三次元文化：乳細胞の悪性形質転換正常対腺房アーキテクチャを研究するためのツール

要約

再構成基底膜上の乳房上皮細胞の三次元培養は、良性乳房のインビボアーキテクチャを再現するために、良性乳房表現型から悪性の表現型を区別するために有用な方法である。重要なことに、このシステムは、他の組織に浸潤癌を研究するために適用することができる。

要約

浸潤性乳癌の転移に隣接する組織や性向の侵入を特徴とする悪性上皮性腫瘍の一群である。癌細胞とそれらの微小環境との間の信号の相互作用は、乳癌の成長および生物学的挙動¹に強力な影響を与える。しかし、細胞外マトリックスからのこれらの信号の大部分が失われたり、細胞を単層として2次元培養（2D）で栽培されている場合、その関連性が代役されています。近年では、再構成基底膜上の3次元（3D）培養物は、良性および悪性の乳房細胞の組織構造を再現するための選択の方法として浮上している。 3Dで増殖した細胞は、細胞外マトリックスからの重要な手がかりを保持し、生理学的に関連するex vivoでのシステム^2,3を提供する。注目すべきは、2次元⁴と比較して、3Dで増殖させたときの細胞は異なる挙動を示すことを示唆している証拠が増えている。三次元培養効果的に^3関与良性乳房表現型から悪性表現型を区別するための手段として、および細胞および分子のシグナル伝達を支えるために使用することができる。良性の上皮細胞の顕著な特徴の1つは、頂端細胞質内腔に向かってであり、基底細胞質は基底膜上に載るように、それらが偏光されることである。このapico - 基底極性がでたらめに周囲の間質に浸透細管を吻合及び分岐の細胞崩壊と形成を特徴としている浸潤性乳癌で失われます。良性腺と浸潤癌との間に、これらの病理組織学的な違いは、3D ^6,7で再生することができる。単一ラウンド腺房構造の定量のような適切なリードアウトを用いて、又は他の分子および細胞生物学技術と組み合わせて、細胞増殖、およびアポトーシスの極性が検証分子マーカーの発現を差動に、3D culturEは、より良い悪性形質転換の際に、責任あるシグナリングの輪郭を描くための細胞の変化を理解するための重要なツールを提供することができます。

概要

再構成基底膜上の乳房上皮細胞の三次元培養（3D）は、複雑な表現型および正常乳房および乳癌^2,3の関連するシグナリングを研究するための重要なモデル系である。乳房の機能ユニットは、腺房へ分岐する小さなダクトで構成され、端末のダクト小葉単位（TDLU）です。腺房は、基底膜によって囲まれている⁵つの細胞層、上皮細胞および筋上皮細胞からなる高度に組織化された構造である。正常な腺房の最も顕著な特徴は、細胞の分極、基盤となる基底膜への付着や、特殊な細胞間接触である。この複雑な組織は浸潤癌で破壊されている。細胞が単層として成長させた広く使用されている2次元培養は、腺房の形成を可能にしないでください。このように、単層培養上皮細胞との間の複雑な関係を捕捉するシステムを提供することに欠けている正常な乳房と乳がんでの規制緩和にある。乳房細胞の機能的単型上皮培養物をいくつかの研究室^2,3に開発されている。三次元培養は、Engelbreth-Holm-Swarmマウス肉腫細胞由来の可溶化抽出物であり、市販されてマトリゲル上の乳房細胞の増殖を伴う。コラーゲンのような他の3D基層はIもまた使用される。乳癌細胞は、細胞がマトリゲル²で培養埋め込 ​​まれている3D埋め込 ​​みアッセイにより3次元で培養することができる。あるいは、細胞はまた、マトリゲルより少ない量を必要とし、位相コントラスト撮影によってコロニー形成の時間経過のモニタリングを容易にし、 その場イメージング ^{2 の}ために理想的であるように費用対効果のある、3Dオーバーレイアッセイ、いわゆる、トップアッセイに3Dで培養することができる^-3。上部アッセイに3Dは腺房表現型および遺伝子発現プロファイル⁷との間の相関を定義するために使用されている。

3D文化がeffectivすることができますエリー浸潤癌から正常および良性の細胞を区別するために使用される。通常の良性乳腺細胞が浸潤癌細胞が内腔の無いクリアで多産し、無計画に成長する一方で成長がマトリゲル上の中心部にある、明確に定義されたルーメンと偏光構造を逮捕形成している。 E6/E7不死化ヒト乳腺上皮細胞および線維嚢胞性変化を有する36歳の患者から単離された自然発生的に不死化細胞株であるMCF10A細胞株は、正常な3D ^3,8における良性乳房表現型を再捕捉するために使用されているとして役立ったいくつかの分子^8,9の発癌と腫瘍抑制機能を研究するためのモデルシステム。これらの良性の細胞は、レンチウイルス/レトロウイルスを導入することによって、目的の遺伝子（単数または複数）を操作するために操作することができる。目的の遺伝子（群）は、腫瘍抑制因子である場合は、目的の遺伝子が良性細胞では癌遺伝子の過剰発現であるかのに対し、shRNAを媒介ノックダウンは、悪性形質転換につながる悪性の表現型を示すべきである。どちらの場合も、3Dで形成された腺房構造は、悪性形質転換をキャプチャすることができます。

3Dでメッキ良性単一細胞は増殖し、球状構造ラウンドフォルムを開始します。一日5-8による細胞のこの球状凝集体は、マトリゲルと接触している細胞の周囲の偏光層と、マトリゲルとの接触を欠く少ない極性細胞の内塊へと分化する。次の10〜15日に、内側の細胞はアポトーシスが明らかに管腔を形成することにより、死に始めます。悪性細胞は、それらの極性を失って無計画に成長します。悪性度の高い細胞は、通常、分岐構造を形成する。表現型におけるこれらの差異は、タイムラプス位相コントラスト撮影によりその場で関連する分子マーカーを用いた免疫染色によって捕捉することができる。最も一般的に使用されるマーカーは、増殖マーカーホスホ - ヒストン3およびapoptotと組み合わせて、α-6インテグリン、基底極性マーカーであるでICマーカーはカスパーゼ-3を切断した。後者は、腺房の中心、正常および良性の乳房細胞の機能における内腔の形成があるかどうかを決定することが重要である。他方の極性と細胞間接触マーカーはGM130、ラミニン、ERM、E-カドヘリンが含まれる。交互に乳癌細胞株は、目的の遺伝子を操作するために操作することができる。この場合、それ以上の成長への復帰は、良性の表現型は癌表現型と区別するために読むようにして使用することができ逮捕した。

三次元培養はまた、悪性形質転換注意深く^10-11に関与するシグナル伝達経路を描写するために使用することができる。使用して、上記リードアウト、薬理学的阻害剤、遮断抗体又は組換えタンパク質を挙げるが悪性形質転換をもたらすシグナル伝達分子で突き止めることに使用することができる。種々の研究室からの継続的な努力とそれがRNAを単離し、また、免疫ブロット法および免疫のための溶解物を調製するために3Dから細胞を抽出することが可能であるnoprecipitation。これらの戦略は、プロトコルの段階的かつ詳細に説明されています。

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プロトコル

1。材料の作製と培養培地

1. 4℃のCO / Nの減少融解成長因子（GFR）マトリゲル
2. 37℃での必要な細胞株について完全なメディアを温めるMCF10A-ATCCは、メディアを指定していました。 5％ウシ胎児血清を補充したHME-HamのF-12培地、1μg/ mlのヒドロコルチゾン、5μg/ mlのインスリン、10 ng / mlの上皮増殖因子、および100 ng / mlのコレラ毒素; 5％FBS、2μg/ mlのヒドロコルチゾン及び5μg/ mlのインスリンを補充したSUM149-ハムF-12培地;およびMDA-MB-231から10パーセントFBS-DMEM
3. 氷上で8ウェルチャンバースライドを予冷。
4. 組織培養フード、用品を準備します。

8ウェルチャンバースライド中の2。三次元培養

1. コー​​トGFRマトリゲル40μlの8ウェルスライドの各ウェル。スライドの中央にマトリゲルを追加してから、P200のピペットチップを使用して拡散。につながる可能性気泡やoverspreadingを避け、できるだけ均等に広がるようにしてくださいメニスカス形成。
2. 5％CO ₂下、37℃でスライドをインキュベートする。マトリゲルが固化されているときに、細胞をトリプシン処理し、収集し4分間組織培養遠心分離機で150×gでスピン。
3. 細胞を計数し、各細胞株の完全培地中12,500細胞/ mlに希釈する。 2％GFRマトリゲルを追加し、マトリゲル予めコーティングチャンバースライドの各ウェルに400μLを加える。
4. CO ₂インキュベータ内でスライドをインキュベートします。 15日まで、すべての4 ^日目の新鮮な完全なメディアの変化を与える。
5. 薬理学的阻害剤を用いた治療：研究の阻害剤は、GFRマトリゲル上で細胞を成長させながら、3日ごと阻害剤を補充した新鮮な培地の変化に続いて、メッキの際に完全なメディアへの小分子阻害剤を追加します。
6. 精製タンパク質を用いた治療：
   1. 細胞プレート次は2.1から2.3を繰り返します。培養物は、血清starvati続く4日間増殖することができます16時間に。
   2. 5日目に、FBSは、血清飢餓細胞へのメディアの補足0.1％で精製されたタンパク質の適切な濃度で細胞を処理する。 2日後に精製したタンパク質を含む新鮮な培地交換を与えます。
   3. 10日目での完全なHMEメディアに馴化培地を交換してください。培養物は、別の5日間増殖することができます。
7. マトリゲル上で増殖させた腺房構造の免疫蛍光染色。
   1. 2％パラホルムアルデヒド、0.5％トリトンX-100および1×PBS、pH7.4中の100mMグリシンを調製する。 0.1％ウシ血清アルブミン、0.2％トリトンX-100、0.05％のTween-20を含む1×PBSを含む、免疫蛍光緩衝液（緩衝液IF）を調製する。
   2. 慎重に条件培地を吸引するP200のピペットチップを使用してください。
   3. 20分間室温（RT）で2％、新たに調製したホルムアルデヒドで腺房の構造を修正します。
   4. 4℃で10分間、0.5％トリトンX-100で細胞を透過
   5. 文化を洗う100mMグリシンエチルで3回、各洗浄のために10〜15分だ。
   6. RTで1時間、一次ブロックと呼ば​​IF緩衝液中の10％ヤギ血清で細胞をブロックする。
   7. 20μg/ mlのヤギ抗マウスのF（ab '）30分間の一次ブロックバッファ内の₂フラグメントと文化をインキュベートする。このステップは、マトリゲルで免疫反応性マウスIgG種をブロックすることが重要です。
   8. 第二のブロッキング溶液中で一次抗体と共にインキュベートし、4℃で（一次ブロック+20μg/ mlのヤギ抗マウスF（ab '）2フラグメント）O / N
   9. 10〜15分緩やかに揺り動かしながらそれぞれのIF緩衝液で3回洗浄する。
   10. 45分間のIFバッファ内の蛍光結合二次抗体でインキュベートする。
   11. 10分間の洗浄を3回穏やかに揺らしながらIF緩衝液を用いて、それぞれ。
   12. 核を可視化するために、DAPIを含有する抗退色試薬でスライドをマウントします。
   13. スライドを室温でO / Nを乾燥することができます。
   14. 画像収集：コロニー周辺で共焦点画像を取得マトリゲルの上に増殖した細胞のdsection。詳細については、Zスタッキングにより腺房構造の全長にわたって光学一連のセクションを取得する。

3。イムノ用2ウェルチャンバースライドで三次元培養

1. 氷上で2ウェルチャンバースライドを予冷。 2.1〜2.4がマトリゲル160μlの2ウェルチャンバースライドなどのコートのための試薬 ​​をスケールアップし、2ウェルスライドの各ウェルに混ぜ、細胞/マトリゲルの1.6ミリリットルを追加する手順に従います。
2. 製造業者の説明書に従って市販の3D培養の細胞の回収キットを用いてマトリゲルから腺房構造を収穫。
3. 1Xと4℃に予冷する細胞洗浄および細胞の回収バッファーを希釈マトリゲルの洗浄および脱落を氷上で行うべきである。
4. 細胞洗浄用緩衝液を用いて3倍腺房構造を洗ってください。
5. 細胞収穫BUを使用して15ミリリットル遠心チューブに腺房を収集ffer 4℃でロッカーで30分間インキュベートした1ミリリットルピペットでよく懸濁物を混ぜる。これを小片にマトリゲルを破壊し、細胞収穫バッファに細胞の大部分を解放します。
6. 培養遠心機で200×gで細胞をペレット化。 P200のピペットチップでペレット化した細胞からのヒドロゲルの浮遊層を除去する。
7. キットで提供SDSサンプル緩衝液中で溶解物を再懸濁する。 RIPA溶解緩衝液を使用することもできる。

悪性対良性乳房表現型の4。定量

1. ステップ2.1から2.4以下の各治療セットに対して三連で細胞を成長させる。
2. スライドシフタと、コンピュータに取り付けられた位相差顕微鏡を用いて5倍または10倍の解像度で各ウェルから腺房構造の位相コントラスト画像を撮影する。別のフレームからスライドを移動するため、チャンバースライドのウェル全体を覆うことにより、画像を取る。
3. 腺房構造の合計数をカウントし、シングルラウンドフラット腺房およびmultiacinar構造や組織を欠いて無計画に成長している構造の数の、それから発せられる分岐プロセスと数。
4. 棒グラフのような単一のラウンドフラット腺房構造の割合対悪性の構造とプロットを計算します。スチューデントのt検定で有意差を計算します。

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結果

3D培養物を効果的に良性の乳房からのヒト乳房上皮細胞の悪性の表現型を区別するために使用することができる。マトリゲル上にプレートし、単一の良性細胞が簡単に位相コントラストイメージングを用いて1つの平面内でラウンドフラット腺房として画像化することができる組織化球状構造として成長。マトリゲル上に播種単一の悪性細胞が、偶然に成長する非常に高い屈折率を示し、一平...

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ディスカッション

ここでは、再構成基底膜上の乳房上皮細胞の三次元培養および悪性対良性乳房表現型を区別するために、このシステムの有用性を記載している。このシステムはまた、他の腺組織由来の培養物の異なる細胞型に使用することができ、いくつかの正常^12-14に名前^を付けるために、培養前立腺上皮、気管支上皮、および甲状腺上皮細胞に使用されてきたことが報告されている。 3D?...

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資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Growth Factor Reduced Matrigel	BD Biosciences	354230	Avoid repeat freeze thaw
Lab-Tek glass hamber slides 8-well	Thermo Fisher Scientific	177402	Precool on ice
Lab-Tek glass chamber slides 2-well	Thermo Fisher Scientific	177380	Precool on ice
Goat anti mouse F(ab´)2 fragment	Jackson Immunoresearch	115-006-006
Normal goat serum	Jackson Immunoresearch	005-000-121
Fluorescent conjugated Alexa antibodies	Molecular Probes		Please look at molecular probes website
Prolong gold antifade reagent with DAPI	Molecular Probes	P36935
3D Culture Cell Harvesting kit	Trevigen	3448-020-k
Anti-Apha-6-integrin	Fisher Scientific	MAB1378	1:100 dilution for IF
Anti-GM130	BD Biosciences	610822	1:100 dilution for IF
Anti-phospho-histone 3 (Ser10)FITC Conjugated	Fisher Scientific	16-222	1:100 dilution for IF
Anti-Cleaved caspase 3 (Asp 175)	Cell Signaling	9661s	1:50 dilution for IF
Anti-E-cadherin	BD Biosciences	610181	1:200 dilution for IF