DNBS / TNBS колит Модели: Предоставление взглянуть на воспалительное заболевание кишечника и эффекты диетического жира

Резюме

DNBS / TNBS индуцированной колит предлагает альтернативу и недорогой метод для изучения патобиологии воспалительного заболевания кишечника. Протокол рассматриваются в настоящем документе излагаются успешное применение DNBS чтобы вызвать колит у мышей и крыс и позволяет тщательно изучить хост-опосредованной кишечные реакции.

Аннотация

Воспалительные заболевания кишечника (IBD), в том числе болезни Крона и язвенный колит, уже давно ассоциируется с генетической основе, а в последнее время иммунного ответа к микробным и факторов окружающей среды. Динитробензол кислоту (DNBS)-индуцированной колит позволяет изучать патогенез IBD связанных экологических триггеров, таких как стресс и питание, последствий потенциальных методов лечения, а также механизмов, лежащих воспаление кишечника и повреждения слизистой. В данной работе мы исследовали эффекты биологически активных н-3 и н-6 жирных кислот на толстой слизистой воспалительного ответа на DNBS-индуцированного колита у крыс. Все крыс кормили идентичные диет за исключением различных типов жирных кислот [сафлоровое масло (SO), масло канолы (CO), или рыбий жир (FO)] в течение трех недель перед воздействием Интраректальное DNBS. Контрольные крысы, приведенные интраректального этанола продолжали набирать вес в течение 5-дневного исследования, в то время как, DNBS-обработанных крыс кормили липидов диеты все Losт вес с FO и СО кормили крыс демонстрируя значительную потерю веса на 48 ч и крыс кормили SO на 72 часа. Увеличение веса возобновлена ​​после 72 часов после DNBS, и на 5 дней сообщению DNBS, группа FO имели более высокий вес тела, чем SO или CO группы. Кишечное разделы собраны 5 дней после DNBS обращения показал фокусное язвы, склеп разрушение, истощение кубок клеток и слизистой оболочки проникновение как острых, так и хронических воспалительных клеток, отличающихся по степени тяжести среди диетических групп. ТАК подается группа показала самый серьезный ущерб, за которой следует CO, и FO кормили группы, которые показали самый мягкий степень повреждения тканей. Точно так же, толстой миелопероксидаза (МРО), маркера активности нейтрофилов была значительно выше в SO последующим СО кормили крыс, с FO кормили крыс, имеющих значительно более низкую активность MPO. Эти результаты показывают, использование DNBS-индуцированного колита, как указано в этом протоколе, чтобы определить влияние диеты в патогенезе IBD.

Введение

Воспалительные заболевания кишечника (ВЗК) характеризуется хроническим воспалением рецидивирующего в желудочно-кишечный тракта (ЖКТ), в результате чего симптомы диареи, потеря веса, и боли в животе. Язвенный колит (UC) и болезнь Крона (CD) являются двумя основными формами IBD, и можно отличить по месту нахождения воспаления в желудочно-кишечном тракте. У пациентов UC, воспаление обычно включает в себя прямую кишку и простирается непрерывно до толстой кишки для разной степени влияющих только поверхностное слизистую оболочку. В противоположность этому, компакт-диск может повлиять на любую часть желудочно-кишечного тракта, хотя это преимущественно поражает подвздошной кишки и слепой кишки. CD часто проявляется как трансмуральный воспаление часто связано с гранулем и приводит к сужение (fibrostenotic) и / или (проникающий) fistulizing заболевание. Хотя этиология IBD остается неуловимым, он хорошо принято считать, что IBD является многофакторной, включая взаимодействия между хозяевами иммунную систему, генетической предрасположенности и несет ответственностьSES экологических и микробных факторов.

На сегодняшний день различные модели IBD были предложены, что отображать различные клинические, гистологические и иммунные реакции, характерные для UC и CD. Наиболее часто используемые модели включают генетически модифицированных мышей (IL-2, IL-10, SAMP / YIT), инфекции, вызванные моделей (Citrobacter rodentium, сальмонелла Typhimurium), усыновители модели перевод (CD45 + РБ Высокие, передачи сотового CD62L + в SCID мышей) и химически индуцированные модели колит (декстран сульфат натрия (DSS), тринитробензолсульфоновой кислота (ТНБ), и Динитробензол сульфокислоты (DNBS)). Благодаря их низкой стоимости и быстрого начала заболевания, химические модели считаются бесценными для изучения различных аспектов IBD. Каждый из химических моделей колит перечисленных имеет свои преимущества, а также недостатки в некоторых аспектах их клинического, иммунологического и гистологической отношение к IBD. DSS является одним из наиболее распространенных методов, используемых химических индуцировать палочкитис у грызунов ^1. Введение 3-10% DSS (MW: 42 кДа) в течение 7-10 дней в питьевой воде мышей может вызывать симптомы и признаки колита в том числе потеря веса, понос с кровью, толстой укорочения, слизистой оболочки язв и инфильтрации нейтрофилов. Эта модель особенно полезна для скрининга лекарственных средств исследований, а также изучения механизмов регенерации эпителия, влияние врожденного иммунитета на слизистой гомеостаза, а также роль воспаления в продвижении кишечника дисплазии и развития аденокарциномы. Существуют, однако, некоторые недостатки модели DSS, в том числе изменения в концентрации DSS, необходимой, чтобы вызвать колит в различных объектов животного, а также поглощения противоречивы воды по мышей и, таким образом, несовместимым воздействия DSS, в результате чего изменения в степени, степени и распределение поражения слизистой и язв в толстой кишке. Все эти особенности приводят к неоднородности результатов и ограничить возможность сравнить результаты различных исследований фрOM различные исследовательские группы.

Альтернативой модели DSS является гаптен-индуцированной DNBS или TNBS модели колита. Эта модель использует прямой кишки инстилляцию слизистой сенсибилизации агенты DNBS или TNBS, разбавленного в различных концентрациях этанола. Администрация этанола является необходимым условием, чтобы сломать барьер слизистой оболочки толстой, чтобы позволить проникновение DNBS или TNBS в собственной пластинке. DNBS / TNBS будет haptenize локализованные толстой и кишки микробные белки стать иммуногенны, тем самым вызывая хозяина врожденного и адаптивного иммунного ответа. В общем, эта модель связана с тяжелой и иногда кровавый понос, потеря веса и желудочно-кишечном утолщение стенки однако симптомы варьируются в зависимости от типа используемого грызунов, а также сроков, дозы и степени воздействия на DNBS или TNBS используется в Исследование. Важные различия между крысами и мышами Следует отметить, с преимуществами низкой стоимости на покупку и питание, а также Лоуг массы тела для уменьшения на-животного расходы на лечение в естественных условиях. Это должно быть установлено против более быстрого и тяжелого течения колита у мышей, где более хрупкие и чувствительные животные могут быстро добраться до гуманного конечную точку.

Воспаление кишечника первоначально приводит из этанола, индуцированной повреждением эпителиальных клеток кишечника, что приводит к увеличению проницаемости эпителия, микробного проникновения в слизистую оболочку, haptenization принимающих белков, все это приводит к инфильтрации нейтрофилов, макрофагов и Т-лимфоцитов Th1 в поврежденную слизистую оболочку. По сравнению с DNBS, TNBS рассматривается как опасного химического вещества в связи с его высокой окислительной свойств, которые могут представлять опасность взрыва при контакте с основаниями, такими как натрий и гидроксида калия. Поэтому DNBS в настоящее время рассматривается в качестве предпочтительного выбора химических над TNBS индуцировать колит. У грызунов, DNBS колит рассматривается как один из самых удобных способов для изучения FOLLOкрыло IBD связано модификаторы болезни:

1. Депрессия и реактивация колита: Было показано, что стресс, беспокойство и депрессия у пациентов с IBD часто связаны с рецидива заболевания. DNBS колит является подходящей моделью для изучения роли депрессии и ее последствий на реактивации колита у мышей. Метод обычно включает первоначальный индукцию колита по DNBS, а затем постановлением колит, оставив мышей в течение 6-8 недель. Затем мышей вводили с депрессией в результате чего агентов, таких как резерпин или обонятельной bulbectomy, чтобы вызвать депрессию с последующим их тестирования для реактивации колита через вызов с subcolitic дозе DNBS ^2.
2. Стресс и реактивация колита: Стресс является еще одним распространенным экологический фактор, что было связано с IBD патогенеза. Существует все больше доказательств, что предполагает тесную связь между хроническим стрессом и появления симптомов UC и CD в грызунас, а также у человека и приматов ^3. DNBS колит является хорошей моделью для изучения стресса связаны реактивации колита у мышей и крыс. Метод обычно используется таким же образом, как указано выше, за исключением депрессии вместо депрессии, животные подвергаются воздействию стрессовых таких как звуковых и удерживающей стресса ^4.
3. Нейрогенного воспаления: Ряд исследований описали либо переходные или постоянные изменения в кишечной нервной системы (ENS) структуры и функции, как видно в образцах ткани от животных моделях и от пациентов с воспалительными заболеваниями кишечника. DNBS является хорошей моделью для изучения влияния воспаления на ENS ⁵ и изучать как норадренергическую и холинергические нервные пути ^6.
4. Травма-ремонтные механизмы: Во IBD патогенеза, принимающие полученных травм посредники, такие как активные формы кислорода (АФК), оксида азота (NO), межклеточной адгезии 3 (ICAM-3) и P-селектина все было показано на стр.заложить роль в кишечного эпителия нарушения. DNBS превосходная модель для изучения повреждений, вызванных положительную регуляцию этих посредников, а также механизмов репарации, которые регулируются с помощью селективных препаратов или ингибиторов ^7,8.
5. Трансмуральное воспаление: В дополнение к упомянутым выше применений DNBS, модель может также применяться для изучения трансмуральный воспаление кишечника, классический функцию у больных с компакт-диска. Оба DNBS и ТНБ-индуцированные колит связаны со значительным инфильтрации лимфоцитов, в слизистой оболочки толстой кишки решений эти модели особенно полезны для изучения Т-клеточные зависимые иммунные механизмы.

По сравнению с моделью DSS, преимущества и DNBS TNBS-индуцированных колита включают низкую стоимость, быстрое развитие колита (обычно требует 1-3 дней, чтобы показать воспроизводимый язвы и воспаления) и последовательного локализованное повреждение дистального отдела толстой кишки. Однако недостатки являются необходимым условием дляболее высокий уровень технических знаний, оптимизации дозы DNBS / TNBS, и потребность в анестезии для ректального введения.

В этой методологической работе изучали эффекты различных концентраций п-6 и омега-3 полиненасыщенных жирных кислот на изменения ответа толстой слизистой к DNBS-индуцированного колита у крыс с помощью растительных масел сафлоровое масло (ТАК) и рапсовое масло (СО) , и рыбий жир (FO). Было показано, что н-6 и омега-3 жирные кислоты являются важными медиаторами воспалительных заболеваний кишечника через их роли в качестве ацильными группами клеточных мембран phosopholipids ^9. В отличие от провоспалительного потенциала н-6 жирных кислот, п-3 жирных кислот при достаточно высоким потреблением потенциально сильными противовоспалительными агентами. Противовоспалительные действия п-3 жирных кислот опосредованы непосредственно путем замены арахидоновой кислоты в качестве субстрата эйкозаноидов, ингибирование метаболизма арахидоновой кислоты и косвенно через изменение proinflammatory экспрессии генов и клеточной сигнализации. N-3 жирных кислот также привести к Resolvins, семейство противовоспалительных медиаторов. Высокое потребление п-3 жирных кислот связано со снижением продукции провоспалительных эйкозаноидов, цитокинов, хемокинов, активных форм кислорода и экспрессии молекул адгезии. В этом исследовании крыс кормили вволю диеты одинаковы во всех питательных веществ за исключением жирных кислот, с как процент энергии из жира, 20%, так, 20% CO, 18% или рыбий жир плюс 2% сафлорового масла (FO) ^10-11 . В процентах от суточной энергии, SO диета при условии, 15% линолевой кислоты (LA), с <0,06% α-линоленовой кислоты (АЛК) и не эйкозапентаеновой кислоты (EPA) или докозагексаеновой кислоты (DHA), CO диета была 4,2 % LA и 1,9% ALA, не EPA или DHA, и диета FO условии 1,4% EPA, 4,9% DHA, 0,32% LA, и 0,12% ALA. Через три недели после начала диеты липидных мышей вводили Интраректальное DNBS или 50% этанола и умерщвляли через 5 дней. Влиянammatory ответ оценивали по оценке потери веса, оценки гистологических повреждений и тканевой активности миелопероксидазы.

протокол

Процедуры, связанные с предметов животных следовать рекомендациям по уходу за животными, изложенные в уходу и использованию животных комитета институционального (IACUC) при Университете Британской Колумбии по.

Процедуры, упомянутые в данном протоколе будут описаны для обеих крыс и мышей, в то время как репрезентативные результаты будут представлены от Sprague-Dawley крыс.

1. Подготовка DNBS и интраректального введения

1. Для ректального закапывания DNBS у крыс, недавно готовить 15-30 мг DNBS/250 мкл 50% этанола. Для мышей, готовить 2-6 мг DNBS/100 мкл 50% этанола. Примечание: Оптимизация точную концентрацию DNBS для введения на каждом объекте. Самцов крыс Sprague-Dawley и мыши C57BL / 6, являются предпочтительными для индукции колита DNBS, однако другие мыши и крысы штаммы могут быть использованы. Мыши и крысы, обработанные только с 50%-ным этанолом можно использовать в качестве контрольных групп, однако, данный эффект этанола мягкая или отсутствует, можно Омит включение этой группы для исследования ^12.
2. Присоединить 1 мл шприц с иглой 19 G, который имеет полиэтиленовый катетер (РЕ-90 - крысы, или PE-50 - мыши), прикрепленный к его концу.
3. Слегка обезболить крыса или мышь опираясь на грелку (например, путем введения 1,5% изофлуран через носовой конус, животные все равно должны иметь мигать и глотательные рефлексы и отображения регулярное дыхание). Применить слезоточивый гель для своих глаз, чтобы избежать глаза высыхания.
4. Осторожно применять давление с пальцев на заднем конце животного, чтобы удалить любой стул, который может присутствовать в дистальном отделе толстой кишки.
5. Аккуратно вставьте катетер интраректально, с катетером, достигнув примерно 8 см проксимальнее ануса для крыс, или 3-4 см для мышей. Введите небольшое количество раствора при вставке катетер для смазки, что облегчает введение. Примечание: Если ощущается сопротивление во время установки катетера, не продолжайте вставить так как это может привести к перфорациикишечной стенки. Снимите катетер и попытаться аккуратно вставьте снова смазки двоеточие как продолжить.
6. Медленно введите 250 (крысы) или 100 (мышей) мкл DNBS или равный объем или 50% этанола для элементов управления. После впрыскивания DNBS, поместите животное вниз головой на 90 секунд, чтобы избежать потери DNBS.
7. После введения DNBS, кормить животных 8% сахарозы воду в 0,2% физиологическом растворе, чтобы предотвратить обезвоживание в течение первой недели.
8. Тщательно наблюдать за животными, с ежедневного мониторинга для похудения и признаков обезвоживания или бедствия в течение всего срока эксперимента. Примечание: Потеря веса может быстро подойти к CCAC рекомендации максимально допустимой потере веса. Так как это в основном происходит от обезвоживания, потеря веса должна быть использована в качестве индикатора для введения раствора Рингера с лактатом ограничить обезвоживание. Пожалуйста, не забудьте проконсультироваться с объектом, ветеринара по вопросам здравоохранения в зависимости от обстоятельств.

2. Колорадоllecting тканей и оценка гистологической Урон в DNBS зараженных мышей

1. В нужной точке времени после заражения DNBS, усыпить животных путем передозировки изофлураном в анестезирующего камере с добавлением достаточного количества кислорода. Соблюдайте животное, пока не растет или падает в груди не видно и нет ощутимой сердцебиение. Подтвердите животное было правильно эвтаназии отсутствие ответа до ног крайнем случае или прикосновения к роговице, а затем путем смещения шейных позвонков.
2. Откройте брюшную полость и удалить весь толстый кишечник. Открытый кишечник продольно; макроскопические язвы слизистой оболочки должны быть соблюдены примерно 5-6 см проксимально от дистального конца толстой кишки у крыс (2-3 см у мышей). Примечание: После удаления толстой кишки при желании оценить баллы макроскопических повреждений. Сбор сегменты толстой кишки от соответствующих анатомическое расположение от контрольных животных. Примечание: Лица, забивая ткани для оценки макроскопических ущерб долженбыть ослеплены к личности группах лечения. Оценка срезах тканей с использованием следующих или аналогичные критерии: степень и степень изъязвления (0-10), суммируется с баллов за отсутствие или наличие диареи (0 или 1), спаек (0, 1, или 2) и максимальной толстой толщиной стенки в миллиметрах ^11.
3. Сбор 0,5 см проксимально по отношению к секции участка максимального макроскопического повреждения. Привязать заморозить один 0,5 см раздел в жидком азоте, чтобы позже оценить миелопероксидазу (МПО) деятельности (мера инфильтрации нейтрофилов), и поместить в другую секцию в 10% нейтральном буферном растворе формалина для гистологического анализа. Примечание: замораживали тканей для миелопероксидаза анализ может храниться при -80 ° С в течение 1 месяца.
4. Разрешить ткани, собранные для гистологического анализа на этапе 2.3 исправить в формалине в течение ночи, а затем вымыть с 70% этанола. Вставить тканей в парафин и обрезать до нужного толщины (3-5 мкм), пятно с hemotoxylin и эозином (HE) для гистологического скоринга.
5. Есть два наблюдателя набрать хотя бы три срезах тканей от каждого животного под световым микроскопом, чтобы определить баллы гистологические повреждения для каждой группы. Примечание: Лица, забивая ткани для оценки гистологических повреждений должны быть ослеплены к личности группах лечения. Оценка срезах тканей с использованием следующих критериев или аналогичные: Объем инфильтрата воспалительных клеток (0 = отсутствует, 3 = трансмуральный), утрата архитектуры слизистой оболочки (0 = отсутствует, 3 = тяжелой), наличие или отсутствие крипт абсцессов (0-1) , и кубок истощение клеток (0-3). Определите счет гистологического повреждения в виде суммы этих баллов ^11.

3. Выполнение миелопероксидазы (MPO) Анализ на DNBS Challenged кишечной ткани

1. Анализ МПО активность в см толстой сегментов 0,5, полученных на стадии 2.3. Однородный ткани в MPO буфера гомогенизации (0,5% hexadecyltrimethyl-бромид в 50 мМ калий-фосфатного буфера (рН 6,0)) с получением 50 мг толстой кишки segmeNT / мл гомогенизации буфера подвески.
2. Аликвотировать гомогенизированного раствора в 1 мл порции и центрифуге при 4 ° С в течение 2 мин при 10000 х г.
3. Смешайте 100 мкл каждой аликвоты с 2,9 мл 50 мМ фосфатного буфера (рН 6,0), содержащим 0,167 мг / мл о-dianisidinedihydrochloride и 0,0005% пероксида водорода в кювете.
4. Измеряют скорость абсорбции с использованием спектрофотометра при 460 нм. Примечание: МРО-активности определяется как количество фермента, разрушающих 1 мкмоль / мин H ₂ O ₂ в H ₂ O при комнатной температуре и выражается в единицах на мг ткани.

Результаты

Вызов крыс (Sprague-Dawley) или мышей (C57BL / 6) с DNBS обычно приводит к временной потере веса и диареи, иногда с настоящее крови в стуле. Тем не менее, такие факторы, как генетика, диеты и кишечной микрофлоры могут изменять восприимчивость к DNBS индуцированного колита. Таким образом, животные включен...

Обсуждение

DNBS модель, описанная в этом протоколе является ценным, недорогой и воспроизводимый колит модель, которая может быть использована для изучения различных аспектов IBD. При введении интраректально в крыс или мышей, DNBS вызывает значительную степень воспаления и повреждения тканей в толсто?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 ml Syringe	BD Biosciences	309659
19 G Needle	BD Biosciences	305187
Polyethylene tubing PE-50	BD Biosciences	427517	for intrarectal administration in mice
Polyethylene tubing PE-90	BD Biosciences	427519	for intrarectal administration in rat
DNBS	MP Bio	150959
Tear gel	Novartis	63601662596
10% Formalin	Fisher	5F93-4
Warming pad	Kent Scientific	TPZ-0510
Ethanol	Fisher	A-962.4
Hexadecyltrimethyl-ammonium bromide	Sigma-Aldrich	H5882
Potassium phosphate buffer solution	Sigma-Aldrich	79628-
o-Dianisidine dihydrochloride	Sigma-Aldrich	D3252
30% H2O2	Sigma-Aldrich	31642	hydrogen peroxide
Spectrophotometer	BioRad	Benchmarker Plus
Light Microscope	Zeiss	Axio Image.Z1
Data analysis software program	GraphPad Software	GraphPad Prism Software Version 4.00	www.graphpad.com