Трехмерные культуры: инструмента для изучения Normal Acinar Архитектура против злокачественной трансформации клеток молочной железы

Резюме

Трехмерная культура эпителиальных клеток молочной железы на восстановленного базальной мембраны является полезным методом резюмировать архитектуру в естественных условиях доброкачественной груди, и дифференцировать злокачественные фенотипа от фенотипа доброкачественной молочной железы. Важно отметить, что эта система может быть применена для изучения инвазивных карцином в других тканях.

Аннотация

Инвазивным раком молочной железы представляют собой группу злокачественных эпителиальных опухолей характеризуется вторжения в соседние ткани и склонность к метастазированию. Взаимодействие сигналов между раковыми клетками и их микросреды оказывает мощное влияние на рост рака молочной железы и биологическое поведение ^1. Тем не менее, большинство из этих сигналов от внеклеточного матрикса, потеряны или их актуальность недостаточно изучена, когда клетки выращивают в культуре двумерной (2D) в виде монослоя. В последние годы трехмерная (3D) культура на восстановленного базальной мембраны возник как метод выбора резюмировать тканевое архитектуру доброкачественных и злокачественных клеток молочной железы. Клетки, выращенные в 3D сохранить важные сигналы от внеклеточного матрикса и обеспечить физиологически соответствующую Экс Vivo системы ^2,3. Следует отметить, что появляется все больше доказательств предполагая, что клетки ведут себя по-разному при выращивании в 3D по сравнению с 2D ^4. 3D культурамогут быть эффективно использованы в качестве средства различения злокачественного фенотипа с фенотипом доброкачественной молочной и лежащие в основе клеточных и молекулярных сигналов участвуют ^3. Одной из отличительных характеристик доброкачественных эпителиальных клеток является то, что они поляризованы так, чтобы верхушечная цитоплазма к полости, а базальная цитоплазма лежит на базальной мембране. Это апикально-базальной полярности теряется в инвазивным раком молочной железы, которые характеризуются клеточной дезорганизации и формирования анастомоз и ветвление канальцы, что случайно проникает в окружающий стромы. Эти гистологические различия между доброкачественной железы и инвазивным раком могут быть воспроизведены в 3D ^6,7. Используя соответствующие выходы для чтения как количественного один раунд ацинарных структур или дифференциальной экспрессии проверенных молекулярных маркеров для клеточной пролиферации, полярности и апоптоза в сочетании с другими молекулярных и клеточных методов биологии, 3D культурное может служить важным инструментом для лучшего понимания клеточных изменений во злокачественной трансформации и для очерчивания ответственного сигнализации.

Введение

Трехмерная культура (3D) молочной эпителиальных клеток на восстановленного базальной мембраны является важным модельной системой для изучения сложного фенотипа и связанного сигнализацию нормальной молочной железы и рака молочной железы ^2,3. Функциональная единица груди является выводной проток очаговая блок (TDLU), который состоит из небольшой канал, который разветвляется на ацинусов. В ацинусы очень организованные структуры, состоящие из двух слоев клеток, эпителиальных и миоэпителиальных клеток, которые окружены базальной мембраной ^5. Наиболее отличительные черты нормальных ацинусов являются клеточными поляризация, привязанность к подлежащей базальной мембраны и специализированные контакты межклеточные. Это сложная организация нарушается в инвазивным раком. Широко используемые 2D культур, где клетки выращивают в виде монослоев, не позволяют для формирования ацинусов. Таким образом, монослой культуры недостает обеспечение системы для захвата сложную взаимосвязь между эпителиальными клеткамив нормальном груди и их дерегулирования при раке молочной железы. Функциональные монотипический эпителиальные культуры клеток молочной железы были разработаны в нескольких лабораториях ^2,3. 3D культура включает рост клеток молочной железы на Матригель, который является солюбилизированного экстракта получают из Engelbreth-Холм-Swarm клеток саркомы мыши и коммерчески доступен. Другие 3D субстраты, как коллаген Я также используются. Груди клетки можно культивировать в 3D на 3D встроенного анализа, где культивируют клетки встроены в Матригель ^2. Кроме того, клетки можно культивировать на 3D на верхнем анализа, которая также называется 3D наложения Пробирной, который является экономически эффективным, так как требует меньшего объема Матригель, и облегчает времени мониторинг прошествии образования колоний контрастной томографии фазы и идеально подходит для на месте визуализации ^{2 -3.} 3D сверху анализа был использован для определения корреляции между ацинозной фенотипа и профиля экспрессии генов ^7.

3D культура может быть effectivелы используется, чтобы различать нормальные и доброкачественных клеток от инвазивной карциномы. Нормальные и доброкачественные клетки груди образуют рост арестован поляризованных структур с четко определенными просвет в центре на Матригель тогда инвазивные клетки карциномы растут в изобилии и бессистемно, без очистки просвета. Е6/Е7 увековечены человека эпителиальные клетки молочной железы и клеточной линии MCF10A, который является спонтанно увековечены клеточная линия, выделенный из 36-летнего пациента с фиброзно-кистозной изменений, были успешно использованы, чтобы вернуть фенотип доброкачественной молочной железы в 3D ^3,8 и послужили модельная система для изучения онкогенных и супрессоров опухолей функцию нескольких молекул ^8,9. Эти доброкачественные клетки могут быть спроектированы, чтобы манипулировать ген (ы) из интереса путем введения лентивирусов / ретровируса. Если ген (ы) интерес представляет собой супрессор опухоли, shRNA обусловленный нокдаун приведет к злокачественной трансформации, тогда как, если интересующий ген является избыточная экспрессия онкогена в клетки доброкачественныхдолжен показать злокачественного фенотипа. В обоих случаях ацинарные структуры, образованные в 3D может захватить злокачественной трансформации.

Доброкачественные одиночные клетки высевали в 3D начинают размножаться и образуют вокруг сферические структуры. Днем 5-8 этот сферический агрегат клеток будет дифференцироваться в окружающей поляризованного слоя клеток, который находится в контакте с Матригель и внутренней массой менее поляризованных клетках, в которых отсутствует контакт с Матригель. В ближайшие 10-15 дней внутренние клетки начинают умирать от апоптоза формирования четкого просвет. Злокачественные клетки будут расти случайно теряют свою полярность. Высоко злокачественные клетки обычно образуют ветвящиеся структуры. Эти различия в фенотипа могут быть захвачены времени контрастности изображений промежуток фазы и на месте иммуноокрашивания с соответствующими молекулярных маркеров. Наиболее часто используемые маркеры альфа 6-интегрин, базальный полярность маркер, в сочетании с распространением маркера фосфо-гистон 3 и apoptotМикросхема маркер расщепляется каспазы-3. Последнее важно, чтобы определить, есть ли просвет формирование в центре ацинусов, особенность нормальных и злокачественных клеток молочной железы. Другие полярности и межклеточного контакта маркеры включают GM130, ламинин, ERM, E-кадгерина. В качестве альтернативы линии клеток рака молочной железы может быть спроектирован для управления представляющий интерес ген. В этом случае возврат к более роста доброкачественных задержанного фенотип может быть использован как считывать отличить от фенотипа рака.

3D культура также может использовать осторожно, чтобы очертить сигнальные пути, участвующие в злокачественной трансформации ^10-11. Использование указанное выше индикаторы, устройства фармакологические ингибиторы, блокирующие антитела или рекомбинантные белки могут быть использованы быть точно на молекулярном сигнализации, ведущие к злокачественной трансформации. С неустанные усилия различных лабораториях можно извлечь клетки от 3D изолировать РНК, а также подготовить лизатов для иммуноблотинга и IMMUnoprecipitation. Эти стратегии описаны в поэтапной и подробным образом в протоколе.

протокол

1. Подготовка материалов и культура СМИ

1. Оттепель фактор роста снижается (СКФ) Матригель при 4 ° СО / Н.
2. Разминка полные носители для требуемой клеточной линии при 37 ° С MCF10A-АТСС указано СМИ; F-12 средний HME-Хэма с добавлением 5% фетальной бычьей сыворотки, 1 мкг / мл гидрокортизона, 5 мкг / мл инсулина, 10 нг / мл эпидермального фактора роста и 100 нг / мл холерного токсина; F-12 медиа-SUM149 Хама с добавлением 5% FBS, 2 мкг / мл гидрокортизона и 5 мкг / мл инсулина; и MDA-MB-231-10% FBS-DMEM
3. Предварительного охлаждения в камере слайд 8-а на льду.
4. Подготовка капот культуры ткани и материалы.

2. Трехмерная Культура в 8-а палаты Slide

1. Пальто каждую лунку 8-а слайд с 40 мкл СКФ Матригель. Добавьте Матригель в центре слайда, а затем распространилась с помощью пипетки P200. Попробуйте распространяться как можно более равномерно, избегая пузырьков и крыле, которые могут привести кформирование мениска.
2. Выдержите слайды при 37 ° С в атмосфере 5% CO _2. В то время как Матригель является укрепляя, Trypsinize клетки, собирать и вращаются на 150 мкг в культуре ткани центрифуги в течение 4 мин.
3. Граф клеток и разбавляют до 12 500 клеток / мл в полной среды соответствующего клеточной линии. Добавить СКФ Матригель до 2% и добавить 400 мкл на каждую лунку Матригель предварительно покрытый камеры слайда.
4. Инкубируйте слайды в СО _{2-инкубаторе.} Не давать свежие полные изменения медиа каждый ^4-й день, пока 15 дней.
5. Лечение с помощью фармакологических ингибиторов: Для исследования ингибитор добавляют низкомолекулярные ингибиторы к полной среде в момент посева с последующим свежих изменений среде с ингибиторами каждые три дня при выращивании клеток на СКФ Матригель.
6. Лечение очищенного белка:
   1. Пластина клетки следующие шаги 2.1-2.3. Разрешить культуры расти в течение 4 дней, после чего в сыворотке starvatiв течение 16 часов.
   2. В 5-й день, лечить клетки с соответствующей концентрации очищенного белка в 0,1% FBS дополненной СМИ к голодающих клеток в сыворотке крови. Дайте свежую изменение медиа с очищенного белка через 2 дня.
   3. В 10-й день заменить кондиционированной среды с полным HME СМИ. Разрешить культуры расти в течение еще 5 дней.
7. Иммунофлуоресцентное окрашивание ацинарных структур, выращенных на Матригель:
   1. Подготовка 2% параформальдегида, 0,5% Тритон Х-100 и 100 мМ глицина в 1X PBS, рН 7,4. Подготовка иммунофлюоресценции буфера (если буфер), который состоит из 1x PBS, содержащим 0,1% бычьего сывороточного альбумина, 0,2% Тритон Х-100, 0,05% Tween-20.
   2. Используйте пипетки P200 тщательно аспирации кондиционированной среды.
   3. Закрепить ацинарных структуры с 2% свежеприготовленного параформальдегида при комнатной температуре (RT) в течение 20 мин.
   4. Клетки проницаемыми с 0,5% Triton X-100 в течение 10 мин при 4 ° С.
   5. Вымойте культурысек три раза 100 мМ глицина, 10-15 мин для каждой стирки.
   6. Блок клеток с 10% козьей сывороткой, если буфер, называемый первичный блок, в течение 1 часа при комнатной температуре.
   7. Инкубируют культуры с 20 мкг / мл козьего анти мыши F (аb ') _{2-фрагмент} в первичном буфере блока течение 30 мин. Этот шаг важен для блокирования иммунореактивные мыши видов IgG в Матригель.
   8. Инкубировать с первичным антителом во втором блокирующего раствора (Первичный блок +20 мкг / мл козьего антитела мыши F (аb ') 2-фрагмент) O / N при 4 ° С.
   9. Вымойте три раза IF буфер в течение 10-15 мин каждого с нежным покачиванием.
   10. Инкубировать с флуоресцентными сопряженных вторичными антителами, если буфере в течение 45 мин.
   11. Вымойте 3x в течение 10 мин каждый с IF буфер с нежным покачиванием.
   12. Установите слайды с анти-выцветанию реагентом, содержащим DAPI визуализировать ядра.
   13. Разрешить слайды высохнуть O / N при комнатной температуре.
   14. Получение изображений: Приобретать конфокальных изображений в колонии миdsection из клеток, выращенных в верхней части Матригель. Для получения дополнительной информации приобретать серию оптических срезов по всей длине конструкции ацинозной по Z укладки.

3. Трехмерная Культура в 2-а палаты Слайды для Иммуноблоттинг

1. Предварительного охлаждения камерный слайд 2-а на льду. Выполните шаги 2.1-2.4 расширения реагенты для 2-а камеры слайд например пальто с 160 мкл Матригель и добавить 1,6 мл клеточной / Матригель смешивать в каждую лунку слайде 2-а.
2. Урожай ацинарные структуры от Матригель помощью коммерчески доступного набора уборки 3D клеточная культура в соответствии с инструкциями изготовителя.
3. Развести мытья клеток и клеток от буферов 1x и предварительного охлаждения до 4 ° С Стиральная и оплывание Матригель следует проводить на льду.
4. Вымойте ацинарные структуры 3x с помощью буфера для промывки ячеек.
5. Соберите ацинусы на 15 мл центрифужные пробирки с помощью сбора клеток буffer затем 30 мин инкубации на качалке при 4 ° С. Смешайте подвеска хорошо с 1 мл пипетки. Это сломает Матригель на мелкие кусочки и отпустите большинство клеток в буфере уборки клеток.
6. Гранул клеток при 200g в питательной центрифуге. Снимите с плавающей слой гидрогеля из осажденной клеток с кончика пипетки P200.
7. Ресуспендируют лизатов в SDS буфера для образца, входящие в комплект. РИПА лизис буфера также может быть использован.

4. Количественная оценка Злокачественная против доброкачественной молочной фенотипа

1. Рост клеток в трех экземплярах для каждого набора лечения следующие шаги 2.1-2.4.
2. Возьмите контрастные изображения Фаза ацинарных структур из каждой лунки на 5X или разрешения 10X с использованием контрастного микроскопа фаз, прикрепленный к слайд переключения передач и компьютером. Возьмем изображения путем перемещения слайд из одного кадра к другому, и, таким образом, охватывает весь лунку патрон слайда.
3. Подсчитать общее количество ацинарных структур,количество одной плоской круглой ацинусов и количества multiacinar структур или случайно растущих структур, не имеющих организацию и с ветвления процессов, вытекающих из нее.
4. Рассчитать процент одиноких круглых структур плоским ацинарных против злокачественных структур и сюжет как колонки графике. Вычислить значение Т-критерия Стьюдента.

Результаты

3D культура может быть эффективно использован для дифференциации злокачественной фенотип эпителиальных клеток молочной железы человека от доброкачественной груди. Одиночные доброкачественные клетки высевали на Матригель расти как организованных сферических структур, которые могу?...

Обсуждение

Мы описали здесь трехмерную культуру эпителиальных клеток молочной железы на восстановленного базальной мембраны и полезность этой системы различать фенотипа доброкачественной молочной злокачественная против. Эта система также может быть использован для культуры различных типов ?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Growth Factor Reduced Matrigel	BD Biosciences	354230	Avoid repeat freeze thaw
Lab-Tek glass hamber slides 8-well	Thermo Fisher Scientific	177402	Precool on ice
Lab-Tek glass chamber slides 2-well	Thermo Fisher Scientific	177380	Precool on ice
Goat anti mouse F(ab´)2 fragment	Jackson Immunoresearch	115-006-006
Normal goat serum	Jackson Immunoresearch	005-000-121
Fluorescent conjugated Alexa antibodies	Molecular Probes		Please look at molecular probes website
Prolong gold antifade reagent with DAPI	Molecular Probes	P36935
3D Culture Cell Harvesting kit	Trevigen	3448-020-k
Anti-Apha-6-integrin	Fisher Scientific	MAB1378	1:100 dilution for IF
Anti-GM130	BD Biosciences	610822	1:100 dilution for IF
Anti-phospho-histone 3 (Ser10)FITC Conjugated	Fisher Scientific	16-222	1:100 dilution for IF
Anti-Cleaved caspase 3 (Asp 175)	Cell Signaling	9661s	1:50 dilution for IF
Anti-E-cadherin	BD Biosciences	610181	1:200 dilution for IF