Tres Culturas dimensionales: una herramienta para estudiar normal Acinar Arquitectura vs transformación maligna de las células de la mama

Resumen

Cultivo tridimensional de células epiteliales mamarias sobre una membrana basal reconstituida es un método útil para recapitular la arquitectura in vivo de la benigna de la mama, y para diferenciar el fenotipo maligno de la fenotipo benigna de la mama. Es importante destacar que este sistema se puede aplicar para estudiar los carcinomas invasivos en otros tejidos.

Resumen

Carcinomas de mama invasivo son un grupo de tumores epiteliales malignos caracterizados por la invasión de tejidos adyacentes y la propensión a la metástasis. La interacción de señales entre las células cancerosas y su microentorno ejerce una poderosa influencia sobre el crecimiento del cáncer de mama y el comportamiento biológico ^1. Sin embargo, la mayoría de estas señales de la matriz extracelular se pierden o su relevancia está poco estudiada cuando las células se cultivan en dos culturas dimensiones (2D) como una monocapa. En los últimos años, cultivo tridimensional (3D) sobre una membrana basal reconstituida ha surgido como un método de elección para recapitular la arquitectura del tejido de las células mamarias benignas y malignas. Las células cultivadas en 3D conservan las señales importantes de la matriz extracelular y proporcionan un sistema ex vivo ^2,3 fisiológicamente relevante. Es de destacar que existe una creciente evidencia que sugiere que las células se comportan de manera diferente cuando se cultiva en 3D en comparación con 2D ^4. Cultura 3Dpuede ser utilizado eficazmente como un medio para diferenciar el fenotipo maligno de la fenotipo benigna de la mama y para sustentar la señalización celular y molecular implicado ^3. Una de las características distintivas de las células epiteliales benignos es que están polarizados de manera que el citoplasma apical es hacia el lumen y el citoplasma basal descansa sobre la membrana basal. Esta polaridad apico basal se pierde en los carcinomas de mama invasivos, que se caracterizan por la desorganización celular y la formación de anastomosis y ramificación de túbulos que se infiltra al azar el estroma circundante. Estas diferencias histopatológicas entre las glándulas benignas y el carcinoma invasor se pueden reproducir en 3D ^6,7. Usando las lecturas de espera apropiadas como la cuantificación de las estructuras acinares individuales redondos, o la expresión diferencial de marcadores moleculares validados para la proliferación celular, la polaridad y la apoptosis en combinación con otras técnicas de biología molecular y celular, cultur 3De puede proporcionar una herramienta importante para entender mejor los cambios celulares durante la transformación maligna y para delinear la señalización responsable.

Introducción

Cultivo tridimensional (3D) de las células epiteliales de mama en la membrana basal reconstituida es un importante sistema modelo para estudiar el complejo fenotipo y la señalización asociada de mama normal y cáncer de mama ^2,3. La unidad funcional de mama es la unidad lobular del conducto terminal (TDLU) que consiste en un pequeño conducto que se ramifica en los acinos. Los acinos son estructuras altamente organizadas, compuestas de dos capas de células, células epiteliales y mioepiteliales, que están rodeados por una membrana basal ^5. Las características más distintivas de acinos normales son la polarización celular, unión a la membrana basal subyacente y contactos especializados célula-célula. Esta organización intrincada se interrumpe en los carcinomas invasivos. Las culturas 2D ampliamente utilizados, donde las células se cultivan como monocapas, no permiten la formación de acinos. Por lo tanto, el cultivo en monocapa se carece en proporcionar un sistema para capturar la relación compleja entre las células epitelialesen condiciones normales de mama y su desregulación en el cáncer de mama. Culturas epiteliales monotípicas funcionales de las células del seno se han desarrollado en varios laboratorios ^2,3. Cultura 3D implica el crecimiento de células de mama en Matrigel, que es un extracto solubilizado derivado de Engelbreth-Holm-Swarm células de sarcoma de ratón y está disponible comercialmente. Otros sustratos 3D como colágeno I también se utilizan. Las células de la mama pueden ser cultivadas en 3D mediante ensayo incorporado 3D, donde se cultivan las células incrustado en Matrigel ^2. Alternativamente, las células pueden ser cultivadas por 3D en ensayo superior, también llamado ensayo de superposición 3D, que es rentable, ya que requiere menor volumen de Matrigel, y facilita el seguimiento de lapso de tiempo de la formación de colonias por imágenes de contraste de fase y es ideal para la proyección de imagen en situ ^{2 -3.} El ensayo de 3D ​​en la parte superior se ha utilizado para definir la correlación entre el fenotipo acinar y perfil de expresión génica ^7.

Cultura 3D se puede effectively utiliza para distinguir las células normales y malignas de carcinoma invasor. Las células normales y malignas de mama forman crecimiento arrestado estructuras polarizadas con una luz bien definidos en el centro de Matrigel mientras que las células de carcinoma invasivo crecen prolíficamente y sin orden ni concierto, sin compensación de la luz. E6/E7 inmortalizado células epiteliales mamarias humanas y de la línea de células MCF10A, que es una línea celular inmortalizada espontáneamente aislada de un paciente de 36 años con los cambios fibroquísticos, se han utilizado con éxito para recuperar el fenotipo benigno de mama en 3D ^3,8 y han servido como un sistema modelo para estudiar la función de supresor de oncogénica y tumoral de varias moléculas de ^8,9. Estas células benignas pueden ser diseñados para manipular gen (s) de interés por la introducción de los lentivirus / retrovirus. Si el gen (s) de interés es un gen supresor tumoral, desmontables shRNA mediada conducirá a una transformación maligna mientras que si el gen de interés es una sobreexpresión de oncogenes en células benignasdebe mostrar un fenotipo maligno. En ambos casos las estructuras acinares formados en 3D pueden capturar la transformación maligna.

Células individuales benignos chapados en 3D comienzan a proliferar y formar ronda estructuras esféricas. Por días 5-8 este agregado esférico de células se diferencien en una capa que rodea polarizada de células que está en contacto con el Matrigel, y una masa interior de células menos polarizadas, que carecen de contacto con el Matrigel. En los próximos 10 a 15 días las células internas empezarán a morir por apoptosis formando un lumen clara. Las células malignas crecen desordenadamente perder su polaridad. Células altamente malignos generalmente se forman estructuras de ramificación. Estas diferencias en el fenotipo puede ser capturado por imágenes de contraste de fase de lapso de tiempo y por in situ inmunotinción con marcadores moleculares relevantes. Los marcadores más comúnmente utilizados son alfa 6 integrina, un marcador de polaridad basales, en combinación con el marcador de proliferación fosfo-histona 3 y el apoptotic marcador escinde la caspasa-3. Esto último es importante para determinar si existe la formación del lumen en el centro de los acinos, una característica de las células normales y benignos de mama. Otros marcadores de polaridad y de contacto célula-célula incluyen GM130, laminina, ERM, E-cadherina. Alternativamente las líneas celulares de cáncer de mama pueden ser diseñados para manipular el gen de interés. En este caso, la reversión a un fenotipo más se detiene el crecimiento benigno se puede utilizar como una lectura de distinguir de la fenotipo del cáncer.

Cultura 3D también puede usarse con cuidado para delinear las vías de señalización implicadas en la transformación maligna ^10-11. Usando la anteriormente mencionada-outs leído, inhibidores farmacológicos, anticuerpos de bloqueo o proteínas recombinantes puede ser utilizado ser identificar en la señalización que conducen a la transformación maligna. Con la continuación de los esfuerzos de diversos laboratorios es posible extraer las células de 3D para aislar ARN y también preparar lisados ​​para inmunotransferencia y inmunidadnoprecipitation. Estas estrategias se describen en un paso a paso y de manera detallada en el protocolo.

Protocolo

1. Preparación de los materiales y medios de cultivo

1. Factor de crecimiento Descongele reducida (TFG) Matrigel a 4 ° CO / N.
2. Calentar medio completo para la línea celular requerida a 37 ° C. MCF10A-ATCC especifica los medios de comunicación; Medio F-12 de HME-Ham suplementado con suero bovino fetal al 5%, ml de hidrocortisona, 5 mg / ml de insulina, 10 ng de factor de 1 mg / / ml de crecimiento epidérmico, y 100 ng de toxina / ml de cólera; F-12 de los medios de comunicación SUM149-Ham suplementado con FBS al 5%, 2 mg / ml de hidrocortisona y 5 mg / ml de insulina; y MDA-MB-231-FBS al 10%-DMEM
3. PreCool un porta con cámara de 8 pocillos en hielo.
4. Prepare el tejido capucha y suministros cultura.

2. Cultivo tridimensional en 8-así Slide Cámara

1. Escudo cada pocillo del portaobjetos de 8 pocillos con 40 l de Matrigel TFG. Añadir el Matrigel en el centro de la diapositiva y luego se extendió el uso de una punta de pipeta P200. Trata de difundir lo más uniformemente posible, evitando las burbujas y la muchedumbre que puede llevar aformación de menisco.
2. Incubar los portaobjetos a 37 ° C en 5% de CO _2. Mientras que el Matrigel está solidificando, trypsinize las células, recoger y girar a 150 xg en cultivo de tejido se centrifuga durante 4 min.
3. Contar las células y diluir a 12.500 células / ml en medio completo de la línea celular respectivo. Añadir TFG Matrigel a 2% y añadir 400 l a cada pocillo de un portaobjetos de cámara de Matrigel con capa preliminar.
4. Incubar los portaobjetos en la incubadora de CO _2. Dar los cambios de medios completos frescas cada 4 ^º día hasta 15 días.
5. El tratamiento con inhibidores farmacológicos: Para estudios de inhibidores añaden inhibidores de moléculas pequeñas a los medios de comunicación completa en el momento de la siembra, seguido de cambios de medio fresco suplementado con los inhibidores de cada tres días, mientras que el crecimiento de las células en Matrigel TFG.
6. El tratamiento con proteína purificada:
   1. Pasos Placa las células después de 02.01 a 02.03. Permita que los cultivos crezcan durante 4 días seguidos de starvati suerodurante 16 horas.
   2. En el día 5, el tratamiento de las células con una concentración apropiada de proteína purificada en el 0,1% de SFB suplementado medios de comunicación para las células de hambre suero. Dale cambio de medio fresco con proteína purificada después de 2 días.
   3. En el día 10 reemplazar el medio condicionado con medio completo HME. Permita que los cultivos crezcan por otros 5 días.
7. La tinción de inmunofluorescencia de las estructuras acinares cultivadas en Matrigel:
   1. Preparar 2% de paraformaldehído, 0.5% de Triton X-100 y glicina 100 mM en 1x PBS, pH 7,4. Preparar tampón de inmunofluorescencia (IF tampón) que comprende de 1x PBS que contenía 0,1% de albúmina de suero bovino, 0,2% de Triton X-100, 0,05% de Tween-20.
   2. Utilice una punta de pipeta P200 para aspirar cuidadosamente el medio condicionado.
   3. Fijar las estructuras acinares con 2% de paraformaldehído recién preparado a temperatura ambiente (TA) durante 20 min.
   4. Permeabilizar las células con 0,5% de Triton X-100 durante 10 min a 4 ° C.
   5. Lave la culturas de tres veces con glicina 100 mM, 10-15 minutos para cada lavado.
   6. Bloquee las células con 10% de suero de cabra en tampón IF, llamado bloque de primaria, durante 1 hora a temperatura ambiente.
   7. Incubar los cultivos con un 20 ug / ml de anticuerpo de cabra anti F (ab ') ₂ fragmento en tampón de bloqueo primario durante 30 min ratón. Este paso es importante para bloquear la especie de IgG de ratón inmunorreactivas en el Matrigel.
   8. Incubar con el anticuerpo primario en la segunda solución de bloqueo (bloque principal 20 mg / ml de cabra anti-ratón F (ab ') 2) O / N a 4 ° C.
   9. Lavar tres veces con tampón IF durante 10-15 minutos cada uno con suave balanceo.
   10. Se incuba con anticuerpos secundarios conjugados fluorescentes en el tampón IF de 45 min.
   11. Lave 3 veces durante 10 minutos cada uno con tampón IF con suave balanceo.
   12. Monte los portaobjetos con el reactivo anti-fade contiene DAPI para visualizar los núcleos.
   13. Deje que los portaobjetos se sequen O / N a temperatura ambiente.
   14. La adquisición de imágenes: detección confocal de imágenes en las millas de coloniasdsection de las células cultivadas en la parte superior de Matrigel. Para obtener más información adquirir una serie de secciones ópticas a lo largo de toda la longitud de la estructura acinar por Z apilamiento.

3. Cultivo tridimensional en 2 pocillos Cámara Diapositivas por inmunotransferencia

1. PreCool una diapositiva cámara de 2 pozos en el hielo. Siga los pasos 2.1 a 2.4 la ampliación de los reactivos para la 2-well cámara de diapositivas por ejemplo, cubrir con 160 l de Matrigel y agregar 1,6 ml de células / Matrigel mezcla a cada pocillo de la diapositiva 2 pocillos.
2. Recoger las estructuras acinares de la Matrigel utilizando el kit de recolección de células de cultivo 3D disponible comercialmente siguiendo las instrucciones del fabricante.
3. Diluir los tampones de lavado celular y recolección de células a 1x y preenfriar a 4 ° C. Lavado y desprendimiento de Matrigel deben llevarse a cabo en hielo.
4. Lávese las estructuras acinares 3x utilizando el tampón de lavado celular.
5. Recoger los acinos en 15 ml tubos de centrífuga utilizando bu recolección de célulasffer seguido de 30 minutos de incubación en un agitador a 4 ° C. Mezclar bien la suspensión con una pipeta de 1 ml. Esto romperá el Matrigel en trozos pequeños y liberar la mayor parte de las células en el tampón de la recolección de células.
6. Sedimentar las células a 200 xg en una centrífuga de cultura. Retire la capa flotante de hidrogel de las células sedimentadas con una punta de pipeta P200.
7. Resuspender los lisados ​​en tampón de muestra de SDS se suministran con el kit. Tampón de lisis RIPA también se puede utilizar.

4. Cuantificación de vs maligno de mama benigna Fenotipo

1. Se cultivan las células por triplicado para cada conjunto de tratamiento siguiendo los pasos 2.1 a 2.4.
2. Tomar imágenes de contraste de fase de las estructuras acinares de cada pocillo a 5X o resolución 10 veces utilizando un microscopio de contraste de fase unida a una palanca de cambios de diapositivas y un ordenador. Tome las imágenes moviendo el portaobjetos de un cuadro a otro y por lo tanto cubre todo el pozo de la diapositiva cámaras.
3. Cuente el número total de las estructuras acinares,el número de acinos sola plana redonda y el número de estructuras multiacinar o estructuras que crecen sin orden ni concierto que carecen de organización y con los procesos de ramificación que emanan de ella.
4. Calcular el porcentaje de estructuras acinares plana redondos individuales frente a las estructuras malignas y la trama como gráfico de columnas. Calcular la importancia de la prueba t de Student.

Resultados

Cultura 3D se puede utilizar con eficacia para diferenciar fenotipo maligno de las células epiteliales de mama humanos de la benigna de la mama. Células benignas individuales chapada en Matrigel crecen como estructuras esféricas organizadas que pueden ser fácilmente incluidas en la imagen como única acinos redonda plana en un plano utilizando imágenes de contraste de fase. Las células malignas individuales chapada en Matrigel crecen sin orden ni concierto, muestran muy alto índice de refracción y son difíciles...

Discusión

Hemos descrito aquí el cultivo de tres dimensiones de las células epiteliales de mama sobre una membrana basal reconstituida y la utilidad de este sistema para diferenciar entre vs maligno fenotipo benigna de la mama. Este sistema también puede ser usado para cultivar diferentes tipos de células de otros tejidos glandulares y se ha informado que se han utilizado con éxito para la cultura epitelial de próstata, del epitelio bronquial, y las células epiteliales de tiroides, para nombrar unos pocos ^12-14....

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Growth Factor Reduced Matrigel	BD Biosciences	354230	Avoid repeat freeze thaw
Lab-Tek glass hamber slides 8-well	Thermo Fisher Scientific	177402	Precool on ice
Lab-Tek glass chamber slides 2-well	Thermo Fisher Scientific	177380	Precool on ice
Goat anti mouse F(ab´)2 fragment	Jackson Immunoresearch	115-006-006
Normal goat serum	Jackson Immunoresearch	005-000-121
Fluorescent conjugated Alexa antibodies	Molecular Probes		Please look at molecular probes website
Prolong gold antifade reagent with DAPI	Molecular Probes	P36935
3D Culture Cell Harvesting kit	Trevigen	3448-020-k
Anti-Apha-6-integrin	Fisher Scientific	MAB1378	1:100 dilution for IF
Anti-GM130	BD Biosciences	610822	1:100 dilution for IF
Anti-phospho-histone 3 (Ser10)FITC Conjugated	Fisher Scientific	16-222	1:100 dilution for IF
Anti-Cleaved caspase 3 (Asp 175)	Cell Signaling	9661s	1:50 dilution for IF
Anti-E-cadherin	BD Biosciences	610181	1:200 dilution for IF