא בריכוזים שונים של אתנול. הממשל של אתנול הוא תנאי הכרחי כדי לשבור את מחסום רירית המעי כדי לאפשר חדירה של DNBS או TNBS לpropria lamina. אז DNBS / TNBS יהיה haptenize חלבונים במעי הגס וחיידקי מעיים המקומיים להפוך immunogenic, ובכך מפעילה את המארח מולדים ואת התגובה חיסונית אדפטיבית. באופן כללי, מודל זה קשור לשלשולים חריפים ולעתים עקובים מדם, ירידה במשקל ועיבוי קיר מעיים עם זאת סימפטומים משתנים בהתאם לסוג של מכרסם בשימוש, כמו גם העיתוי, מינון ומידת חשיפה לDNBS או TNBS משמש ב מחקר. הבחנות חשובות בין חולדות ועכברים יש לציין, עם היתרונות של עלות נמוכה יותר לרכישה ולוח, כמו גם לואוr מסת גוף להפחתת עלויות לכל בעלי חיים של טיפול בגוף חי. זה צריך להיות מוגדר נגד כמובן יותר מהיר וחמור של קוליטיס בעכברים, שבו החיות יותר שבירות ותגובה עשויות להגיע לנקודת סיום הומנית במהירות.

דלקת המעיים בתחילה כתוצאה מנזק הנגרם על אתנול לתאי האפיתל במעי, שמוביל לחדירות מוגברת אפיתל, חדירה של חיידקים לרירית, haptenization של חלבוני מארח, כל זה וכתוצאה מכך ההסתננות של נויטרופילים, מקרופאגים ולימפוציטים Th1 T לתוך הרירית הפגועה. בהשוואה לDNBS, TNBS נחשב כימי מסוכן בשל מאפייני חמצוני ביותר שלה, שיכול להוות סיכון לפיצוץ במגע עם בסיסים כגון נתרן ואשלגן הידרוקסידי. לכן DNBS נחשב כיום כבחירה מועדפת של חומר כימי על TNBS לגרום לדלקת מעי גס. במכרסמים, קוליטיס DNBS נחשב כאחת השיטות הנוחה ביותר ללמוד folloIBD הכנף קשור מכפילי של מחלה:

1. דיכאון והפעלה מחדש של קוליטיס: הוכח כי לחץ, חרדה ודיכאון בחולי IBD לעתים קרובות קשורים עם הישנות מחלה. קוליטיס DNBS הוא מודל מתאים ללמוד את התפקיד של דיכאון והשלכותיו על הפעלה מחדש של קוליטיס בעכברים. השיטה כרוכה בדרך כלל אינדוקציה ראשונית של קוליטיס ידי DNBS, ואחריו ברזולוציה של קוליטיס על ידי השארת העכברים עבור 6-8 שבועות. אז העכברים מנוהלים עם סוכני דיכאון גורם כגון reserpine או על ידי bulbectomy חוש הריח כדי לגרום לדיכאון ואחרי בדיקה אותם להפעלה מחדש של קוליטיס דרך אתגר עם מינון subcolitic של DNBS ^2.
2. מתח והפעלה מחדש של קוליטיס: מתח הוא עוד גורם סביבתי נפוץ שנקשר לפתוגנזה של IBD. ישנו גוף הולך וגדל של ראיות המצביע על קשר חזק בין לחץ כרוני והופעת תסמינים של UC ו-CD במכרסמיםזה, כמו גם בבני אדם ופרימטים לא אנושיים ^3. קוליטיס DNBS הוא מודל טוב ללמוד מחדש הקשורים ללחץ של קוליטיס בשני עכברים וחולדות. השיטה בדרך כלל מועסקת באופן דומה כאמור לטיפול בדיכאון אלא במקום של דיכאון, בעלי החיים שנחשפו ללחצים כגון קולי ומתח איפוק ^4.
3. דלקת נוירוגנית: מספר המחקרים שתואר גם שינויים חולפים או קבועים במערכת העצבים enteric מבנה (ENS) ופונקציה, כפי שניתן לראות בדגימות רקמה ממודלים של בעלי חיים ושל חולים עם מחלת מעי דלקתי. DNBS הוא מודל טוב כדי לחקור את ההשפעות של דלקת בENS ⁵ וללמוד הן noradrenergic ומסלולים עצביים הכולינרגית ^6.
4. מנגנוני פציעה תיקון: בפתוגנזה של IBD, מתווכי פגיעה הנגזר מארח כגון מיני חמצן תגובתי (ROS), תחמוצת חנקן (NO), מולקולת הידבקות אינטר 3 (ICAM-3), ו-P-selectin כולם הוכחו pלהניח תפקיד בשיבוש אפיתל במעי. DNBS הוא מודל מצוין ללמוד פציעות שנגרמו על ידי עד הוויסות של מתווכים אלה, כמו גם מנגנוני תיקון שמוסדרים על ידי שימוש בסמים או מעכבי ^7,8 סלקטיבית.
5. דלקת transmural: בנוסף ליישומים שהוזכרו לעיל של DNBS, המודל יכול להיות מיושם גם כדי ללמוד דלקת transmural של המעיים, תכונה קלאסית שנמצאה בחולים עם תקליטור. DNBS וקוליטיס-Induced TNBS שניהם קשורים עם חדירה משמעותית של לימפוציטים, לרירית המעי הגס מה שהופך את הדגמים האלה שימושיים במיוחד ללמוד מנגנונים חיסוניים תלויים תא T.

בהשוואה למודל DSS, היתרונות של DNBS וקוליטיס-Induced TNBS כוללים עלות נמוכה, התפתחות מהירה של דלקת המעי הגס (בדרך כלל דורש 1-3 ימים כדי להראות כיבים ודלקות לשחזור) ונזק מקומי עקבי למעי גס דיסטלי. עם זאת החסרונות הם דרישה לרמה גבוהה יותר של מומחיות טכנית, אופטימיזציה של מינון DNBS / TNBS, ואת הצורך בהרדמה לממשל בפי הטבעת.

במאמר זה אנו מתודולוגיים חקרנו את ההשפעות של ריכוזים שונים של n-6 ו n-3 חומצות שומן רב בלתי רוויות על שינוי תגובת רירית המעי לקוליטיס-Induced DNBS בחולדות באמצעות שמן חריע שמנים צמחיים (SO) ושמן קנולה (CO) , ושמן דגים (FO). הוכח כי חומצות n-6 ו-n-3 שומן הם מתווכים חשובים של מחלה דלקתית של מעי דרך את תפקידם כmoieties acyl של phosopholipids קרום תא ^9. בניגוד לפוטנציאל מעודדי דלקת של n-6 חומצות שומן, n-3 חומצות שומן במספיק גבוהה הצריכה הן פוטנציאל חומרים אנטי דלקתיים חזקים. הפעולות אנטי דלקתיות של n-3 חומצות שומן בתיווך ישירות דרך החלפה של חומצה הארכידונית כמצע eicosanoid, עיכוב חילוף חומרים חומצה הארכידונית ובעקיפין באמצעות שינוי של proinflביטוי ammatory גן ואיתות תא. N-3 חומצות השומן גם להצמיח resolvins, משפחה של מתווכים אנטי דלקתיים. צריכה גבוה של n-3 חומצות שומן קשור לירידה בייצור של eicosanoids מעודדי דלקת, ציטוקינים, כמוקינים, מיני חמצן תגובתי וביטוי של מולקולות הדבקות. במחקר זה, חולדות דיאטות כרצונך מודעה זהות בכל החומרים המזינים, למעט חומצות שומן נמאס, עם כאנרגית אחוזים מהשומן, 20% SO, CO 20%, או 18% שמן דגים בתוספת 2% שמן חריע (FO) ^10-11 . כאחוז מהאנרגיה היומית, הדיאטה כן ובלבד 15% חומצה לינולאית (LA), עם <חומצת 0.06% α-לינולנית (ALA) ולא חומצת eicosapentaenoic (EPA) או חומצת docosahexaenoic (DHA), דיאטת CO הייתה 4.2 % לוס אנג'לס ו1.9% ALA ללא EPA או DHA, ודיאטת FO סיפקו 1.4% EPA, 4.9% DHA, 0.32% לוס אנג'לס, ו0.12% ALA. שלושה שבועות לאחר תחילת דיאטת השומנים בדם, העכברים ניתנו DNBS intrarectal או 50% אתנול והקריבו 5 ימים לאחר מכן. Inflתגובת ammatory הוערכה על ידי הערכה של ירידה במשקל, ציוני נזק היסטולוגית ופעילות myeloperoxidase רקמות.

Protocol

הליכים כרוכים בנושאי בעלי חיים לעקוב אחר הנחיות טיפול בבעלי החיים שהותוו על ידי הוועדה המוסדית טיפול בבעלי חיים ושימוש (IACUC) באוניברסיטה של ​​קולומביה הבריטית.

נהלים שהוזכרו בפרוטוקול זה יהיה מתואר עבור שני חולדות ועכברים, ואילו נציג התוצאות יוצגו מחולדות ספראג-Dawley.

1. הכנת DNBS וIntrarectal המינהל

1. להחדרה רקטלית של DNBS בחולדות, טרי להכין 15-30 מ"ג של DNBS/250 μl 50% אתנול. לעכברים, להכין 2-6 מ"ג של DNBS/100 μl 50% אתנול. הערה: לייעל את ריכוז DNBS המדויק כדי להינתן בכל מתקן. חולדות זכרים ספראג-Dawley, ועכברי C57BL / 6 הם העדיפו לאינדוקציה של קוליטיס DNBS, ניתן להשתמש בזני עכבר וחולדה אחרים לעומת זאת. עכברים וחולדות שטופלו רק עם 50% אתנול יכולים לשמש כקבוצות ביקורת אך בהתחשב בהשפעות של אתנול הם קלים או נעדרים, אפשר אומיt ההכללה של קבוצה זו למחקר ^12.
2. צרף מזרק 1 מיליליטר למחט 19 G שיש לו קטטר פוליאתילן (PE-90 - חולדות או PE-50 - עכברים) מהודק עד סופו.
3. קל להרדים את העכברוש או מנוחת עכבר על כרית חימום (למשל על ידי מתן isoflurane 1.5% באמצעות חרטומו, עדיין צריכה להיות חיות הרף ורפלקסים בליעה ולהציג את נשימה רגילה). החל ג'ל המדמיע לעיניה, כדי למנוע את עיני התייבשות.
4. בעדינות להפעיל לחץ עם קצות אצבעות לקצה האחורי של החיה כדי להסיר כל צואה שעלולה להיות נוכח במעי גס דיסטלי.
5. הכנס בעדינות את הקטטר intrarectally, עם קטטר והגיע לכ 8 הפרוקסימלי סנטימטר אל פי הטבעת לחולדות, או 3-4 סנטימטר לעכברים. להזריק כמות קטנה של הפתרון בזמן החדרת הצנתר לשמן, המאפשר החדרה קלה יותר. הערה: אם כל התנגדות מורגשת בזמן החדרת הצנתר, אל תמשיך להכניס מכיוון שהדבר עלול להוביל לניקוב שלבדופן המעי. הסר את הקטטר ותנסה להכניס מחדש בעדינות, שוב שימון המעי הגס שכימשיך.
6. לאט לאט להזריק 250 (חולדות) או 100 μl (עכברים) של DNBS, או נפח שווה או 50% אתנול לפקדים. לאחר הזרקת DNBS, מקם את בעלי החיים את הראש למטה ל90 שניות כדי למנוע אובדן של DNBS.
7. לאחר מתן DNBS, להאכיל את החיות 8% מים סוכרוז בתמיסת מלח 0.2% על מנת למנוע התייבשות בשבוע הראשון.
8. להתבונן היטב את בעלי החיים, עם מעקב יומי לירידה במשקל וסימנים של התייבשות או מצוקה לתקופת הניסוי. הערה: ירידה במשקל עשויה מתקרבת במהירות את המלצות CCAC של ירידה במשקל המרבית המותרת. מאז זה בעיקר נובע מהתייבשות, יש להשתמש בירידה במשקל כמדד לניהול הפתרון של רינגר לקטט להגביל התייבשות. אנא הקפד להתייעץ עם וטרינר המתקן בנושאי בריאות כמתאים.

2. שיתוףllecting רקמות והערכת נזק היסטולוגית בDNBS עכברים פיגור

1. בנקודת הזמן הרצויה לאחר אתגר עם DNBS, להרדים בעלי חיים על ידי מינון יתר עם isoflurane בתא הרדמה בתוספת מספיק חמצן. שים לב לבעלי החיים עד שלא עולה או יורדים מהחזה נתפס ואין דופק מוחשי. לאשר את החיה כבר מורדמים כראוי על ידי העדר תגובה לקמצוץ הבוהן או נוגעים ללב של הקרנית, ואחריו נקע בצוואר הרחם.
2. פתח את חלל הבטן ולהוציא את המעי גס כולו. פתח את מעי אורכים; צריכים להיות שנצפו כיבים ברירית מקרוסקופית כ 5-6 הפרוקסימלי סנטימטר מהקצה הדיסטלי של המעי הגס בחולדות (2-3 סנטימטר בעכברים). הערה: לאחר הסרת המעי גס, להעריך את ציוני נזק מקרוסקופית אם תרצה בכך. לאסוף קטעים של מעי גס ממקבילים מיקום האנטומי מבעלי השליטה. הערה: האנשים הבקיע הרקמות לציוני נזק מקרוסקופית צריכיםלהיות עיוור לזהותו של קבוצות הטיפול. ציון סעיפי רקמות באמצעות הקריטריונים הבאים או דומים: חומרה והיקף של כיב (0-10), סיכמו עם ציונים על היעדרות או נוכחות של שלשול (0 או 1), הידבקויות (0, 1 או 2) ועובי דופן מעי הגס מקסימאלי במילימטרים ^11.
3. לאסוף 0.5 סעיפי סנטימטר הפרוקסימלי לאתר של נזק מקרוסקופית מקסימאלי. הצמד להקפיא סעיף 0.5 סנטימטר אחד בחנקן נוזלי בהמשך כדי להעריך myeloperoxidase פעילות (MPO) (מדד של חדירת נויטרופילים), ולמקם את הסעיף האחר ב10% ניטראלי שנאגרו פורמלין לניתוח היסטולוגית. הערה: הצמד רקמות קפואות עבור assay myeloperoxidase ניתן לאחסן ב-80 מעלות צלזיוס למשך עד חודש 1.
4. לאפשר לרקמות שנאספו לניתוח היסטולוגית בשלב 2.3 לתקן בפורמלין לילה, ולאחר מכן לשטוף עם 70% אתנול. להטביע רקמות בפרפין ולחתוך לעובי רצוי (3-5 מיקרומטר), כתם עם hemotoxylin ו eosin (HE) לניקוד היסטולוגית.
5. יש שני משקיפים להבקיע לפחות שלושה חלקי רקמות מכל חיה תחת מיקרוסקופ אור כדי לקבוע את ציוני נזק היסטולוגית לכל קבוצה. הערה: האנשים הבקיע הרקמות לציוני נזק היסטולוגית צריכים להיות עיוורים לזהותו של קבוצות הטיפול. ציון סעיפי רקמות באמצעות הקריטריונים הבאים או דומים: היקף לחדור תא דלקתי (0 = נעדר, 3 = transmural), אובדן של אדריכלות רירית (0 = נעדר, 3 = חמורה), נוכחות או עדר של מורסות קריפטה (0-1) , ודלדול גביע תא (0-3). לקבוע ציון נזק היסטולוגית כסכום של ציונים אלה ^11.

3. רקמת מעי פיגור הבמה Myeloperoxidase (MPO) Assay על DNBS

1. פעילות MPO assay ב0.5 פלחים הגס סנטימטר שהושגו בשלב 2.3. Homogenize רקמות במאגר המגון MPO (0.5% ברומיד hexadecyltrimethyl-אמוניום בחיץ פוספט אשלגן 50 מ"מ (pH 6.0)) לתת segme מעי גס 50 מ"גNT / מיליליטר של השעיה חיץ הומוגניזציה.
2. Aliquot הפתרון הומוגני לתוך 1 מיליליטר מנות ו צנטריפוגות ב 4 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות ב 10,000 X גרם.
3. מערבבים את כל aliquot 100 μl עם 2.9 מיליליטר של 50 מ"מ חיץ פוספט (pH 6.0) המכיל 0.167 מ"ג / מיליליטר של o-dianisidinedihydrochloride ו0.0005% מי חמצן בקובט.
4. מדוד את קצב ספיגת באמצעות ספקטרופוטומטר ב460 ננומטר. הערה: פעילות MPO מוגדרת ככמות האנזים משפילה 1 μmol / דקות של H ₂ O ₂ לH ₂ O בטמפרטורת חדר, והוא בא לידי ביטוי ביחידות למ"ג של רקמה.

תוצאות

אתגר של חולדות (ספראג-Dawley) או עכברים (C57BL / 6) עם DNBS בדרך כלל תוצאות בירידה במשקל זמנית ושלשולים, לפעמים עם הווה דם בצואה. עם זאת, גורמים כגון גנטיקה, תזונה וחיידקי מעיים יכולים לשנות את רגישות לקוליטיס DNBS המושרה. לכן, בעלי החיים שנכללו בניסויים צריכים להיות מאותו המוסד, א?...

Discussion

מודל DNBS המתואר בפרוטוקול זה הוא מודל קוליטיס יקר, זול, ושחזור שיכול להיות מנוצל ללימוד היבטים שונים של מחלת מעי דלקתי. כאשר מנוהל intrarectally לחולדות או עכברים, DNBS גורם מידה ניכרת של דלקת ופגיעה ברקמות במעי הגס, שמזכיר מחלת קרוהן האנושית במונחים של התכונות היסטולוגית השונ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 ml Syringe	BD Biosciences	309659
19 G Needle	BD Biosciences	305187
Polyethylene tubing PE-50	BD Biosciences	427517	for intrarectal administration in mice
Polyethylene tubing PE-90	BD Biosciences	427519	for intrarectal administration in rat
DNBS	MP Bio	150959
Tear gel	Novartis	63601662596
10% Formalin	Fisher	5F93-4
Warming pad	Kent Scientific	TPZ-0510
Ethanol	Fisher	A-962.4
Hexadecyltrimethyl-ammonium bromide	Sigma-Aldrich	H5882
Potassium phosphate buffer solution	Sigma-Aldrich	79628-
o-Dianisidine dihydrochloride	Sigma-Aldrich	D3252
30% H2O2	Sigma-Aldrich	31642	hydrogen peroxide
Spectrophotometer	BioRad	Benchmarker Plus
Light Microscope	Zeiss	Axio Image.Z1
Data analysis software program	GraphPad Software	GraphPad Prism Software Version 4.00	www.graphpad.com