DNBS / TNBS kolit Modelleri: Koliti içine Trendleri ve Diyet Yağ Etkileri sağlanması

Özet

DNBS / TNBS indüksiyonlu kolit bir alternatif ve iltihabik barsak hastalığı patobiyolojisini incelemek için pahalı olmayan yöntemi sunmaktadır. Bu yazıda tartışılan protokolü farelerde ve sıçanlarda kolit başlatmak için DNBS başarılı uygulama özetliyor ve bir iyice konak-aracılı bağırsak yanıtları çalışma sağlar.

Özet

Crohn hastalığı ve ülseratif kolit de dahil olmak üzere inflamatuvar bağırsak hastalığı (IBD), ve uzun bir genetik olarak bağlantılı olmuştur ve daha yakın zamanda mikrobiyal ajanlara ve çevresel bağışıklık tepkileri barındırması. Dinitrobenzen sülfonik asit (DNBS) kaynaklı kolit böyle bir stres ve beslenme, potansiyel tedavilerin etkileri ve mekanizmaları yatan bağırsak iltihabı ve mukozal hasarı gibi IBD ilişkili çevresel tetikleyiciler patogenezi çalışma sağlar. Bu yazıda, sıçanlarda DNBS kaynaklı kolit kolon mukozal inflamatuar yanıt üzerine diyet, n-3 ve n-6 yağ asitlerinin etkileri araştırıldı. Bütün sıçanlar [aspur yağı (SO), kanola yağı (CO), ya da balık yağı (FO)] üç hafta önce, maruz kalma DNBS intrarektal için yağ asitlerinin farklı hariç aynı diyetler beslenmiştir. Intrarektal etanol verilen Kontrol sıçanları DNBS-muamele edilmiş fareler ise beslenen lipid diyetler tüm los, 5 günlük çalışma boyunca kilo almaya devam ettiFO ve CO beslenen fareler, 48 saat ve 72 saat SO beslenen fareler tarafından önemli kilo kaybı gösteren ile t ağırlık. Kilo alımı 72 saat sonrası DNBS sonra tekrar başladı ve 5 gün sonrası DNBS tarafından, FO grup SO veya CO grupları daha yüksek vücut ağırlığı vardı. Kolon kesitleri 5 gün sonrası DNBS tedavi fokal ülserasyon, crypt yıkım, goblet hücre tükenmesi ve diyet gruplar arasında şiddeti farklıydı hem akut ve kronik inflamatuar hücrelerin mukozal infiltrasyon toplandı. SO beslenen grup CO ardından en ağır hasarı gösterdi, ve FO doku hasarının hafif derecesini gösterdi grupları beslenir. Benzer şekilde, myeloperoksidaz (MPO) aktivitesi, nötrofil aktivite belirteci FO beslenen fareler anlamlı düşük MPO aktivitesi olan, SO CO beslenen farelerde, ardından anlamlı olarak yüksek bulundu. IBD patogenezinde diyetin etkisini belirlemek için, bu protokolde tarif edildiği gibi bu sonuçlar DNBS kaynaklı kolit kullanımını göstermektedir.

Giriş

İnflamatuar barsak hastalığı (IBD), ishal, kilo kaybı, ve karın ağrısı semptomları ile sonuçlanan, gastro-intestinal (GI) sistemi içinde, kronik tekrarlayan bir inflamasyon ile karakterize edilir. Ülseratif kolit (UC) ve Crohn Hastalığı (CD) IBD iki biçimleridir ve GI sistemi içinde inflamasyon konumu ile ayırt edilebilir. UC hastalarda, tipik olarak, rektum iltihabı içerir ve sadece yüzeysel mukozayı etkileyen değişken bir oranda için kolon kadar bitişik olarak uzanır. Bu ağırlıklı olarak ileum ve çekum etkiler, ancak aksine, CD, GI sisteminin herhangi bir kısmını etkileyebilir. Transmural inflamasyon sıklıkla granülomlar ile ilişkili ve (fistülizan) hastalığı striktüre (fibrostenotik) ve / veya delici lider olarak CD sık tezahür eder. IBD etiyolojisi zor olmakla birlikte, iyi İBH bilgisayarlar arasında bağışıklık sistemi, genetik yatkınlık ve yanıtlayanların etkileşimler içeren multifaktöriyel olduğu kabul edilmektedirçevre ve mikrobiyal faktörlerle için ses.

Bugüne kadar, IBD farklı model UC ve CD karakteristik çeşitli klinik ve histolojik bağışıklık tepkilerini gösterdikleri önerilmiştir. En yaygın olarak kullanılan model, genetik olarak tadil edilmiş farelerin (IL-2, IL-10, SAMP / Yit), enfeksiyon kaynaklı modelleri (Citrobacter rodentium, Salmonella typhimurium), adoptif transfer modeller (CD45 + RB yüksek, SCID farelere CD62L + hücre transferi) içerir ve kimyasal olarak indüklenen kolit modeli (Dekstran Sülfat Sodyum (DSS), trinitrobenzen sülfonik asit (TNBS) ve dinitrobenzen sülfonik asit (DNBS)). Düşük maliyet ve hastalıkların hızlı başlaması nedeniyle, kimyasal modeller IBD çeşitli yönlerini çalışma için çok değerli olarak kabul edilir. Listelenen kimyasal kolit modellerin her İBH onların, klinik immünolojik ve histopatolojik alaka bazı yönlerden avantajları yanı sıra sınırlamaları vardır. DSS coli ikna etmek için kullanılan en yaygın kimyasal yöntemlerden biridirkemirgenlerde ¹ tis. % 3-10 DSS (MW: 42 kDa) uygulanması farelerin içme suyu içinde 7-10 gün boyunca semptom ve kilo kaybı, kan ishal, kolon kısalması, mukozal ülserasyon ve nötrofil infiltrasyon dahil kolit belirtileri neden olabilir. Bu model, ilaç tarama çalışmaları, hem de epitelyal rejenerasyon, mukozal homeostazı ile ilgili bağışıklık sisteminde etki ve bağırsak displazi ve adenokarsinoma gelişimi teşvik inflamasyonun rolünü mekanizmalarını için özellikle yararlıdır. Bazı derecesi ölçüde değişim ile sonuçlanan, farklı hayvan tesislerinde kolit başlatmak için gerekli DSS konsantrasyonu yanı sıra, fareler tarafından tutarsız su emme varyasyon ve DSS böylece tutarsız maruz kalma gibi DSS modeline dezavantajları, ve söz konusudur kolonda mukozal hasar ve ülserasyon dağıtımı. Tüm bu özellikler sonuçların heterojen yol ve çalışmalar fr çapında sonuçlarını karşılaştırmak yeteneğini sınırlayabilirom farklı araştırma grupları.

DSS modele alternatif kolit hapten kaynaklı DNBS veya TNBS modelleri. Bu model, mukozal maddeleri DNBS ya da etanol içinde değişen konsantrasyonlarda seyreltildi TNBS, duyarlı rektal instilasyon kullanmaktadır. Etanol idaresi lamina propria içine DNBS veya TNBS'nin nüfuz sağlamak için kolon mukoza engelini kırmak için bir ön koşuldur. DNBS / TNBS ardından böylece doğuştan gelen ev sahibi ve adaptif bağışıklık tepkileri tetikleyen İmmünojenik haline lokalize kolon ve bağırsak mikrobiyal proteinlerin haptenize olacaktır. Genel olarak, bu model şiddetli ve bazen kanlı ishal, kilo kaybı ve bağırsak duvarı kalınlaştırmanın ancak belirtileri kullanılan kemirgen türü, hem de zamanlaması, doz ve DNBS maruz kalma veya kullanılan TNBS derecesine bağlı olarak değişiklik ile ilişkili çalışma. Sıçanlar ve fareler arasında önemli ayrımlar daha düşük satın alma ve yönetim kurulu için maliyet yanı sıra Lowe faydaları ile dikkat edilmelidirin vivo tedavinin başına hayvan maliyetlerin düşürülmesi için r beden kitle. Bu daha kırılgan ve duyarlı hayvanlar hızlı bir şekilde insani bir son nokta ulaşabilir farelerde kolit daha hızlı ve şiddetli tabii ki, karşı koymak gerekir.

Bağırsak iltihabı, ilk artan epitel geçirgenliği, mukoza içine nüfuz mikrobiyal konak proteinlerin haptenization, hasarlı mukoza içine nötrofil, makrofaj ve Th1 T lemfositlerinin infiltrasyonu ile sonuçlanan tüm bu yol açan, bağırsak epitelial hücrelerine etanol neden olduğu hasarların sonuçları. DNBS ile karşılaştırıldığında, TNBS örneğin sodyum ve potasyum hidroksit gibi bazlar ile temas üzerine, bir patlama riski teşkil edebilir, son derece oksidatif özellikleri nedeniyle tehlikeli bir kimyasal olarak kabul edilmektedir. Bu nedenle DNBS anda kolit başlatmak için TNBS'nin üzerinde kimyasal bir tercih edilen seçenek olarak kabul edilir. Kemirgenlerde, DNBS kolit Follo çalışma için en uygun yöntemlerden biri olarak kabul edilirkanat İBH hastalığı nitelemeler ilişkili:

1. Depresyon ve kolit reaktivasyonu: Bu İBH hastalarında stres, anksiyete ve depresyon sıklıkla hastalığın nüks ile ilişkili olduğu gösterilmiştir. DNBS kolit farelerde kolit yeniden aktive edilmesi üzerine, depresyon ve sonuçları rolünü incelemek için uygun bir modeldir. Bu yöntem, genellikle 6-8 hafta içinde fareler bırakarak kolit çözünürlüğü ardından DNBS kolitin ilk uyarılmasını içerir. Daha sonra fareler DNBS ² bir subcolitic doz ile yükleme yoluyla kolit yeniden aktivasyonu için bunların test edilmesi, ardından depresyon oluşturmak için bu tip rezerpin gibi depresyon neden olan ajanlar ile ya da koku bulbectomy ile tatbik edilmektedir.
2. Stres ve kolit reaktivasyonu: Stres İBH patogenezinde bağlantılı olan diğer bir önemli çevresel faktör olduğunu. Kronik stres ve kemirgen Yeryüzündeki semptomların başlangıcı arasında güçlü bir ilişki olduğunu kanıtlar giderek artan bir vücut varinsan ve insan olmayan primatlarda ³ yanı sıra var. DNBS kolit fareler ve sıçanlarda kolit stres ilişkili reaktivasyonunu çalışmak için iyi bir modeldir. Yöntem, genellikle depresyon yerine dışında depresyon için yukarıda belirtildiği gibi benzer bir şekilde kullanılır, hayvanlar ve bu gibi sonik sınırlandırılmış stres ⁴ gibi stres maruz kalmaktadır.
3. Nörojenik iltihap: Bazı çalışmalar hayvan modellerinde ve IBD olan hastalardan alınan doku örneklerinde görüldüğü gibi enterik sinir sistemi (ENS) yapısı ve fonksiyonu, geçici veya kalıcı değişiklikler ya tanımlamışlardır. DNBS ENS ⁵ üzerinde iltihaplanma etkilerini araştırmak ve noradrenerjik ve kolinerjik sinir yolları ⁶ hem de çalışmak için iyi bir modeldir.
4. Yaralanma tamir mekanizmaları: IBD patogenezi sırasında, bu reaktif oksijen türleri (ROS), nitrik oksit (NO), hücreler arası yapışma molekülü 3 (ICAM-3) ve P-selektin gibi ev sahibi türevli yaralanma aracılar tüm p gösterilmiştirbağırsak epitel bozulması bir rol yatıyordu. DNBS bu aracıların up-regülasyonu yanı sıra seçici uyuşturucu veya inhibitörleri ^7,8 ile düzenlenir onarım mekanizmaları nedeniyle yaralanmalara incelemek için mükemmel bir model.
5. Transmural enflamasyon: DNBS yukarıda belirtilen uygulamalara ilave olarak, model aynı zamanda bağırsak transmural enflamasyon, CD'li hastalardan bulunan klasik bir özelliği çalışma uygulanabilir. DNBS ve TNBS ile indüklenen kolit, her ikisi de T-hücresi bağımlı bağışıklık mekanizmaları incelemek için, bu model, özellikle faydalı bir hale getirir kolon mukozası içine, lenfositlerin önemli bir infiltrasyonu ile ilişkilidir.

DSS modeli ile karşılaştırıldığında, DNBS ile TNBS ile indüklenen kolit avantajlar arasınnda, düşük maliyet, kolit hızlı bir gelişme (ülser çoğunlukla yeniden üretilebilmekte ve iltihap göstermek için 1-3 gün gerektirir) ve distal kolon tutarlı lokalize hasar bulunmaktadır. Ancak sakıncaları bir için bir gereklilikteknik uzmanlık, DNBS / TNBS dozunun optimizasyonu, ve rektal uygulama için anestezi için ihtiyaç daha yüksek düzeyde.

Bu metodolojik yazıda (SO) bitkisel yağlar, papağanyemi yağı kullanılarak sıçanlarda DNBS indüklediği kolit için kolon mukoza yanıtı değiştiren on n-6 ve n-3 çoklu doymamış yağ asitlerinin değişik konsantrasyonlarda etkilerini inceledi ve kanola yağı, (CO) ve balık yağı (FO). Bu, n-6 ve n-3 yağ asitleri, hücre zarı phosopholipids ⁹ asil parçalar olarak oynadıkları rol bağırsak iltihaplı hastalıkların önemli aracılar olduğu gösterilmiştir. N-6 yağ asitleri proenflamatuar potansiyel aksine, yeterince yüksek alımı, n-3 yağ asitleri, potansiyel olarak güçlü anti-enflamatuar maddelerdir. N-3 yağ asitlerinin anti-inflamatuar etkileri proinfl değiştirilmesi yoluyla dolaylı olarak arakidonik asit metabolizma ve önleme, bir alt-tabaka olarak eicosanoid arakidonik asit yerine doğrudan aracılık ederammatory gen ekspresyon ve hücre sinyal. N-3 yağ asitleri, aynı zamanda, resolvins anti-iltihap aracılarının bir aile neden olmaktadır. N-3 yağ asitlerinin yüksek alımı proenflamatuar eikosanoidler, sitokinler, kemokinler, reaktif oksijen türleri ve yapışma moleküllerinin ifade üretiminde bir azalma ile ilişkilidir. Bu çalışmada fareler ile, yağ asitleri dışındaki tüm besinler aynı ad libitum diyetler beslenmiştir yağ,% 20 SO, 20% CO veya% 18 balık yağı artı% 2 aspur yağı (FO) ^10-11 bir yüzde enerji olarak . Günlük enerjisinin bir yüzdesi olarak, SO diyet <% 0,06 α-linolenik asit (ALA) ve hiçbir eikosapentaenoik asit (EPA) ve dokosaheksaenoik asit (DHA) olan,% 15 linoleik asit (LA) sağlanan, CO diyet 4.2 oldu % LA ve ALA% 1.9 no EPA veya DHA ile ve FO diyet% 1.4 EPA, DHA% 4.9,% 0.32 LA, ALA ve% 0.12 verdi. Üç hafta lipid diyetler başlandıktan sonra, fareler, intrarektal DNBS ya da% 50 etanol verilir ve 5 gün sonra kurban edilmiştir. Inflammatory tepki kilo kaybı, histolojik hasar skorları ve doku myeloperoksidaz aktivitesinin değerlendirilmesi ile değerlendirildi.

Protokol

Hayvan denekleri prosedürleri British Columbia Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından açıklanan hayvan bakım yönergeleri izleyin.

Temsilci sonuçlar Sprague-Dawley sıçanlarından sunulacak ise bu protokolde belirtilen prosedürler, sıçanlar ve fareler hem de tarif edilecektir.

1.. DNBS ve intrarektal İdaresi hazırlanması

1. Sıçanlarda DNBS rektal damlatılması için, taze% 50 etanol DNBS/250 ul 15-30 mg hazırlar. Fareler için,% 50 etanol DNBS/100 ul 2-6 mg hazırlar. Not: Her bir tesiste uygulanacak kesin DNBS konsantrasyonunu optimize. Erkek Sprague-Dawley sıçanları ve C57BL / 6 fareleri, ancak diğer fare ve sıçan suşları kullanılabilir DNBS kolit indüksiyonu için tercih edilir. Kontrol grupları, ancak bir Omi olabilir etanolün etkilerini verilen hafif ya da mevcut olmadığı gibi sadece% 50 etanol ile muamele edilmiş fareler ve sıçanlar kullanılabilirbir çalışma ¹² için bu grubun dahil t.
2. Sonuna bağlanmış (farenin - - sıçan ya da PE-50 PE-90), bir polietilen kateter sahip olan bir 19 G iğne ile bir 1 ml şırınga takın.
3. Hafif bir ısıtma yastığı sıçan veya fare istirahat uyutmak (burun konisi üzerinden% 1.5 izofluran verilerek, örneğin hayvanlar yine göz kırpma ve yutma refleksleri var ve düzenli solunum göstermelidir). Kurumasını önlemek için gözlerini onun gözlerine gözyaşı jeli uygulayın.
4. Yavaşça uzak kolonda mevcut olabilecek herhangi bir dışkı çıkarmak için hayvanın arka ucuna parmak uçları ile basınç uygulanır.
5. Yavaşça fareler için sıçan, veya 3-4 cm için anüs için yaklaşık 8 cm proksimal ulaşan kateter ile, intrarektal kateter yerleştirin. Kolay sokulmasına izin veren, yağlamak için kateteri sokulurken çözeltinin küçük bir miktar enjekte edilir. Not: kateterin yerleştirilmesi sırasında herhangi bir direnç hissedilir ise, bu delinmesi yol açabilir olarak eklemek devam etmeyinbağırsak duvarı. Kateteri çıkarın ve tekrar işlem olarak kolon yağlama, yavaşça yeniden takın girişimi.
6. Yavaş yavaş 250 (sıçan) ya da 100 (fare) DNBS ul ya da kontroller için eşit hacimde% 50 etanol ya da enjekte edilir. DNBS enjekte ettikten sonra, DNBS kaybını önlemek için 90 saniye boyunca hayvan baş aşağı yerleştirin.
7. DNBS verilmesinden sonra, ilk hafta boyunca su kaybını önlemek için% 0.2 tuzlu su içinde% 8 sükroz hayvanların suya doyurmaya.
8. Dikkatle kilo kaybı ve deney süresince dehidratasyon veya rahatsızlığı işaretleri için günlük izleme ile, hayvanlar dikkat edin. Not: Kilo kaybı hızla maksimum izin verilen ağırlık kaybı CCAC öneriler yaklaşım olabilir. Bu çoğunlukla dehidratasyon türetilmiş için, kilo kaybı dehidratasyon sınırlamak laktatlanmış Ringer çözeltisi uygulanması için bir gösterge olarak kullanılır. Uygun olarak sağlık sorunları üzerinde tesis veteriner danışın emin olun.

2. CoDokular llecting ve DNBS Engelliler Fareler histolojik hasarı değerlendirilmesi

1. DNBS ile denemeden sonra arzu edilen bir zaman noktasında, yeterli oksijen ile takviye edilmiş bir anestezi bölmesi içerisinde izofluran ile doz aşımı ile hayvanlar ötenazi. Hiçbir yükselen veya göğüs düşen görüldüğü kadar hayvan gözlemlemek ve palpe kalp atışı var. Onay hayvan doğru servikal dislokasyon ayak tutam veya korneanın dokunma için bir yanıt, yokluğu ile kurban edilmiştir.
2. Karın boşluğu açın ve tüm kalın bağırsak kaldırın. Uzunlamasına bağırsak açın, makroskopik mukozal ülser farelerde kolon (farelerde 2-3 cm) en uzak ucundan itibaren yaklaşık olarak 5-6 cm proksimal dikkat edilmelidir. Not: İsterseniz kalın bağırsak çıkardıktan sonra, makroskopik hasar puanları değerlendirmek. Kontrol hayvanların anatomik konuma karşılık gelen kolon segmentleri toplayın. Not: makroskopik hasar puanları için doku puanlama bireyler olmalıdırTedavi gruplarının kimliğine kör. Şiddeti ve ülserasyon ölçüde (0-10), ya da yokluğunda ishal varlığında (0 ya da 1), adezyonlar (0, 1, ya da 2) ve maksimal kolonik duvar kalınlığı için puan ile özetlenebilir: Aşağıdaki veya benzer kriterler kullanılarak doku bölümleri Skor ¹¹ milimetre.
3. 0.5 cm bölümler maksimal makroskopik hasar sitesine proksimaline toplayın. Daha sonra ek bileşen miyeloperoksidaz (MPO) aktivitesi (nötrofil infiltrasyonu bir ölçüsü) değerlendirmek ve histolojik analiz için% 10 nötr tamponlu formalin içinde diğer bölümü yerleştirmek için sıvı azot içinde bir 0.5 cm bölüm dondurma. Not: miyeloperoksidaz deney kadar 1 ay boyunca -80 ° C 'de muhafaza edilebilir için donmuş dokular çekin.
4. Adım 2.3 histolojik analiz için toplanan dokular gecede formalin düzeltmek ve daha sonra% 70 etanol ile yıkayın izin verin. Parafin dokuları embed ve istenilen kalınlıkta (3-5 mikron), histolojik puanlama için hemotoksilinle ve eozin (HE) ile leke kesilir.
5. Iki gözlemci, her bir grup için histolojik hasarı puanları belirlemek için, bir ışık mikroskobu altında, her bir hayvandan en az üç doku bölümleri puan yazıldı. Not: histolojik hasar skorları için doku puanlama bireylerin tedavi gruplarının kimliğine kör olmalıdır. Enflamatuar hücre infiltratın ölçüde (0 = yok, 3 = Transmural), mukozal mimari kaybı (0 = yok, 3 = şiddetli), varlığı ya da crypt apseler yokluğu (0-1): Aşağıdaki veya benzer kriterler kullanılarak doku bölümleri Puan ve goblet hücre tükenmesi (0-3). Bu puan ¹¹ toplamı olarak histolojik hasar puanı belirler.

3. DNBS üzerine Miyeloperoksidaz (MPO) Tahlili Sahne Engelliler Bağırsak Dokusu

1. Adım 2.3 'de elde edilen 0.5 cm kolon segmentlerinde Deneyi MPO aktivitesi. MPO homojen hale getirme tamponunda dokular 50 mg kolon segme vermek üzere (50 mM potasyum fosfat tamponu içinde% 0.5 heksadesiltrimetil-amonyum bromür (pH 6.0)) homojenizehomojenizasyon tamponu süspansiyonu nt / ml.
2. 10,000 x g, 2 dakika boyunca 4 ° C 'de 1 ml kısımlar ve santrifüj içine homojenize çözeltisi kısım.
3. O-dianisidinedihydrochloride 0.167 mg / ml ve bir küvet içinde,% 0.0005, hidrojen peroksit içeren 2.9 ml 50 mM fosfat tampon maddesi (pH 6.0) ile her bir kısım 100 ul karıştırın.
4. 460 nm'de bir spektrofotometre kullanılarak emme oranını ölçmek. Not: MPO aktivitesi, oda sıcaklığında, ₂ H, H ₂ O O ₂ 1 umol / dak bozundurucu enzim miktarı olarak tanımlanır ve doku mg başına birim olarak ifade edilir.

Sonuçlar

DNBS ile sıçan (Sprague-Dawley) veya farelerde (C57BL / 6) Challenge tipik bazen dışkıda kan varken, geçici kilo kaybı ve ishal sonuçları. Ancak, bu tür genetik, beslenme ve intestinal mikrobiyota gibi faktörler DNBS indüklenen duyarlılık değiştirebilir. Bu nedenle, hayvan deneylerinde dahil lokal olarak türetilmiş ya da bir hayvan tedarikçiden sipariş ya da, aynı kurumdan olmalıdır. Tüm hayvanlar dikkatle kilo kaybı ve kolit sırasında uğradığı sıkıntı belirtilerinin derecesi için izle...

Tartışmalar

Bu protokol açıklanan DNBS IBD modeli çeşitli yönlerini incelemek için kullanılabilir değerli, ucuz ve tekrarlanabilir kolit modelidir. Sıçan veya intrarektal farelere verildiği zaman, DNBS polimorfonükleer hücrelerin infiltrasyonu transmural ve baskın NF-KB-bağımlı Th1 aktivasyonu dahil, çeşitli histolojik özellikleri açısından insan Crohn hastalığı benzeyen, kolon enflamasyonun ve doku hasarının önemli bir derecede neden olur.

Bu model, stres, depresyon, ve diy...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 ml Syringe	BD Biosciences	309659
19 G Needle	BD Biosciences	305187
Polyethylene tubing PE-50	BD Biosciences	427517	for intrarectal administration in mice
Polyethylene tubing PE-90	BD Biosciences	427519	for intrarectal administration in rat
DNBS	MP Bio	150959
Tear gel	Novartis	63601662596
10% Formalin	Fisher	5F93-4
Warming pad	Kent Scientific	TPZ-0510
Ethanol	Fisher	A-962.4
Hexadecyltrimethyl-ammonium bromide	Sigma-Aldrich	H5882
Potassium phosphate buffer solution	Sigma-Aldrich	79628-
o-Dianisidine dihydrochloride	Sigma-Aldrich	D3252
30% H2O2	Sigma-Aldrich	31642	hydrogen peroxide
Spectrophotometer	BioRad	Benchmarker Plus
Light Microscope	Zeiss	Axio Image.Z1
Data analysis software program	GraphPad Software	GraphPad Prism Software Version 4.00	www.graphpad.com