DNBS / TNBS Colite Modelli: Fornire Insights Into malattia infiammatoria intestinale e gli effetti di grassi

Riepilogo

DNBS / TNBS colite indotta offre un metodo alternativo e poco costoso per studiare la pathobiology delle malattie infiammatorie intestinali. Il protocollo descritto in questo documento delinea l'applicazione di successo di DNBS per indurre colite in topi e ratti e permette di studiare a fondo le risposte intestinale ospite-mediata.

Abstract

Malattie infiammatorie croniche intestinali (IBD), tra cui il morbo di Crohn e la colite ulcerosa, sono stati a lungo associati con una base genetica, e, più recentemente, ospiterà la risposta immunitaria agli agenti microbici e ambientali. Colite dinitrobenzene solfonico (DNBS) indotta permette di studiare la patogenesi delle MICI fattori ambientali associati come lo stress e la dieta, gli effetti di potenziali terapie, e dei meccanismi alla base dell'infiammazione intestinale e della mucosa pregiudizio. In questo lavoro, abbiamo studiato gli effetti degli acidi n-3 e n-6 grassi alimentari sulla risposta infiammatoria della mucosa del colon di colite DNBS indotta nei ratti. Tutti i ratti sono stati alimentati con diete identiche ad eccezione dei diversi tipi di acidi grassi [olio di cartamo (SO), olio di canola (CO), o olio di pesce (FO)] per tre settimane prima dell'esposizione al intrarectal DNBS. I ratti di controllo indicati etanolo intrarettale continuato aumentare di peso nel corso dello studio cinque giorni, mentre, i ratti DNBS trattati con diete lipidi alimentati tutti lospeso t con FO e CO nutriti ratti dimostrano una significativa perdita di peso per 48 ore e ratti alimentati SO da 72 ore. L'aumento di peso ripreso dopo 72 ore postali DNBS, e da 5 DNBS giorni postali, il gruppo FO ha avuto un peso corporeo superiore a SO o gruppi CO. Sezioni del colon raccolto 5 giorni dopo DNBS-trattamento ha mostrato ulcerazione focale, distruzione cripta, deplezione delle cellule calice, e della mucosa infiltrazione di entrambe le cellule infiammatorie acute e croniche che differivano in gravità tra i gruppi di dieta. Il gruppo SO alimentato mostrato il danno più grave, seguito dal CO, e FO nutrito gruppi che hanno mostrato il più mite grado di danno tissutale. Allo stesso modo, la mieloperossidasi del colon (MPO) di attività, un marker di attività dei neutrofili era significativamente maggiore nel SO seguiti dai ratti nutriti CO, con FO ratti alimentati ad attività MPO notevolmente inferiore. Questi risultati dimostrano l'uso di colite DNBS indotta, come descritto in questo protocollo, per determinare l'impatto della dieta nella patogenesi delle IBD.

Introduzione

Le malattie infiammatorie intestinali (IBD) è caratterizzata da infiammazione cronica recidivante nel tratto gastro-intestinale (GI), con conseguente sintomi di diarrea, perdita di peso, e dolore addominale. Colite ulcerosa (CU) e malattia di Crohn (CD) sono i due principali forme di IBD, e si distinguono per la posizione della infiammazione nel tratto GI. In pazienti UC, l'infiammazione in genere comporta il retto e si estende in modo contiguo il colon per una misura variabile colpisce solo la mucosa superficiale. Al contrario, CD può colpire qualsiasi parte del tratto GI, anche se colpisce prevalentemente l'ileo e cieco. CD manifesta frequentemente come l'infiammazione transmurale spesso associato con granulomi e portando a stenosante (fibrostenotic) e / o penetranti (fistulizing) malattia. Sebbene l'eziologia di IBD resta inafferrabile, è ben accettato che IBD è multifattoriale, coinvolgendo le interazioni tra i padroni di casa del sistema immunitario, predisposizione genetica e responsabilitàses a fattori ambientali e microbici.

Ad oggi, diversi modelli di IBD sono stati proposti che visualizza varie risposte cliniche, istologiche e immunitario caratteristici di UC e CD. I modelli più comunemente usati includono topi geneticamente modificati (IL-2, IL-10, SAMP / Yit), infezione modelli indotti (Citrobacter rodentium, Salmonella typhimurium), modelli di trasferimento adottivi (CD45 + RB alti, trasferimento di cellule CD62L + in topi SCID) e modelli di colite indotta chimicamente (Dextran solfato di sodio (DSS), trinitrobenzene solfonico (TNBS), e Dinitrobenzene acido solfonico (DNBS)). A causa del loro basso costo e rapida insorgenza della malattia, modelli chimici sono considerati preziosi per lo studio di vari aspetti della IBD. Ciascuno dei modelli colite chimici elencati presenta vantaggi e le limitazioni in alcuni aspetti della loro rilevanza clinica, immunologica e istopatologico di IBD. DSS è uno dei metodi chimici più comuni impiegati per indurre colitis nei roditori ^1. La somministrazione di 3-10% DSS (MW: 42 kDa) per 7-10 giorni in acqua potabile di topi può indurre sintomi e segni di colite, tra cui la perdita di peso, diarrea con sangue, accorciamento del colon, ulcerazioni della mucosa e infiltrazione dei neutrofili. Questo modello è particolarmente utile per gli studi di screening di farmaci, così come esplorare i meccanismi di rigenerazione epiteliale, l'impatto di immunità innata sulla mucosa omeostasi, e il ruolo dell'infiammazione nella promozione displasia intestinale e sviluppo adenocarcinoma. Ci sono tuttavia alcuni inconvenienti al modello DSS, compresa una variazione nella concentrazione di DSS necessaria per indurre colite in diverse strutture animali, così come l'assorbimento di acqua incoerente da topi e l'esposizione così incoerente DSS, con conseguente variazione del grado, misura e distribuzione delle lesioni della mucosa e ulcerazione nel colon. Tutte queste caratteristiche portano a eterogeneità dei risultati e limitano la possibilità di confrontare i risultati di tutti gli studi frgruppi di ricerca differenti om.

Un'alternativa al modello DSS è il DNBS aptene-indotta o modelli TNBS di colite. Questo modello impiega instillazione rettale della mucosa agenti sensibilizzanti DNBS o TNBS, diluite in concentrazioni variabili di etanolo. La somministrazione di etanolo è un prerequisito per rompere la barriera della mucosa del colon per consentire la penetrazione di DNBS o TNBS nella lamina propria. DNBS / TNBS poi haptenize le proteine ​​del colon e intestino microbiche localizzate a diventare immunogeno, innescando in tal modo l'host innata e le risposte immunitarie adattative. In generale, questo modello è associata a diarrea grave e talvolta sanguinante, perdita di peso e ispessimento della parete intestinale tuttavia sintomi variano a seconda del tipo di roditore utilizzati, nonché i tempi, dosaggio e il grado di esposizione al DNBS o TNBS utilizzato nella studio. Importanti distinzioni tra ratti e topi dovrebbero essere notato, con i vantaggi di basso costo per l'acquisto e cartone, nonché lower massa corporea per ridurre i costi per animali di trattamento in vivo. Questo dovrebbe essere impostato contro il corso più rapido e grave di colite nei topi, dove gli animali più fragili e reattive possono raggiungere rapidamente un endpoint umano.

L'infiammazione intestinale risulta inizialmente da etanolo danno indotto alle cellule epiteliali intestinali, con conseguente aumento della permeabilità epiteliale, penetrazione microbica nella mucosa, haptenization di proteine ​​ospite, tutto questo con conseguente infiltrazione di neutrofili, macrofagi e linfociti T Th1 nella mucosa danneggiata. In confronto a DNBS, TNBS è considerato come sostanza chimica pericolosa per le sue proprietà altamente ossidanti che possono costituire un rischio di esplosione a contatto con basi come sodio e idrossido di potassio. Pertanto DNBS è attualmente considerato come una scelta preferita di chimica su TNBS per indurre colite. Nei roditori, DNBS colite è considerato come uno dei metodi più convenienti per studiare la succesala IBD modificatori della malattia associata:

1. Depressione e riattivazione della colite: E 'stato dimostrato che lo stress, ansia e depressione nei pazienti IBD sono spesso associati a recidiva della malattia. DNBS colite è un modello adatto per studiare il ruolo della depressione e le sue conseguenze sulla riattivazione della colite in topi. Il metodo comporta tipicamente dell'inserimento iniziale di colite da DNBS, seguita dalla risoluzione della colite lasciando i topi per 6-8 settimane. I topi sono poi somministrati con depressione causando agenti come reserpina o bulbectomy olfattiva indurre depressione seguita da loro test per la riattivazione della colite attraverso sfida con una dose subcolitic di DNBS ^2.
2. Lo stress e la riattivazione della colite: Lo stress è un altro fattore ambientale comune che è stato collegato a IBD patogenesi. Vi è un crescente corpo di evidenze che suggeriscono una forte associazione tra stress cronico e l'insorgenza di sintomi di UC e CD in roditoris così come negli esseri umani e primati non umani ^3. DNBS colite è un buon modello per studiare la riattivazione stress associato di colite sia in topi e ratti. Il metodo è di solito impiegato in un modo simile come sopra indicato per la depressione tranne in luogo della depressione, gli animali sono esposti ai fattori di stress come Sonic e contenimento dello stress ^4.
3. Infiammazione neurogenica: Un certo numero di studi hanno descritto né alterazioni transitorie o permanenti del sistema nervoso enterico (ENS) struttura e funzione, come si è visto in campioni di tessuto da modelli animali e da pazienti con IBD. DNBS è un buon modello per esplorare gli effetti di infiammazione sulla ENS ⁵ e per studiare sia noradrenergici e colinergici percorsi neurali ^6.
4. Meccanismi Injury-riparazione: Durante IBD patogenesi, ospite-derivati ​​mediatori di pregiudizio, come specie reattive dell'ossigeno (ROS), l'ossido nitrico (NO), molecola di adesione intercellulare 3 (ICAM-3), e P-selectina hanno tutti dimostrato di plaici un ruolo nel intestinale perturbazione epiteliali. DNBS è un ottimo modello per studiare le lesioni causate dal up-regolazione di questi mediatori, nonché meccanismi di riparazione che sono regolati da uso di droghe o inibitori selettivi ^7,8.
5. Infiammazione transmurale: Oltre alle suddette applicazioni di DNBS, il modello può essere applicato anche per studiare infiammazione transmurale dell'intestino, una caratteristica classica trovati in pazienti con MC. Entrambi DNBS e colite TNBS-indotti sono associate con una significativa infiltrazione di linfociti, nella mucosa del colon rendendo questi modelli particolarmente utile per studiare cellule T meccanismi immunitari dipendenti.

In confronto con il modello DSS, i vantaggi di DNBS e colite TNBS indotte includono basso costo, rapido sviluppo di colite (richiede solitamente 1-3 giorni per mostrare ulcerazione riproducibile e infiammazione) e danni localizzati coerente al colon distale. Tuttavia gli inconvenienti sono un requisito per unmaggior livello di competenza tecnica, l'ottimizzazione del dosaggio DNBS / TNBS, e la necessità di anestesia per la somministrazione rettale.

In questo documento metodologico abbiamo studiato gli effetti di concentrazioni variabili di n-6 e n-3 acidi grassi polinsaturi sulla modificare la risposta della mucosa del colon di colite DNBS indotta in ratti usando l'olio di cartamo oli vegetali (SO) e olio di canola (CO) , e olio di pesce (FO). E 'stato dimostrato che gli acidi n-6 e n-3 grassi sono importanti mediatori della malattia infiammatoria intestinale mediante la loro funzione porzioni acilico di phosopholipids membrana cellulare ^9. In contrasto con il potenziale proinfiammatorio di acidi grassi n-6, n-3 acidi grassi sufficientemente elevato di aspirazione sono potenzialmente agenti anti-infiammatori. Le azioni antinfiammatorie degli acidi grassi n-3 sono mediate direttamente attraverso la sostituzione di acido arachidonico come substrato eicosanoidi, inibendo il metabolismo dell'acido arachidonico e indirettamente attraverso l'alterazione di proinflespressione genica ammatory e segnalazione cellulare. Gli acidi grassi n-3 suscitano anche resolvins, una famiglia di mediatori antinfiammatori. Elevato apporto di acidi grassi n-3 è associata ad una diminuzione della produzione di eicosanoidi proinfiammatori, citochine, chemochine, specie reattive dell'ossigeno e l'espressione di molecole di adesione. In questo studio, i ratti sono stati alimentati ad libitum diete identiche in tutte le sostanze nutritive eccetto acidi grassi, con una energia cento da grasso, 20% SO, 20% CO, o 18% di olio di pesce più 2% olio di cartamo (FO) ^10-11 . In percentuale dell'energia giornaliera, la dieta SO disponibile acido linoleico 15% (LA), con <0,06% acido α-linolenico (ALA) e nessun acido eicosapentaenoico (EPA) o acido docosaesaenoico (DHA), la dieta CO aveva 4.2 % LA e 1,9% ALA senza EPA o DHA, e la dieta FO fornito 1,4% EPA, DHA 4,9%, 0,32% LA, e il 0,12% ALA. Tre settimane dopo l'inizio delle diete lipidi, i topi sono stati somministrati DNBS intrarettale o etanolo al 50% e si sono sacrificati 5 giorni dopo. Il inflammatory risposta è stata valutata mediante la valutazione della perdita di peso, i punteggi danno istologico e l'attività della mieloperossidasi tessuti.

Protocollo

Procedure che coinvolgono soggetti animali seguono le linee guida per la cura degli animali delineati dalla cura degli animali ed uso Comitato istituzionale (IACUC) presso l'Università della British Columbia.

Procedure menzionate nel presente protocollo saranno descritti sia per i ratti e topi, mentre i risultati rappresentativi saranno presentati da ratti Sprague-Dawley.

1. Preparazione di DNBS e intrarettale Amministrazione

1. Per instillazione rettale di DNBS nei ratti, appena preparare 15-30 mg di DNBS/250 ml di etanolo al 50%. Per i topi, preparare 2-6 mg di DNBS/100 ml di etanolo al 50%. Nota: Ottimizzare l'esatta concentrazione DNBS deve essere somministrato a ciascun impianto. Ratti maschi Sprague-Dawley, e C57BL / 6 topi sono preferiti per l'induzione della colite DNBS, tuttavia altri ceppi di topi e ratti possono essere utilizzati. Topi e ratti trattati solo con etanolo al 50% possono essere utilizzati come gruppi di controllo tuttavia dati gli effetti di etanolo sono lievi o assenti, si può omit l'inclusione di questo gruppo per uno studio ^12.
2. Collegare una siringa da 1 ml ad un ago G 19, che ha un catetere di polietilene (PE-90 - ratti o PE-50 - topi) fissata alla sua fine.
3. Leggermente anestetizzare il ratto o topo che poggia su una piastra elettrica (ad esempio con la somministrazione di 1,5% isoflurano via cono, gli animali dovrebbero ancora avere un batter e riflessi di deglutizione e visualizzare la respirazione regolare). Applicare il gel lacrima ai suoi occhi per evitare gli occhi secchi.
4. Comprimendo leggermente con i polpastrelli alla estremità posteriore dell'animale per rimuovere eventuali feci che possono essere presenti nel colon distale.
5. Inserire delicatamente il catetere rettale, con il catetere raggiunge circa 8 cm prossimalmente l'ano per i ratti, o di 3-4 cm per topi. Iniettare una piccola quantità della soluzione durante l'inserimento del catetere per lubrificare, consentendo facile inserimento. Nota: Se uno si avverte resistenza durante l'inserimento del catetere, non continuare da inserire come questo può portare alla perforazione della parete intestinale. Rimuovere il catetere e tentare di reinserire delicatamente, ancora una volta la lubrificazione del colon come procedere.
6. Iniettare lentamente 250 (ratti) o 100 (topi) microlitri di DNBS, o un volume uguale o etanolo al 50% per i controlli. Dopo aver iniettato il DNBS, posizionare l'animale a testa in giù per 90 secondi per evitare la perdita del DNBS.
7. Dopo somministrazione DNBS, nutrire gli animali acqua saccarosio 8% in soluzione fisiologica 0,2% per prevenire la disidratazione durante la prima settimana.
8. Osservare attentamente gli animali, con un monitoraggio quotidiano per la perdita di peso e segni di disidratazione o di disagio per tutta la durata dell'esperimento. Nota: La perdita di peso può avvicinarsi rapidamente le raccomandazioni CCAC di perdita di peso massimo. Da questo deriva prevalentemente da disidratazione, perdita di peso dovrebbe essere usata come indicatore per amministrare la soluzione di Ringer lattato per limitare la disidratazione. Si prega di essere sicuri di consultare il veterinario impianto sulle questioni sanitarie del caso.

2. Collecting tessuti e valutazione del danno istologico in DNBS Mice Challenged

1. Al punto di tempo desiderato dopo sfida con DNBS, eutanasia animali da sovradosaggio con isoflurano in una camera di anestetico integrato con sufficiente ossigeno. Osservare l'animale fino a quando non salita o di discesa del torace è visto e non c'è battito cardiaco palpabile. Confermare l'animale è stato eutanasia correttamente assenza di una risposta al pinch punta o toccare della cornea, seguita da dislocazione cervicale.
2. Aprire la cavità addominale e rimuovere l'intero intestino crasso. Aprire l'intestino longitudinalmente; ulcere mucose macroscopiche dovrebbero essere osservati circa 5-6 cm prossimale dall'estremità distale del colon nei ratti (2-3 cm nei topi). Nota: Dopo aver rimosso l'intestino crasso, valutare i punteggi danni macroscopici, se lo desideri. Raccogliere i segmenti del colon dalla corrispondente posizione anatomica da animali di controllo. Nota: Gli individui segnando il tessuto per i punteggi danni macroscopici dovrebberoessere accecato l'identità dei gruppi di trattamento. Punteggio sezioni di tessuto utilizzando i seguenti o simili criteri: gravità e l'estensione di ulcerazione (0-10), sommati con i punteggi per l'assenza o la presenza di diarrea (0 o 1), aderenze (0, 1 o 2) e lo spessore della parete del colon massimo in millimetri ^11.
3. Raccogliere 0,5 centimetri sezioni prossimali al sito del danno macroscopico massima. Snap congelare una sezione di 0,5 cm in azoto liquido per valutare successivamente mieloperossidasi (MPO) (una misura di infiltrazione di neutrofili), e posizionare l'altra sezione in 10% formalina tamponata neutra per l'analisi istologica. Nota: Snap tessuti congelati per l'analisi mieloperossidasi può essere conservato a -80 ° C per un massimo di 1 mese.
4. Lasciare i tessuti prelevati per l'analisi istologica nel passaggio da 2.3 a fissare in formalina durante la notte, e poi lavare con il 70% di etanolo. Incorpora tessuti in paraffina e tagliati a spessore desiderato (3-5 micron), macchia con hemotoxylin e eosina (HE) per il punteggio istologico.
5. Hanno due osservatori segnano almeno tre sezioni di tessuto da ogni animale sotto un microscopio ottico per determinare i punteggi danni istologici per ogni gruppo. Nota: Gli individui segnando il tessuto per i punteggi danni istologici devono essere accecati per l'identità dei gruppi di trattamento. Punteggio sezioni di tessuto utilizzando i seguenti criteri: o simili misura di infiltrato cellulare infiammatorio (0 = assente, 3 = transmurale), perdita di architettura della mucosa (0 = assente, 3 = grave), presenza o assenza di ascessi cripta (0-1) , e la deplezione delle cellule calice (0-3). Determinare il punteggio istologico danno come somma di questi punteggi ^11.

3. Esecuzione di mieloperossidasi (MPO) Saggio sulla DNBS Sfidato tessuto intestinale

1. Saggio di attività MPO nei 0,5 centimetri segmenti del colon ottenuti nella fase 2.3. Omogeneizzare tessuti in un tampone di omogeneizzazione MPO (0,5% hexadecyltrimethyl-ammonio bromuro in 50 mM tampone fosfato di potassio (pH 6,0)) a dare 50 mg colon segment / ml di sospensione tampone di omogeneizzazione.
2. Aliquotare la soluzione omogeneizzato in 1 ml porzioni e centrifugare a 4 ° C per 2 min a 10.000 x g.
3. Miscelare 100 ml di ciascuna soluzione con 2,9 ml di 50 mM tampone fosfato (pH 6.0) contenente 0,167 mg / ml di o-dianisidinedihydrochloride e 0,0005% di perossido di idrogeno in una cuvetta.
4. Misurare il tasso di assorbanza utilizzando uno spettrofotometro a 460 nm. Nota: attività MPO è definita come la quantità di enzima degradante 1 pmol / min di H ₂ O ₂ H ₂ O a temperatura ambiente ed è espressa in unità per mg di tessuto.

Risultati

Sfida di ratti (Sprague-Dawley) o topi (C57BL / 6) con DNBS si traduce in genere nella perdita di peso transitoria e diarrea, a volte con sangue presente nelle feci. Tuttavia, fattori quali la genetica, la dieta e le microbiota intestinale possono modificare la suscettibilità alla colite DNBS indotta. Pertanto, animali inclusi negli esperimenti dovrebbero essere dalla stessa istituzione, sia derivato localmente o ordinato in da un unico fornitore animale. Tutti gli animali devono essere attentamente monitorati per il g...

Discussione

Il modello DNBS descritto in questo protocollo è un modello valido, poco costoso, e riproducibile colite che può essere utilizzata per studiare vari aspetti della IBD. Quando somministrato per via rettale a ratti o topi, DNBS induce un sostanziale grado di infiammazione e danno tissutale nel colon, simile morbo di Crohn umano in termini di sue varie caratteristiche istologiche incluse infiltrazione transmurale di cellule polimorfonucleati e l'attivazione Th1 NF-kB-dipendente predominante.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 ml Syringe	BD Biosciences	309659
19 G Needle	BD Biosciences	305187
Polyethylene tubing PE-50	BD Biosciences	427517	for intrarectal administration in mice
Polyethylene tubing PE-90	BD Biosciences	427519	for intrarectal administration in rat
DNBS	MP Bio	150959
Tear gel	Novartis	63601662596
10% Formalin	Fisher	5F93-4
Warming pad	Kent Scientific	TPZ-0510
Ethanol	Fisher	A-962.4
Hexadecyltrimethyl-ammonium bromide	Sigma-Aldrich	H5882
Potassium phosphate buffer solution	Sigma-Aldrich	79628-
o-Dianisidine dihydrochloride	Sigma-Aldrich	D3252
30% H2O2	Sigma-Aldrich	31642	hydrogen peroxide
Spectrophotometer	BioRad	Benchmarker Plus
Light Microscope	Zeiss	Axio Image.Z1
Data analysis software program	GraphPad Software	GraphPad Prism Software Version 4.00	www.graphpad.com