Modèles DNBS / TNBS colite: Fournir connaissances sur les maladies inflammatoires de l'intestin et des effets de graisses alimentaires

Résumé

DNBS / TNBS colite induite propose une méthode alternative et peu coûteuse pour étudier la pathobiologie de la maladie inflammatoire de l'intestin. Le protocole décrit dans ce document décrit l'application réussie de DNBS pour induire la colite chez les souris et les rats et permet d'étudier en profondeur les réponses intestinales médiés par l'hôte.

Résumé

Les maladies inflammatoires de l'intestin (MICI), y compris la maladie de Crohn et la colite ulcéreuse, ont longtemps été associées à une base génétique, et accueillir plus récemment réponses immunitaires aux agents microbiens et environnementaux. Colite Dinitrobenzene acide sulfonique (DNBS) induite permet d'étudier la pathogenèse des MICI déclencheurs environnementaux associés tels que le stress et l'alimentation, les effets des thérapies potentielles, et les mécanismes de blessure de l'inflammation intestinale et de la muqueuse sous-jacente. Dans cet article, nous avons étudié les effets des acides n-3 et n-6 gras alimentaires sur la réponse inflammatoire de la muqueuse colique de DNBS colite induite chez le rat. Tous les rats ont été nourris avec les régimes alimentaires identiques à l'exception des différents types d'acides gras [huile de carthame (SO), l'huile de canola (CO), ou d'huile de poisson (FO)] pendant trois semaines avant l'exposition à intrarectale DNBS. Les rats témoins proposés éthanol rectale ont continué à prendre du poids au cours de l'étude de 5 jours, alors que, chez le rat DNBS traités recevant une ration de lipides tous lost de poids des rats nourris CO FO et montrant une perte de poids significative de 48 h et les rats nourris SO de 72 h. Le gain de poids repris après 72 h DNBS de poste, et par 5 DNBS jours de poste, le groupe FO eu un poids supérieur à SO ou CO. Sections du côlon recueillies 5 jours après DNBS traitement a montré une ulcération focale, la destruction crypte, l'épuisement des cellules à mucus, et la muqueuse infiltration de deux cellules inflammatoires aigus et chroniques qui diffèrent en gravité parmi les groupes alimentaires. Le groupe SO nourris a montré les dégâts les plus graves suivie par le CO, et FO alimenté groupes qui ont montré le degré le plus doux de la lésion tissulaire. De même, la myéloperoxydase colique (MPO), un marqueur de l'activité des neutrophiles était significativement plus élevée chez les rats SO suivie CO alimentés, des rats nourris avec FO ayant une activité nettement plus faible MPO. Ces résultats démontrent l'utilisation de la colite induite DNBS, comme indiqué dans ce protocole, afin de déterminer l'impact de l'alimentation dans la pathogenèse des MICI.

Introduction

Une maladie intestinale inflammatoire (IBD) est caractérisée par une inflammation chronique récidivante dans le tractus gastro-intestinal (GI), ce qui entraîne des symptômes de la diarrhée, la perte de poids, et des douleurs abdominales. Rectocolite hémorragique (RCH) et la maladie de Crohn (MC) sont les deux formes principales de l'IBD, et peuvent être distingués par la localisation de l'inflammation dans le tractus gastro-intestinal. Chez les patients UC, l'inflammation implique généralement le rectum et s'étend de manière contiguë le colon pour un degré variable affectant seulement la muqueuse superficielle. En revanche, les CD peut affecter n'importe quelle partie du tractus gastro-intestinal, même si elle touche principalement l'iléon et le caecum. CD manifeste fréquemment que l'inflammation transmurale souvent associée à des granulomes et conduisant à sténosante (fibrostenotic) et / ou de pénétration (fistulizing) maladie. Bien que l'étiologie des MICI reste insaisissable, il est bien admis que l'EIA est multifactorielle, impliquant des interactions entre les hôtes du système immunitaire, la susceptibilité génétique et responsabilitésession à des facteurs environnementaux et microbiens.

À ce jour, les différents modèles de MII ont été proposées afficher diverses réponses cliniques, histologiques et immunitaires caractéristiques de l'UC et CD. Les modèles les plus couramment utilisés sont des souris génétiquement modifiées (IL-2, IL-10, SAMP / Yit), infection des modèles induits (Citrobacter rodentium, Salmonella typhimurium), les modèles de transfert adoptif (CD45 + RB haut, transfert de cellules CD62L + dans des souris SCID) et modèles de colite induite chimiquement (Dextran Sodium Sulfate (DSS), de l'acide sulfonique trinitrobenzène (TNBS), et l'acide sulfonique Dinitrobenzene (DNBS)). En raison de leur faible coût et l'apparition rapide de la maladie, les modèles chimiques sont considérés comme précieux pour l'étude des divers aspects de l'EIA. Chacun des modèles de colite chimiques énumérés présente des avantages ainsi que des limitations dans certains aspects de leur pertinence clinique, immunologique et histopathologique de l'EIA. DSS est une des méthodes chimiques les plus couramment employés pour induire colitis en ^une rongeurs. Administration de 3-10% DSS (MW: 42 kDa) pendant 7-10 jours dans l'eau de boisson des souris peut induire des symptômes et des signes de colite y compris la perte de poids, diarrhée avec du sang, le raccourcissement du côlon, ulcération de la muqueuse et l'infiltration de neutrophiles. Ce modèle est particulièrement utile pour les études de criblage de médicaments, ainsi que d'explorer les mécanismes de régénération épithéliale, l'impact de l'immunité innée sur homéostasie de la muqueuse, et le rôle de l'inflammation dans la promotion de la dysplasie intestinale et le développement de l'adénocarcinome. Il ya cependant quelques inconvénients du modèle DSS, y compris la variation de la concentration de DSS nécessaire pour induire la colite dans différentes installations pour les animaux, ainsi que l'absorption d'eau incompatible par la souris et l'exposition donc incompatible MAS, résultant de la variation dans le degré, l'étendue et distribution des lésions de la muqueuse et une ulcération dans le côlon. Toutes ces caractéristiques conduisent à l'hétérogénéité des résultats et limitent la capacité de comparer les résultats entre les études frdifférents groupes de recherche de l'OM.

Une alternative au modèle DSS est induite par le DNBS haptène ou des modèles de colite TNBS. Ce modèle emploie instillation rectale de la muqueuse sensibiliser les agents DNBS ou TNBS, dilué à des concentrations variables d'éthanol. L'administration de l'éthanol est une condition préalable à briser la barrière de la muqueuse du côlon pour permettre la pénétration de DNBS ou TNBS dans la lamina propria. DNBS / TNBS alors haptenize les protéines du côlon et de l'intestin microbiennes localisées pour devenir immunogène, déclenchant ainsi l'hôte innée et l'immunité adaptative. En général, ce modèle est associé à la diarrhée sévère et parfois sanglante, la perte de poids et intestinal épaississement de la paroi mais les symptômes varient en fonction du type de rongeur utilisé, ainsi que le moment, la dose et le degré d'exposition à la DNBS ou de TNBS utilisé dans l' étude. Distinctions importantes entre les rats et les souris sont à noter, avec les avantages d'un coût moindre pour l'achat et le conseil, ainsi que Lower de masse corporelle pour diminuer les coûts par animal en rapport avec un traitement in vivo. Cela devrait être réglé contre le cours plus rapide et sévère de colite chez la souris, où les animaux les plus fragiles et sensibles peuvent rapidement atteindre un point de terminaison humaine.

L'inflammation intestinale initialement en résulte dans de l'éthanol dégâts liés aux cellules épithéliales de l'intestin, conduisant à une augmentation de la perméabilité épithéliale, la pénétration microbienne dans la muqueuse, haptenization de protéines de l'hôte, tout ceci résultant de l'infiltration de neutrophiles, les macrophages et les lymphocytes Th1 T dans la muqueuse endommagée. En comparaison à DNBS, TNBS est considéré comme un produit chimique dangereux en raison de ses propriétés hautement oxydatif qui peut présenter un risque d'explosion au contact de bases tels que le sodium et l'hydroxyde de potassium. Par conséquent DNBS est actuellement considéré comme un premier choix de produit chimique sur TNBS pour induire la colite. Chez les rongeurs, DNBS colite est considéré comme l'une des méthodes les plus commodes pour étudier la suiIBD aile modificateurs de la maladie associée:

1. La dépression et la réactivation de la colite: Il a été démontré que le stress, l'anxiété et la dépression chez les patients atteints de MII sont souvent associées à une rechute de la maladie. DNBS colite est un modèle approprié pour étudier le rôle de la dépression et ses conséquences sur la réactivation de la colite chez les souris. Le procédé implique typiquement l'induction initiale de la colite par DNBS, suivie par la résolution de la colite en laissant les souris pendant 6-8 semaines. Les souris sont ensuite administrés à la dépression agents pathogènes comme la réserpine ou par bulbectomy olfactif provoquer une dépression suivie en les testant pour la réactivation de la colite par défi avec une dose de subcolitic DNBS ^2.
2. Le stress et la réactivation de la colite: Le stress est un autre facteur environnemental commun qui a été liée à la pathogenèse MII. Il ya un nombre croissant de preuves qui suggère une forte association entre le stress chronique et l'apparition des symptômes de l'UC et CD chez les rongeurss ainsi que chez les humains et les primates non humains ^3. DNBS colite est un bon modèle pour étudier le stress associé à la réactivation de la colite chez les souris et les rats. La méthode est généralement utilisée de la même façon que ci-dessus pour la dépression, sauf en place de la dépression, les animaux sont exposés à des facteurs de stress tels que le stress sonore et de retenue ^4.
3. Inflammation neurogène: Un certain nombre d'études ont décrit soit modifications transitoires ou permanentes dans le système nerveux entérique (ENS) de la structure et de la fonction, comme on le voit dans les échantillons de tissus provenant de modèles animaux et de patients atteints de MICI. DNBS est un bon modèle pour étudier les effets de l'inflammation sur l'ENS ⁵ et à étudier à la fois noradrénergique et voies nerveuses cholinergiques ^6.
4. Mécanismes blessure de réparation: Lors de l'EIA pathogenèse, les médiateurs de blessures accueil dérivés tels que les espèces réactives de l'oxygène (ROS), l'oxyde nitrique (NO), une molécule d'adhésion intercellulaire 3 (ICAM-3), et la P-sélectine ont tous été montré pour pjeter un rôle dans la perturbation de l'épithélium intestinal. DNBS est un excellent modèle pour étudier les blessures causées par la sur-régulation de ces médiateurs ainsi que des mécanismes de réparation qui sont réglementés par l'utilisation de médicaments sélectifs ou des inhibiteurs ^7,8.
5. Inflammation transmurale: En plus des applications de DNBS mentionnés ci-dessus, le modèle peut également être appliquée à l'étude inflammation transmurale de l'intestin, une caractéristique classique trouvé dans les patients atteints de MC. Les deux DNBS et la colite induite par le TNBS sont associées à une infiltration importante de lymphocytes, dans la muqueuse colique rendre ces modèles particulièrement utile pour étudier les mécanismes immunitaires dépendantes des lymphocytes T.

En comparaison avec le modèle DSS, les avantages de DNBS et la colite induite par le TNBS comprennent faible coût, le développement rapide de la colite (nécessite habituellement 1-3 jours pour montrer ulcération reproductible et de l'inflammation) et des dommages localisés conforme à la partie distale du côlon. Toutefois, les inconvénients sont une exigence pour unle niveau d'expertise technique, l'optimisation de la dose DNBS / TNBS, et la nécessité d'une anesthésie pour l'administration rectale.

Dans le présent document méthodologique, nous avons étudié les effets de différentes concentrations de n-6 et n-3 sont des acides gras polyinsaturés sur la modification de la réponse de la muqueuse colique de colite DNBS induite chez le rat en utilisant le huiles végétales huile de carthame (SO) et l'huile de canola (CO) , et l'huile de poisson (FO). Il a été montré que les acides n-6 et n-3 acides gras sont des médiateurs importants de la maladie inflammatoire intestinale par leur rôle en tant que groupements acyle de phosopholipids de la membrane cellulaire ^9. En revanche le potentiel pro-inflammatoire des n-6 acides gras n-3 les acides gras à suffisamment grande consommation sont potentiellement des agents anti-inflammatoires. Les actions anti-inflammatoires de la série n-3 des acides gras sont médiés directement à travers le remplacement de l'acide arachidonique en tant que substrat d'eicosanoïdes, l'inhibition du métabolisme de l'acide arachidonique et indirectement par la modification de proinfll'expression du gène ammatoires et la signalisation cellulaire. Les acides gras n-3 donnent également lieu à résolvines, une famille de médiateurs anti-inflammatoires. Une forte consommation de n-3 des acides gras est associée à une diminution de la production d'eicosanoïdes pro-inflammatoires, des cytokines, des chimiokines, des espèces réactives de l'oxygène et de l'expression des molécules d'adhésion. Dans cette étude, les rats ont été nourris ad régimes libitum identiques dans tous les nutriments à l'exception des acides gras, avec comme source d'énergie pour cent de matières grasses, 20% de SO, 20% de CO, ou 18% d'huile de poisson plus 2% d'huile de carthame (FO) ^10-11 . En pourcentage de l'énergie quotidienne, le régime SO fourni 15% d'acide linoléique (LA), avec <0,06% α-linolénique (ALA) et pas d'acide eicosapentaénoïque (EPA) ou de l'acide docosahexaénoïque (DHA), le régime de CO avait 4.2 % LA et ALA 1,9% sans l'EPA ou DHA, et l'alimentation FO fourni 1,4% de l'EPA, DHA 4,9%, 0,32% LA et ALA 0,12%. Trois semaines après l'initiation de l'alimentation de lipides, les souris ont été administrés DNBS intrarectale ou 50% d'éthanol et sacrifiés 5 jours plus tard. L'inflammatoires réponse a été évaluée par l'évaluation de la perte de poids, des lésions histologiques de partitions et de l'activité de la myéloperoxydase des tissus.

Protocole

Procédures portant sur des sujets d'animaux suivent les directives de protection des animaux énoncées par le soin et l'utilisation des animaux Commission institutionnelle (IACUC) à l'Université de la Colombie-Britannique.

Procédures mentionnées dans ce protocole seront décrits pour les rats et les souris, alors que les résultats représentatifs seront présentés à partir de rats Sprague-Dawley.

Une. Préparation de DNBS et de l'administration intrarectale

1. Pour instillation rectale de DNBS chez le rat, fraîchement préparer 15-30 mg de DNBS/250 ul de 50% d'éthanol. Pour les souris, préparer 2-6 mg de DNBS/100 ul d'éthanol à 50%. Remarque: Optimiser la concentration de DNBS exacte à administrer à chaque installation. Des rats mâles Sprague-Dawley et des souris C57BL / 6 sont préférés pour l'induction de la colite DNBS, cependant, d'autres souches de souris et de rat, peuvent être utilisés. Les souris et les rats traités seulement avec 50% d'éthanol peuvent être utilisés comme groupes témoins mais étant donné les effets de l'éthanol sont doux ou absent, on peut omit l'inclusion de ce groupe pour une étude ^{de 12.}
2. Attacher une seringue de 1 ml à une aiguille G 19, qui a un cathéter en polyethylene (PE-90 - les rats ou PE-50 - souris) fixée à son extrémité.
3. Légèrement anesthésier le rat ou de repos de la souris sur un coussin chauffant (par exemple en administrant 1,5% d'isoflurane par cône, les animaux devraient toujours avoir le réflexe palpébral et de la déglutition et de la respiration régulière afficher). Appliquer le gel lacrymogène à ses yeux pour éviter les yeux se dessécher.
4. Appuyez doucement du bout des doigts à l'extrémité postérieure de l'animal pour éliminer toute selles qui peuvent être présents dans le côlon distal.
5. Insérez délicatement le cathéter intra-rectale, avec le cathéter pour atteindre environ 8 cm de l'anus chez les rats, ou 3-4 cm pour les souris. Injecter une petite quantité de la solution lors de l'insertion du cathéter à lubrifier, ce qui permet l'insertion facile. Remarque: Si une résistance se fait sentir lors de l'insertion du cathéter, ne continuez pas à insérer car cela peut mener à la perforation dela paroi intestinale. Retirer le cathéter et tenter de réinsérer doucement, lubrification à nouveau le côlon procédure.
6. Injecter lentement 250 (rats) ou 100 (souris) ul de DNBS, ou un volume égal ou 50% d'éthanol pour les contrôles. Après injection de la DNBS, positionner l'animal la tête en bas pendant 90 secondes pour éviter la perte de la DNBS.
7. Après administration DNBS, nourrir les animaux 8% d'eau de saccharose dans une solution saline à 0,2% pour éviter la déshydratation au cours de la première semaine.
8. Observer attentivement les animaux, avec un suivi quotidien pour perdre du poids et des signes de déshydratation ou de détresse pour la durée de l'expérience. Remarque: La perte de poids peut approcher rapidement les recommandations du CCPA de perte de poids maximal admissible. Depuis ce essentiellement dérivée de la déshydratation, perte de poids doit être utilisé comme un indicateur de l'administration de la solution de Ringer lactate pour limiter la déshydratation. S'il vous plaît assurez-vous de consulter le vétérinaire de l'établissement sur les questions de santé, le cas échéant.

2. Collecting tissus et l'évaluation des dommages histologiques dans DNBS de souris infectées

1. Au point de temps souhaité après la provocation avec DNBS, euthanasier les animaux par surdosage avec de l'isoflurane dans une chambre d'anesthésie complété avec suffisamment d'oxygène. Observer l'animal jusqu'à ce qu'il ne montant ou descendant de la poitrine est vu et il n'ya pas de rythme cardiaque palpable. Confirmez l'animal a été correctement euthanasiés par l'absence d'une réponse à pincement de l'orteil ou toucher de la cornée, suivie par dislocation cervicale.
2. Ouvrez la cavité abdominale et enlever le gros intestin. Ouvrir l'intestin longitudinalement; ulcères des muqueuses macroscopiques doivent être observés à environ 5-6 cm en amont de l'extrémité distale du côlon chez le rat (2-3 cm chez la souris). Remarque: Après avoir retiré le gros intestin, évaluer les dommages macroscopiques scores si désiré. Rassembler les segments de côlon de localisation anatomique correspondant des animaux témoins. Remarque: Les personnes obtenant le tissu pour dommages macroscopiques scores devraientêtre aveuglé à l'identité des groupes de traitement. Note des coupes de tissus à l'aide des critères suivants ou similaires: gravité et l'étendue de l'ulcération (0-10), a résumé avec des scores de l'absence ou de la présence de diarrhée (0 ou 1), des adhérences (0, 1 ou 2) et de l'épaisseur de la paroi colique maximale en millimètres ^11.
3. Recueillir des coupes de 0,5 cm à proximité du site de dommages macroscopique maximale. Aligner geler une section de 0,5 cm dans l'azote liquide à évaluer plus tard la myéloperoxydase (MPO) (une mesure de l'infiltration de neutrophiles), et placer l'autre partie dans 10% du formol tamponné neutre pour l'analyse histologique. Remarque: Enclenchez tissus congelés pour le dosage de la myéloperoxydase peut être conservé à -80 ° C pendant 1 mois.
4. Laisser les tissus prélevés pour l'analyse histologique à l'étape 2.3 de fixer dans le formol nuit, puis laver avec de l'éthanol à 70%. Incluez les tissus dans de la paraffine et coupé à l'épaisseur désirée (3-5 um), la tache avec de l'hématoxyline et de l'éosine (HE) pour la notation histologique.
5. Ont deux observateurs marquer au moins trois sections de tissus de chaque animal sous un microscope optique pour déterminer les dommages histologiques scores pour chaque groupe. Remarque: Les personnes obtenant le tissu pour les dommages histologiques scores devraient être aveuglés à l'identité des groupes de traitement. Note des coupes de tissus à l'aide des critères suivants ou similaires: mesure de l'infiltrat de cellules inflammatoires (0 = absent, 3 = transmurale), la perte de l'architecture de la muqueuse (0 = absent, 3 = sévère), la présence ou l'absence d'abcès cryptiques (0-1) , et l'épuisement des cellules à mucus (0-3). Déterminer histologique score de dégâts que la somme de ces scores ^11.

3. Exécution myéloperoxydase (MPO) Essai sur DNBS contesté tissu intestinal

1. l'activité de MPO de dosage dans les segments 0,5 cm du côlon obtenus dans l'étape 2.3. Homogénéiser les tissus dans du tampon d'homogénéisation (MPO hexadécyltriméthylammonium 0,5%-bromure d'ammonium dans du tampon phosphate de potassium 50 mM (pH 6,0)) pour donner deux points segme 50 mgnt / ml de suspension homogénéisation tampon.
2. Aliquoter la solution homogénéisée dans 1 ml portions et centrifugation à 4 ° C pendant 2 min à 10 000 x g.
3. Mélanger 100 ul de chaque fraction aliquote de 2,9 ml de 50 mM de tampon phosphate (pH 6,0) contenant 0,167 mg / ml de o-dianisidinedihydrochloride et 0,0005% de peroxyde d'hydrogène dans une cuve.
4. Mesurer le taux d'absorbance en utilisant un spectrophotomètre à 460 nm. Remarque: activité MPO est définie comme la quantité d'enzyme dégradant une umol / min de H ₂ O ₂ en H ₂ O à température ambiante et est exprimée en unités par mg de tissu.

Résultats

Défi de rats (Sprague-Dawley) ou des souris (C57BL / 6) avec DNBS se traduit généralement par une perte de poids transitoire et de la diarrhée, parfois avec le sang présents dans les selles. Cependant, des facteurs tels que la génétique, l'alimentation et les microbiote intestinal peuvent modifier la sensibilité à la colite induite DNBS. Par conséquent, les animaux inclus dans les expériences doivent être de la même institution, soit dérivé localement ou commandé à partir d'un fournisseur de l&#...

Discussion

Le modèle DNBS décrite dans ce protocole est un modèle de colite précieux, peu coûteux et reproductible qui peut être utilisé pour étudier divers aspects de l'EIA. Lorsqu'il est administré par voie rectale à des rats ou des souris, DNBS induit un degré important de l'inflammation et une lésion tissulaire dans le côlon, ressemblant à la maladie de Crohn humaine dans ses diverses caractéristiques histologiques, y compris l'infiltration transmurale de polynucléaires et activation Th1 NF-kB-d...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 ml Syringe	BD Biosciences	309659
19 G Needle	BD Biosciences	305187
Polyethylene tubing PE-50	BD Biosciences	427517	for intrarectal administration in mice
Polyethylene tubing PE-90	BD Biosciences	427519	for intrarectal administration in rat
DNBS	MP Bio	150959
Tear gel	Novartis	63601662596
10% Formalin	Fisher	5F93-4
Warming pad	Kent Scientific	TPZ-0510
Ethanol	Fisher	A-962.4
Hexadecyltrimethyl-ammonium bromide	Sigma-Aldrich	H5882
Potassium phosphate buffer solution	Sigma-Aldrich	79628-
o-Dianisidine dihydrochloride	Sigma-Aldrich	D3252
30% H2O2	Sigma-Aldrich	31642	hydrogen peroxide
Spectrophotometer	BioRad	Benchmarker Plus
Light Microscope	Zeiss	Axio Image.Z1
Data analysis software program	GraphPad Software	GraphPad Prism Software Version 4.00	www.graphpad.com