Três Culturas dimensionais: Uma ferramenta para o estudo normal Acináceo Arquitetura vs transformação maligna das células de mama

Resumo

Três cultura tridimensional de células epiteliais mamárias de uma membrana basal reconstituída é um método útil para recapitular a arquitectura in vivo da mama benigna, e para diferenciar o fenótipo maligno do fenótipo da mama benigna. Importante, este sistema pode ser aplicado para estudar os carcinomas invasivos em outros tecidos.

Resumo

Carcinomas da mama invasivos são um grupo de tumores epiteliais malignos caracterizada pela invasão de tecidos adjacentes e propensão para metástase. A interação de sinais entre as células cancerosas e seu microambiente exerce uma poderosa influência sobre o crescimento do câncer de mama e comportamento biológico ^1. No entanto, a maioria destes sinais a partir da matriz extracelular são perdidas ou a sua relevância é subinvestigada quando as células são cultivadas em cultura de duas dimensões (2D) como uma monocamada. Nos últimos anos, a cultura tridimensional (3D) com uma membrana basal reconstituída tem surgido como um método de escolha para recapitular a arquitectura dos tecidos de células mamárias benignas e malignas. As células cultivadas em 3D reter as pistas importantes da matriz extracelular e fornecem um sistema ex vivo ^2,3 fisiologicamente relevante. De notar que há cada vez mais evidências sugerindo que as células se comportam de forma diferente quando cultivada em 3D, em comparação com ⁴ 2D. Cultura 3Dpode ser eficazmente utilizada como um meio para diferenciar o fenótipo maligno do fenótipo benigna da mama e para cimentar a sinalização celular e molecular envolvida ^3. Uma das características distintas de células epiteliais benignas é que eles são polarizados de modo a que o citoplasma é apical para o lúmen e o citoplasma basal repousa sobre a membrana basal. Esta polaridade apico-basal é perdida em carcinomas invasivos da mama, que são caracterizadas por desorganização celular e formação da anastomose e ramificação túbulos que esmo infiltrados do estroma circundante. Estas diferenças histopatológicas entre glândula benigna e carcinoma invasivo pode ser reproduzido em ^6,7 3D. Usando os Read-outs apropriadas como a quantificação de estruturas individuais acinares redondos, ou a expressão diferencial de marcadores moleculares validados para a proliferação celular, a polaridade e a apoptose, em combinação com outras técnicas de biologia molecular e celular, cultur 3De pode fornecer uma ferramenta importante para compreender melhor as alterações celulares durante a transformação maligna e para delinear a sinalização responsável.

Introdução

Cultura tridimensional (3D) de células epiteliais de mama na membrana basal reconstituída é um importante sistema modelo para estudar o fenótipo complexo e sinalização associada da mama normal e câncer de mama ^2,3. A unidade funcional de mama lobular é a unidade terminal de conduta (TDLU) que consiste de uma pequena conduta que se ramifica em ácinos. Os ácinos são estruturas altamente organizadas, compostas por duas camadas de células, células epiteliais e mioepiteliais, que estão rodeados por uma membrana basal ^5. As características mais distintivas de ácinos normais são polarização celular, o apego à membrana basal subjacente e contatos célula-célula especializados. Essa organização complexa é interrompido em carcinomas invasivos. As culturas 2D amplamente utilizados, em que as células são crescidas como monocamadas, não permitem a formação de ácinos. Assim, a cultura em monocamada é falta de fornecimento de um sistema para capturar a intrincada relação entre as células epiteliaisem mama normal e sua desregulamentação em câncer de mama. Culturas epiteliais monotípicas funcionais de células da mama foram desenvolvidas em vários laboratórios de ^2,3. Cultura 3D envolve o crescimento de células da mama em Matrigel, que é um extracto solubilizado derivado de Engelbreth-Holm-Swarm células de sarcoma de ratinho e está disponível comercialmente. Outros substratos 3D como o colágeno também são usados. As células da mama podem ser cultivadas em 3D pelo ensaio incorporado 3D, em que as células são cultivadas incorporado em Matrigel ^2. Alternativamente, as células podem ser cultivadas por 3D em cima ensaio, também chamado de teste de sobreposição 3D, que é rentável, pois requer menor volume de Matrigel, e facilita o monitoramento do lapso de tempo de formação de colônias por imagem de contraste de fase e é ideal para imagens em situ ^{2 -3.} O 3D no topo ensaio tem sido utilizado para definir a correlação entre o fenótipo acinar e do perfil de expressão do gene ^7.

Cultura 3D pode ser effectively usado para distinguir células normais e benignos do carcinoma invasivo. Células mamárias normais e benignos formar crescimento preso estruturas polarizadas com um lúmen bem definidas no centro em Matrigel enquanto que as células de carcinoma invasivo crescer prolífica e ao acaso, sem compensação da luz. E6/E7 imortalizada de células epiteliais mamárias humanas e uma linha celular MCF10A, que é uma linha celular imortalizada espontaneamente, isolado a partir de uma paciente de 36 anos de idade com alterações fibrocística, têm sido utilizados com sucesso para recuperar o fenótipo benigna da mama em 3D ^3,8 e serviram um sistema-modelo para estudar a função supressora de tumores oncogénicos e de várias moléculas de ^8,9. Estas células benignas podem ser modificados para manipular a gene (s) de interesse com a introdução de lentivírus / retrovírus. Se o gene (s) de interesse é um supressor de tumor, knockdown shRNA mediada conduzirá a uma transformação maligna que, quando o gene de interesse é uma sobre-expressão de oncogenes em células benignasdeve mostrar um fenótipo maligno. Em ambos os casos, as estruturas acinares formados em 3D pode captar a transformação maligna.

Células individuais benignos banhado em 3D começam a proliferar e formar rodada estruturas esféricas. Por dia 5-8 agregado esférico de células irá diferenciar em uma camada circundante de células polarizadas que está em contacto com o Matrigel e uma massa interna de células polarizadas menos, que carecem de contacto com o Matrigel. Nos próximos 10-15 dias, as células interiores vão começar a morrer por apoptose formando um lúmen claro. As células malignas vai crescer desordenadamente perder sua polaridade. Células altamente malignas geralmente formar estruturas de ramificação. Estas diferenças no fenótipo pode ser capturada por tempo fase lapso de imagem contraste e por in situ imunomarcação com marcadores moleculares relevantes. Os marcadores mais vulgarmente utilizados são alfa 6-integrina, um marcador de polaridade basal, em associação com o marcador da proliferação de fosfo-histona 3 e o apoptotmarcador ic caspase-3. Esta última é importante para determinar se existe a formação de lumen no centro dos ácinos, uma característica de células normais e benignas da mama. Outros polaridade e de contato célula-célula marcadores incluem GM130, laminina, ERM, E-caderina. Alternativamente as linhas de células de cancro da mama podem ser modificados para manipular o gene de interesse. Neste caso, a reversão para um crescimento mais preso fenótipo benigno pode ser usado como um lido para distinguir do fenótipo do cancro.

Cultura 3D também pode ser usada com cautela para delinear as vias de sinalização envolvidas na transformação maligna ^10-11. Usando o acima mencionado limite lidos, inibidores farmacológicos, os anticorpos de bloqueio ou proteínas recombinantes podem ser usadas se localizar na sinalização molecular conduzindo a uma transformação maligna. Com esforços contínuos de vários laboratórios, é possível extrair as células de 3D para isolar RNA e também preparar lisados ​​por immunoblotting e imunizaçãonoprecipitation. Estas estratégias são descritas em um passo a passo e forma detalhada no protocolo.

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Protocolo

1. Preparação de Materiais e Meios de Cultura

1. Fator de crescimento Thaw reduzida (TFG) Matrigel a 4 ° CO / N.
2. Aqueça mídia completas para linha celular necessário a 37 ° C. MCF10A-ATCC especificado media; Meio F-12 de Ham-HME suplementado com 5% de soro fetal bovino, ml, 5 ug / ml de insulina, factor de 1 ug / hidrocortisona de 10 ng / mL de crescimento epidérmico, e 100 ng de toxina da cólera ml /; F-12 media de SUM149-Ham suplementado com FBS a 5%, 2 ug / ml de hidrocortisona e de 5 ug / ml de insulina; e MDA-MB-231-10% de FBS-DMEM
3. Precool um slide de câmara de 8 poços no gelo.
4. Prepare cultura de tecidos capô e suprimentos.

2. Três Cultura Dimensional em 8 poços Deslize Câmara

1. Casaco de cada poço a 8 poços corrediça com 40 ul de GFR Matrigel. Adicionar o Matrigel no centro da lâmina e, em seguida, espalhada com uma pipeta de ponta P200. Tente espalhar o mais uniformemente possível, evitando bolhas e espalhando que pode levar aformação do menisco.
2. Incubar as lâminas a 37 ° C sob 5% de CO _2. Enquanto o Matrigel está solidificando, trypsinize as células, recolher e girar a 150 xg em cultura de tecidos centrifugar por 4 min.
3. Contar as células e dilui-se a 12.500 células / mL em meios completos da linha celular respectivos. Adicionar TFG Matrigel a 2% e adicionar 400 ul a cada poço de uma lâmina de câmara de pré-revestidas de Matrigel.
4. Incubar as lâminas na incubadora de CO _2. Dar novas mudanças de mídia completas a cada 4 ^º dia até 15 dias.
5. O tratamento com inibidores farmacológicos: Para estudos de inibidor de adicionar os inibidores de moléculas pequenas para o meio completo no momento do plaqueamento seguido por mudanças de meio fresco suplementado com os inibidores de três em três dias, enquanto o crescimento das células em TFG Matrigel.
6. O tratamento com a proteína purificada:
   1. Placa as células seguintes passos 2,1-2,3. Permitir que as culturas a crescer durante 4 dias, seguido por starvati soropor 16 h.
   2. No dia 5, tratar as células com uma concentração apropriada de proteína purificada em 0,1% de FBS suplementado com os meios de células em jejum de soro. Dê mudança meio fresco com proteína purificada após 2 dias.
   3. No dia 10 de substituir a meios condicionados com a mídia HME completos. Permitir que as culturas a crescer durante mais 5 dias.
7. Coloração por imunofluorescência de estruturas acinares cultivadas em Matrigel:
   1. Prepare a 2% de paraformaldeído, 0,5% de Triton X-100 e 100 mM de glicina em 1x PBS, pH 7,4. Preparar tampão de imunofluorescência (IF tampão), que compreende de 1 x PBS contendo 0,1% de albumina de soro bovino, 0,2% de triton X-100, 0,05% de Tween-20.
   2. Use uma pipeta de ponta P200 para aspirar cuidadosamente a meios condicionados.
   3. Fixar as estruturas acinares com paraformaldeído a 2% preparada de fresco, à temperatura ambiente (RT) durante 20 min.
   4. Permeabilizar as células com 0,5% de Triton X-100 durante 10 min a 4 ° C.
   5. Lava-se a culturas três vezes com 100 mM glicina, 10-15 minutos para cada lavagem.
   6. Bloquear as células com 10% de soro de cabra em tampão IF, chamado bloco primário, durante 1 hora a RT.
   7. Incubar as culturas com 20 ng / ml de cabra anti-rato F (ab ') ₂ em tampão fragmento bloco primário durante 30 min. Esta etapa é importante para bloquear a espécie de IgG de ratinho imunorreactivas em Matrigel.
   8. Incubar com anticorpo primário em que a segunda solução de bloqueio (bloco primário 20 ug / ml de cabra anti-rato F (ab ') 2 fragment) O / N a 4 ° C.
   9. Lavar três vezes com tampão IF por 10-15 min cada um com balanço suave.
   10. Incube com anticorpos secundários conjugados fluorescentes em tampão IF para 45 min.
   11. Lavar 3x por 10 minutos cada com tampão IF com balanço suave.
   12. Montar as lâminas com o reagente anti-fade contendo DAPI para visualizar os núcleos.
   13. Permitir que as lâminas secar O / N à temperatura ambiente.
   14. A aquisição de imagens: Adquirir imagens confocal nas milhas da colôniadsection de células cultivadas em cima de Matrigel. Para mais informações adquirir uma série de secções ópticas ao longo de todo o comprimento da estrutura acinar por Z empilhamento.

3. Três Cultura Dimensional em 2-bem Câmara Slides para Immunoblotting

1. Precool um slide câmara de 2-bem no gelo. Siga passos 2,1-2,4 intensificação os reagentes para a câmara de 2-bem corrediça por exemplo revestimento com 160 mL de Matrigel e adicionar 1.6 ml de células / Matrigel misturar a cada poço da 2-bem corrediça.
2. Colher as estruturas acinares de Matrigel, utilizando o estojo de colheita de células de cultura 3D disponível comercialmente seguindo as instruções do fabricante.
3. Diluir a lavagem das células e colheita de células buffers para 1x e pré-resfriamento a 4 ° C. Lavar e deslocamento de Matrigel deve ser levada a cabo em gelo.
4. Lavar as estruturas acinares 3x utilizando o tampão de lavagem celular.
5. Recolher o ácinos em 15 ml tubos de centrífuga usando bu colheita de célulasffer seguido por 30 min de incubação num agitador rotativo a 4 ° C. Misture bem a suspensão com uma pipeta de 1 ml. Isto vai quebrar o Matrigel em pequenos pedaços e libertar a maior parte das células do tampão de colheita de células.
6. Agregar as células a 200 xg numa centrifugadora de cultura. Retire a camada flutuante de hidrogel a partir de células peletizadas com uma pipeta de ponta P200.
7. Ressuspender as lisados ​​em tampão de amostra de SDS fornecidos com o kit. Tampão de lise RIPA também pode ser usado.

4. Quantificação de vs maligno Fenótipo benigna da mama

1. Cultivar células em triplicatas para cada conjunto de tratamento seguindo os passos 2,1-2,4.
2. Faça imagens de contraste de fase de estruturas acinares de cada poço em 5X ou 10X resolução usando um microscópio de contraste de fase ligada a um shifter de slides e um computador. Tome as imagens movendo o cursor de um quadro para outro e, assim, cobrindo todo o bem do slide compartimentado.
3. Contar o número total de estruturas acinareso número de ácinos único plana redonda e do número de estruturas multiacinar ou estruturas esmo crescente falta de organização e aos processos de ramificação que dele emanam.
4. Calcule a porcentagem de estruturas acinares plana redondas individuais versus estruturas malignas e enredo como gráfico de colunas. Calcula-se a significância pelo teste t de Student.

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Resultados

Cultura 3D pode ser efetivamente usado para diferenciar fenótipo maligno das células epiteliais mamárias humanas do peito benigno. Células benignas Solteiro banhado em Matrigel crescer como estruturas esféricas organizados, que podem facilmente ser fotografada como único ácinos plana rodada em um avião usando imagens de contraste de fase. As células malignas único banhado em Matrigel crescer de forma anárquica, mostrar muito elevado índice de refração e são difíceis de imagem em um plano. Como mostrado n...

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Discussão

Nós descrevemos aqui a cultura tridimensional de células epiteliais mamárias de uma membrana basal reconstituída e a utilidade deste sistema para diferenciar entre versus maligna fenótipo benigna da mama. Este sistema também pode ser utilizado para cultura de diferentes tipos de células de outros tecidos glandulares e tem sido relatada como tendo sido utilizados com sucesso para a cultura epitelial da próstata, do epitélio brônquico, e as células epiteliais da tiróide, para citar alguns ^12-14. A i...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Growth Factor Reduced Matrigel	BD Biosciences	354230	Avoid repeat freeze thaw
Lab-Tek glass hamber slides 8-well	Thermo Fisher Scientific	177402	Precool on ice
Lab-Tek glass chamber slides 2-well	Thermo Fisher Scientific	177380	Precool on ice
Goat anti mouse F(ab´)2 fragment	Jackson Immunoresearch	115-006-006
Normal goat serum	Jackson Immunoresearch	005-000-121
Fluorescent conjugated Alexa antibodies	Molecular Probes		Please look at molecular probes website
Prolong gold antifade reagent with DAPI	Molecular Probes	P36935
3D Culture Cell Harvesting kit	Trevigen	3448-020-k
Anti-Apha-6-integrin	Fisher Scientific	MAB1378	1:100 dilution for IF
Anti-GM130	BD Biosciences	610822	1:100 dilution for IF
Anti-phospho-histone 3 (Ser10)FITC Conjugated	Fisher Scientific	16-222	1:100 dilution for IF
Anti-Cleaved caspase 3 (Asp 175)	Cell Signaling	9661s	1:50 dilution for IF
Anti-E-cadherin	BD Biosciences	610181	1:200 dilution for IF