Tre Culture dimensionali: strumento per studiare normale acinose Architettura vs trasformazione maligna delle cellule mammarie

Riepilogo

Tre coltura tridimensionale di cellule epiteliali mammarie su una membrana basale ricostituita è un metodo utile ricordare l'architettura in vivo del seno benigno, e per differenziare il fenotipo maligno dal fenotipo seno benigno. È importante sottolineare che questo sistema può essere applicato a studiare carcinomi invasivi in ​​altri tessuti.

Abstract

Carcinomi mammari invasivi sono un gruppo di tumori epiteliali maligni caratterizzato dall'invasione dei tessuti adiacenti e la propensione a metastatizzare. L'interazione dei segnali tra le cellule tumorali e il loro microambiente esercita una forte influenza sulla crescita del cancro al seno e comportamento biologico ^1. Tuttavia, la maggior parte di questi segnali dalla matrice extracellulare sono persi o loro rilevanza è understudied quando le cellule vengono coltivate in coltura due dimensioni (2D) come un monostrato. Negli ultimi anni, tridimensionale coltura su una membrana basale ricostituita (3D) è emerso come un metodo di scelta per ricapitolare dell'architettura tissutale di cellule mammarie benigne e maligne. Le cellule coltivate in 3D conservano gli spunti importanti della matrice extracellulare e forniscono un fisiologicamente rilevanti ex vivo di sistema ^2,3. Di nota, vi è una crescente evidenza che suggerisce che le cellule si comportano diversamente quando coltivate in 3D rispetto al 2D ^4. Cultura 3Dpuò essere usato efficacemente come mezzo per differenziare il fenotipo maligno dal fenotipo seno benigna e per consolidare la segnalazione cellulare e molecolare coinvolto ^3. Una delle caratteristiche distintive di cellule epiteliali benigne è che essi sono polarizzati in modo che il citoplasma apicale è verso il lume e il citoplasma basale poggia sulla membrana basale. Questa polarità apico-basale si perde in carcinomi mammari invasivi, che sono caratterizzate da disorganizzazione e la formazione di anastomosi e la ramificazione tubuli che si infiltra a casaccio lo stroma circostante cellulare. Queste differenze istopatologici tra ghiandola benigna e il carcinoma invasivo possono essere riprodotti in 3D ^6,7. Utilizzando le opportune read-out come il quantificazione di singole strutture acinose rotonde, o differenziale espressione di marcatori molecolari validati per la proliferazione cellulare, la polarità e l'apoptosi in combinazione con altre tecniche di biologia molecolare e cellulare, cultur 3De in grado di fornire uno strumento importante per comprendere meglio i cambiamenti cellulari durante la trasformazione maligna e per delineare la segnalazione responsabile.

Introduzione

Tre coltura tridimensionale (3D) di cellule epiteliali mammarie sulla membrana basale ricostituita è un importante sistema modello per studiare il complesso fenotipo e segnalazione associato di seno normale e cancro al seno ^2,3. L'unità funzionale del seno è il terminale condotto unità lobulare (TDLU) che consiste in un piccolo dotto che si dirama in acini. Gli acini sono strutture altamente organizzate, composto da due strati di cellule, cellule epiteliali e mioepiteliali, che sono circondate da una membrana basale ^5. Le caratteristiche più distintive di acini normali sono polarizzazione cellulare, attacco alla membrana basale sottostante e comunicazione varie cellule specializzate. Questa organizzazione intricato è interrotto nei carcinomi invasivi. Le culture 2D ampiamente utilizzato, dove le cellule sono coltivate in monostrato, non consentono la formazione di acini. Così, la coltura monostrato manca nel fornire un sistema per catturare l'intricata relazione tra le cellule epitelialiin seno normale e la loro deregolamentazione nel cancro al seno. Culture epiteliali monotipica funzionali delle cellule mammarie sono state sviluppate in diversi laboratori ^2,3. Cultura 3D coinvolge la crescita delle cellule del seno su Matrigel, che è un estratto solubilizzato derivato da cellule di topo sarcoma Engelbreth-Holm-Swarm ed è disponibile in commercio. Altri substrati 3D come il collagene che vengono utilizzati anche. Le cellule del seno possono essere coltivate in 3D da 3D saggio incorporato, in cui le cellule sono coltivate incorporato in Matrigel ^2. In alternativa, le cellule possono essere coltivate da 3D sul dosaggio superiore, chiamato anche saggio overlay 3D, che è conveniente in quanto richiede minor volume di Matrigel, e facilita il controllo di lasso di tempo di formazione della colonia mediante imaging a contrasto di fase ed è ideale per l'imaging in situ ^{2 -3.} Il 3D sulla cima saggio è stato usato per definire la correlazione tra il fenotipo acinose e profilo di espressione genica ^7.

Cultura 3D può essere effectively utilizzato per distinguere le cellule normali e benigne da carcinoma invasivo. Cellule del seno normale e benigni formano la crescita arrestato strutture polarizzate con un lume ben definite nel centro di Matrigel mentre le cellule di carcinoma invasivo crescono prolifico e casaccio, senza compensazione del lume. E6/E7 immortalato cellule epiteliali mammarie umane e linea cellulare MCF10A, che è una linea cellulare spontaneamente immortalato isolato da un paziente di 36 anni con i cambiamenti fibrocistica, sono stati utilizzati con successo per riconquistare il fenotipo benigna del seno in 3D ^3,8 e hanno servito come un sistema modello per studiare la funzione di soppressore tumorale oncogenica e di diverse molecole ^8,9. Queste cellule benigne può essere progettato per manipolare gene (s) di interesse con l'introduzione di lentivirus / retrovirus. Se il gene (s) di interesse è un soppressore del tumore, l'abbattimento shRNA mediata porterà ad una trasformazione maligna mentre se il gene di interesse è una sovraespressione oncogene in cellule benignedovrebbe mostrare un fenotipo maligno. In entrambi i casi le strutture acinose formate in 3D possono catturare la trasformazione maligna.

Benigni singole cellule placcato in 3D iniziano a proliferare e formare rotondo strutture sferiche. Di giorno 5-8 questo aggregato sferico delle cellule sarà differenziarsi in uno strato circostante polarizzata di celle che è in contatto con la Matrigel, e una massa interna di cellule meno polarizzate, che mancano contatto con la Matrigel. Nei prossimi 10-15 giorni le cellule interne inizieranno a morire per apoptosi formando un chiaro lume. Le cellule maligne cresceranno a casaccio perdere la loro polarità. Cellule altamente maligne di solito formano ramificazione delle strutture. Queste differenze nel fenotipo possono essere catturati da tempo di imaging a contrasto di fase, periodo e in situ immunoistochimica con marcatori molecolari rilevanti. I marcatori più comunemente utilizzati sono alfa 6-integrina, un marcatore polarità basale, in combinazione con il marcatore di proliferazione fosfo-istone 3 e il apoptotic marcatore spaccati caspasi-3. Quest'ultimo è importante determinare se vi è formazione di lumen nel centro degli acini, una caratteristica delle cellule normali del seno e benigne. Altri marcatori di polarità e di contatto cellula-cellula comprendono GM130, laminina, ERM, E-caderina. Alternativamente le linee di cellule di cancro al seno può essere progettato per manipolare il gene di interesse. In questo caso reversione ad una maggiore crescita arrestata fenotipo benigno può essere utilizzato come lettura per distinguere dal fenotipo cancro.

Cultura 3D può essere utilizzato anche con attenzione a delineare le vie di segnalazione coinvolte nella trasformazione maligna ^10-11. Utilizzando il sopra citato le letture, inibitori farmacologici, anticorpi bloccanti o proteine ​​ricombinanti può essere utilizzato da individuare nella segnalazione molecolare che porta alla trasformazione maligna. Con un impegno costante da vari laboratori è possibile estrarre le cellule dal 3D per isolare l'RNA e anche preparare lisati per immunoblotting e immunitànoprecipitation. Queste strategie sono descritte in un graduale e modo dettagliato nel protocollo.

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Protocollo

1. Preparazione dei Materiali e cultura dei media

1. Fattore di crescita Thaw ridotta (GFR) Matrigel a 4 ° CO / N.
2. Warm up supporti completi per la linea cellulare richiesto a 37 ° C. MCF10A-ATCC specificato media; F-12 medio di HME-Ham supplementato con 5% di siero fetale bovino, 1 mg / ml di idrocortisone, 5 pg / ml di insulina, 10 ng / ml di fattore di crescita epidermico, e 100 ng / ml di tossina del colera; F-12 supporti di SUM149-Ham, completata con il 5% FBS, 2 mg / ml di idrocortisone e 5 mg / ml di insulina; e MDA-MB-231-10% FBS-DMEM
3. Preraffreddare uno scivolo camera 8 pozzetti su ghiaccio.
4. Preparare cappa coltura tissutale e forniture.

2. Tre Culture dimensionale in 8 pozzetti diapositive Camera

1. Coat ciascun pozzetto della slitta 8 pozzetti con 40 ml di GFR Matrigel. Aggiungere il Matrigel nel centro della diapositiva e poi diffusa utilizzando una punta di pipetta P200. Cercare di diffondere il più uniformemente possibile, evitando le bolle e invadendo che può portare aformazione di menisco.
2. Incubare i vetrini a 37 ° C in 5% CO _2. Mentre il Matrigel viene consolidando, trypsinize le cellule, raccogliere e girare a 150 xg nel tessuto della cultura centrifugare per 4 min.
3. Contare le cellule e diluire a 12.500 cellule / ml in mezzo completo della rispettiva linea cellulare. Aggiungere GFR Matrigel al 2% e aggiungere 400 microlitri di ciascun pozzetto di una diapositiva camera Matrigel prerivestita.
4. Incubare i vetrini in CO ₂ incubatore. Dare freschi cambiamenti multimediali completi ogni 4 ^° giorno fino a 15 giorni.
5. Il trattamento con inibitori farmacologici: Per gli studi inibitori aggiungono piccole molecole inibitrici ai media completo al momento della placcatura seguita da cambiamenti dei media freschi integrati con gli inibitori ogni tre giorni durante la crescita delle cellule di GFR Matrigel.
6. Il trattamento con proteina purificata:
   1. Piastra le cellule seguenti passaggi 2,1-2,3. Lasciare le culture di crescere per 4 giorni, seguiti da starvati sieroavanti per 16 ore.
   2. Al giorno 5, trattare le cellule con una concentrazione adeguata di proteine ​​purificate in 0.1% FBS completato media per le cellule affamate di siero. Dare cambiamento fresca media con proteina purificata dopo 2 giorni.
   3. Al giorno 10, sostituire il supporto condizionata e supporti completi HME. Lasciare le colture a crescere per altri 5 giorni.
7. Immunofluorescenza delle strutture acinose coltivate su Matrigel:
   1. Preparare 2% paraformaldeide, 0,5% Triton X-100 e glicina 100 mM in 1x PBS, pH 7,4. Preparare tampone immunofluorescenza (IF buffer) che comprende 1x PBS contenente 0,1% di albumina di siero bovino, 0,2% Triton X-100, 0,05% Tween-20.
   2. Utilizzare un puntale P200 per aspirare accuratamente il supporto condizionato.
   3. Fissare le strutture acinose con 2% paraformaldeide preparata a temperatura ambiente (RT) per 20 min.
   4. Permeabilize le cellule con 0,5% Triton X-100 per 10 minuti a 4 ° C.
   5. Lavare la culturas tre volte con glicina 100 mM, 10-15 min per ogni lavaggio.
   6. Bloccare le cellule con 10% di siero di capra in tampone IF, chiamato blocco primario, per 1 ora a RT.
   7. Incubare le colture con 20 ug / ml di capra anti F (ab ') ₂ frammento nel buffer di blocco primario per 30 min mouse. Questo passaggio è importante per bloccare il mouse specie IgG immunoreattivi in ​​Matrigel.
   8. Incubare con anticorpo primario nella seconda soluzione di blocco (blocco Primario +20 mcg / ml di capra anti-topo F (ab ') 2 frammento) O / N a 4 ° C.
   9. Lavare tre volte con tampone IF per 10-15 minuti ciascuno con dolce dondolio.
   10. Incubare con fluorescenti anticorpi secondari coniugati nel tampone IF per 45 min.
   11. Lavare 3x per 10 minuti ciascuno con tampone IF con dolce dondolio.
   12. Montare i vetrini con il reagente anti-sbiadimento contenente DAPI per visualizzare i nuclei.
   13. Lasciare i vetrini si asciughino O / N a RT.
   14. Acquisizione Image: Acquisire le immagini confocale ai mi coloniadsection di cellule cresciute in cima Matrigel. Per ulteriori informazioni acquisire una serie di sezioni ottiche per tutta la lunghezza della struttura acinose da Z impilamento.

3. Three Dimensional Cultura in 2-bene Slides Camera per Immunoblotting

1. Preraffreddare 2 ben vetrino camera su ghiaccio. Seguire i passaggi 2,1-2,4 scaling up i reagenti per la camera 2 e scivolo ad esempio il cappotto con 160 ml di Matrigel e aggiungere 1,6 ml di cellula / Matrigel mescolare in ciascun pozzetto della diapositiva 2-bene.
2. Raccogliere le strutture acinose dal Matrigel utilizzando il kit di raccolta di cellule coltura 3D disponibili in commercio seguendo le istruzioni del produttore.
3. Diluire il lavaggio delle cellule e di raccolta delle cellule buffer a 1x e preraffreddare a 4 ° C. Lavaggio e stacchi di Matrigel devono essere eseguite su ghiaccio.
4. Lavare le strutture acinose 3x utilizzando il tampone di lavaggio delle cellule.
5. Raccogliere la acini in 15 ml provette per centrifuga con bu raccolta di celluleffer seguita da 30 minuti di incubazione su un agitatore a 4 ° C. Mescolare bene la sospensione con una pipetta 1 ml. Questo romperà il Matrigel in piccoli pezzi e rilasciare la maggior parte delle cellule nel buffer raccolta di cellule.
6. Agglomerare le cellule a 200 xg in una centrifuga cultura. Rimuovere lo strato galleggiante idrogel dalle cellule pellet con una pipetta P200.
7. Risospendere lisati in tampone campione SDS forniti con il kit. Tampone di lisi RIPA può anche essere usato.

4. Quantificazione dei vs maligna benigna fenotipo seno

1. Crescere cellule in triplicato per ogni set di trattamento seguendo i passaggi 2,1-2,4.
2. Prendere immagini a contrasto di fase di strutture acinose da ciascun pozzetto a 5X o 10X risoluzione usando un microscopio a contrasto di fase collegato a un cambio diapositiva e un computer. Prendete le immagini spostando il vetrino da un fotogramma all'altro e quindi copre l'intero bene della diapositiva incamerata.
3. Contare il numero totale di strutture acinose,il numero di acini singolo piatto rotondo e il numero di strutture multiacinar casaccio o crescenti strutture prive organizzazione e con processi di ramificazione provenienti da esso.
4. Calcolare la percentuale di strutture acinose piatto rotondo singoli vs strutture maligni e la trama come grafico a colonne. Calcolare la significatività con il test t di Student.

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Risultati

Cultura 3D può essere efficacemente utilizzata per differenziare fenotipo maligno delle cellule epiteliali mammarie umane dal seno benigno. Singole cellule benigne placcato in Matrigel crescere come strutture sferiche organizzate che possono essere facilmente imaged singola acini piatto rotondo in un piano utilizzando l'imaging a contrasto di fase. Le singole cellule maligne piastrate su Matrigel crescono a casaccio, mostrano molto alto indice di rifrazione e sono difficili da immagine in un piano. Come mostrato in...

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Discussione

Abbiamo descritto qui la coltura tridimensionale di cellule epiteliali mammarie su una membrana basale ricostituita e l'utilità di questo sistema di distinguere tra vs maligno benigno fenotipo seno. Questo sistema può essere utilizzato anche per coltura diversi tipi di cellule di altri tessuti ghiandolari ed è stato riportato che sono stati utilizzati con successo per cultura prostata epiteliale, epiteliale bronchiale, e cellule epiteliali tiroidee, per citarne alcuni ^12-14. L'importanza della cult...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Growth Factor Reduced Matrigel	BD Biosciences	354230	Avoid repeat freeze thaw
Lab-Tek glass hamber slides 8-well	Thermo Fisher Scientific	177402	Precool on ice
Lab-Tek glass chamber slides 2-well	Thermo Fisher Scientific	177380	Precool on ice
Goat anti mouse F(ab´)2 fragment	Jackson Immunoresearch	115-006-006
Normal goat serum	Jackson Immunoresearch	005-000-121
Fluorescent conjugated Alexa antibodies	Molecular Probes		Please look at molecular probes website
Prolong gold antifade reagent with DAPI	Molecular Probes	P36935
3D Culture Cell Harvesting kit	Trevigen	3448-020-k
Anti-Apha-6-integrin	Fisher Scientific	MAB1378	1:100 dilution for IF
Anti-GM130	BD Biosciences	610822	1:100 dilution for IF
Anti-phospho-histone 3 (Ser10)FITC Conjugated	Fisher Scientific	16-222	1:100 dilution for IF
Anti-Cleaved caspase 3 (Asp 175)	Cell Signaling	9661s	1:50 dilution for IF
Anti-E-cadherin	BD Biosciences	610181	1:200 dilution for IF