שלוש תרבויות ממדים: כלי ללמוד רגיל אדריכלות acinar לעומת שינוי ממאיר של תאי שד

Summary

שלוש תרבות ממדית של תאי אפיתל החלב בקרום במרתף מחדש היא שיטה שימושית לשחזר את ארכיטקטורת vivo של השד השפיר, וכדי לבדל את הפנוטיפ הממאיר מפנוטיפ שפיר בשד. חשוב מכך, מערכת זו יכולה להיות מיושמת ללמוד קרצינומות פולשני ברקמות אחרות.

Abstract

קרצינומות שד פולשני הן קבוצה של גידולי אפיתל ממאירים מאופיינת בחדירה לרקמות סמוכות ונטייה לגרורות. משחק הגומלין של אותות בין תאים סרטניים והמיקרו שלהם השפעה חזקה על צמיחת סרטן השד והתנהגות ¹ ביולוגית. עם זאת, רובם של אותות הבאים מהמטריצה ​​תאית אבדו או את הרלוונטיות שלהם היא understudied כאשר תאים גדלים בשתי תרבות ממדית (2D) כשכבה. בשנים האחרונות, שלוש תרבות ממדים (3D) בקרום במרתף מחדש התפתחה כשיטת בחירה לשחזר את ארכיטקטורת הרקמה של תאים בשד שפירים וממאירים. תאים שגודלו ב3D לשמר את הרמזים החשובים מהמטריצה ​​תאית ולספק לשעבר vivo ^2,3 מערכת רלוונטי מבחינה פיזיולוגית. ראוי לציין, שיש ראיות הולכות ומצטברים מצביעים על כך שהתאים מתנהגים בצורה שונה כאשר גדלו ב3D לעומת ⁴ 2D. תרבות 3Dניתן להשתמש ביעילות כאמצעי לבדל את הפנוטיפ הממאיר מפנוטיפ שפיר בשד ושבסיס האיתות התאית ומולקולרית מעורב ^3. אחד מסימני ההיכר של תאי אפיתל השפירים הוא שהם מקוטבים כך שהציטופלסמה הפסגה היא לכיוון הלום וציטופלסמה הבסיסית נשענת על הקרום במרתף. קוטביות apico-הבסיסי הזה אבוד, בקרצינומות שד פולשני, המתאפיינים בחוסר ארגון והיווצרות anastomosing והסתעפות צינוריות שאקראי מחלחל stroma סביב סלולריים. הבדלים אלה בין histopathological בלוטה שפירה וקרצינומה פולשנית יכולים להיות מועתק ב3D ^6,7. שימוש בקריאת פסקי המתאימים כמו לכמת את מבני acinar סיבוב בודדים, או דיפרנציאלי ביטוי של סמנים מולקולריים תוקף להתפשטות תאים, קוטביות ואפופטוזיס בשילוב עם טכניקות אחרות מולקולריות וביולוגיה של תא, תרבות 3Dדואר יכול לספק כלי חשוב כדי להבין טוב יותר את השינויים התאיים בשינוי ממאיר ומגדיר את האיתות אחראית.

Introduction

שלוש תרבות ממדי (3D) של תאי אפיתל שד על קרום במרתף מחדש היא מערכת מודל חשובה ללמוד את הפנוטיפ המורכב והאיתות קשורה של שד נורמלי וסרטן השד ^2,3. היחידה התפקודית של שד היא יחידת מסוף צינור lobular (TDLU) אשר מורכבת מצינור קטן שסניפים לacini. Acini הם מבנים מאורגנים מאוד, מורכב משתי שכבות תאים, תאי אפיתל וmyoepithelial, אשר מוקפות בקרום במרתף ^5. התכונות הייחודיות ביותר של acini הנורמלי הן קיטוב סלולארי, קובץ מצורף לקרום במרתף המשמש כבסיס וקשר מיוחד תאי תאים. ארגון מורכב זו מופר בקרצינומות פולשנית. תרבויות 2D בשימוש נרחב, שבו תאים גדלים כמו monolayers, אל תאפשר להיווצרות של acini. לפיכך, תרבות monolayer חסרה במתן מערכת כדי ללכוד את מערכת היחסים המורכבות שבין תאי האפיתלבשד נורמלי והסרת הפיקוח שלהם בסרטן השד. תרבויות אפיתל monotypic תפקודיות של תאי שד פותחו במספר מעבדות ^2,3. תרבות 3D כוללת את הצמיחה של תאי שד על Matrigel, שהוא תמצית solubilized שמקורם בתאי סרקומה עכבר Engelbreth-Holm-נחיל והוא זמין באופן מסחרי. מצע 3D אחר כמו קולגן אני גם נמצא בשימוש. יכולים להיות מתורבת תאי השד ב-3D ​​על ידי assay 3D המשובץ, שבו תאים בתרבית מוטבעת בMatrigel ^2. לחלופין, יכולים להיות מתורבת תאים על ידי 3D על assay העליון, המכונים גם assay כיסוי 3D, אשר הוא עלות האפקטיבית כפי שהוא דורש נפח קטן יותר של Matrigel, ומאפשר ניטור זמן לשגות של הקמת מושבה על ידי הדמיה בניגוד שלב והוא אידיאלי באתר הדמיה ^{2 -3.} 3D על assay העליון נעשה שימוש כדי להגדיר את המתאם בין פנוטיפ acinar ופרופיל ביטוי גני ^7.

תרבות 3D ניתן effectivאיליי משמש להבחנה בין תאים נורמלים ושפירים מקרצינומה פולשנית. תאי שד נורמלים ושפירים בצורת צמיחה נעצרה מבנים מקוטבים עם לומן מוגדר היטב במרכז בMatrigel ואילו תאי קרצינומה פולשנית לגדול בשפע ואקראי ללא סליקה של לומן. E6/E7 הונצח תאים אנושיים אפיתל החלב וקו סלולרי MCF10A, שהוא קו סלולרי הונצח באופן ספונטני שבודד מחולה 36 שנה ישנה עם שינויי fibrocystic, שימש בהצלחה לשחזר את הפנוטיפ שפיר בשד ב3D ^3,8 ושמש מערכת מודל ללמוד את התפקיד המדכא בשעור וגידול של מספר מולקולות ^8,9. יכול להיות מהונדסים לתאים שפירים אלה כדי לתפעל גן (ים) של עניין על ידי ההקדמה של lentivirus / רטרווירוס. אם הגן (ים) של עניין הוא מדכאי סרטן, מציאה shRNA תיווך תוביל לשינוי ממאיר ואילו אם הגן של עניין הוא ביטוי יתר של אונקוגן בתאים שפיריםצריך להראות פנוטיפ ממאיר. בשני המקרים מבני acinar נוצרו ב3D יכולים ללכוד את השינוי הממאיר.

תאים בודדים שפירים מצופים ב3D להתחיל להתרבות וליצור סביב מבנים כדוריים. ביום 5-8 במצטבר כדורי זה של תאים להתמיין לשכבה המקיפה מקוטבת של תאים שנמצאת במגע עם Matrigel, ומסה פנימית של תאים פחות מקוטבים, אשר חוסר מגע עם Matrigel. בימים הקרובים 10-15 התאים הפנימיים יתחילו למות על ידי אפופטוזיס להרכיב לומן ברור. התאים הממאירים יגדלו באקראי לאבד את הקוטביות שלהם. תאים מאוד ממאירים בדרך כלל בצורת הסתעפות מבנים. הבדלים אלה בפנוטיפ יכולים להיות שנתפסו על ידי הדמיה בניגוד שלב זמן לשגות ועל ידי באתר immunostaining עם סמנים מולקולריים רלוונטיים. הסמנים הנפוצים ביותר הם אלפא 6 integrin, סמן קוטביות בסיסי, בשילוב עם סמן התפשטות phospho-היסטון 3 וapoptotסמן ic ביקע caspase-3. זו האחרונה היא חשובה כדי לקבוע אם יש היווצרות לומן במרכז acini, תכונה של תאי שד נורמלים ושפירים. סמני קוטביות וקשר תאי תאים אחרים כוללים GM130, laminin, ERM, E-cadherin. לחלופין יכולות להיות מהונדסות שורות תאי סרטן השד כדי לתפעל את הגן של עניין. במקרה הזה חזרה לצמיחה יותר נעצרה פנוטיפ השפיר יכול לשמש כהקריא להבחין בין פנוטיפ הסרטן.

גם תרבות 3D ניתן להשתמש בזהירות כדי להתוות את מסלולי האיתות מעורבים בשינוי ממאיר ^10-11. שימוש שהוזכר לעיל לקרוא-outs, מעכבים תרופתיים, נוגדני חסימה או חלבונים רקומביננטיים יכול לשמש להיות להצביע באיתות המולקולרית המובילה לשינוי ממאיר. עם מאמצים מתמשכים ממעבדות שונות שניתן לחלץ התאים מ3D לבודד RNA וגם להכין lysates לimmunoblotting אימונוגלובולינnoprecipitation. אסטרטגיות אלה מתוארות בשלבים ובאופן מפורט בפרוטוקול.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

1. הכנת החומרים ותרבות מדיה

1. גורם גדילת הפשרה מופחת (GFR) Matrigel על 4 מעלות CO / נ
2. להתחמם מדיה מלאה לשורת תאים הנדרשת על 37 ° C. MCF10A-ATCC שצוינה בתקשורת; המדיום של HME-Ham-F-12 בתוספת 5% בסרום שור עוברי, 1 מיקרוגרם / מיליליטר הידרוקורטיזון, 5 מיקרוגרם / מיליליטר אינסולין, 10 ng / גורם גדילה באפידרמיס מיליליטר, ו100 רעלן הכולרה ng / מיליליטר; התקשורת של SUM149-Ham-F-12 FBS בתוספת 5%, 2 הידרוקורטיזון מיקרוגרם / מיליליטר ו 5 מיקרוגרם / מיליליטר אינסולין; ומד"א-MB-231-10% FBS-DMEM
3. Precool שקופיות קאמריות 8 היטב על קרח.
4. הכן את מכסה המנוע בתרבית רקמה ואספקה.

2. שלוש ממדי תרבות ב8 היטב שקופיות קאמרית

1. מעיל היטב בכל שקופית 8 היטב עם 40 μl של GFR Matrigel. הוסף את Matrigel במרכז השקופית ולאחר מכן להפיץ באמצעות פיפטה קצה P200. נסה להפיץ בצורה שווה ככל האפשר, תוך הימנעות בועות ופורשים אשר יכול להובילהיווצרות מניסקוס.
2. דגירה השקופיות ב37 מעלות צלזיוס מתחת 5% CO _2. בעוד Matrigel הוא החיזוק, trypsinize התאים, לאסוף ולסובב ב XG 150 בצנטריפוגה תרבית רקמה למשך 4 דקות.
3. ספירת התאים ו לדלל את 12,500 תאים / מיליליטר בתקשורת של הקו הסלולרי בהתאמה מלאה. הוספת GFR Matrigel עד 2% ולהוסיף 400 μl היטב בכל חדר שקופיות Matrigel precoated.
4. דגירה השקופיות בחממת CO _2. תן שינויי מדיה שלמים טריים כל יום 4 עד ^ה 15 ימים.
5. טיפול במעכבים תרופתיים: ללימודי מעכב להוסיף מעכבי מולקולה קטנים לתקשורת להשלים בזמן ציפוי אחרי שינויי תקשורת טריים בתוספת מעכבים כל שלושה ימים בזמן שהולכים וגדלו תאים על GFR Matrigel.
6. טיפול עם חלבון מטוהר:
   1. פלייט התאים הבאים על השלבים 2.1-2.3. אפשר התרבויות לגדול במשך 4 ימים ואחריו starvati סרוםל16 שעות.
   2. ביום 5, טיפול בתאים עם ריכוז מתאים של חלבון מטוהר ב0.1% FBS בתוספת תקשורת לתאים מורעבים בסרום. תן שינוי תקשורת טרי עם חלבון מטוהר אחרי 2 ימים.
   3. ביום 10 להחליף את התקשורת ממוזגת עם תקשורת HME מלאה. אפשר התרבויות לגדול לעוד 5 ימים.
7. מכתים immunofluorescence של מבני acinar גדלו על Matrigel:
   1. הכן paraformaldehyde 2%, 0.5% טריטון X-100 ו100 גליצין מ"מ 1x PBS, pH 7.4. הכן את חיץ immunofluorescence (IF חיץ) שכולל של 1x PBS המכילים 0.1% אלבומין בסרום שור, 0.2% X-100 טריטון, Tween-20 0.05%.
   2. השתמש בקצה פיפטה P200 כדי לשאוב את התקשורת המותנה בזהירות.
   3. תקן את מבני acinar עם 2% paraformaldehyde מוכן טרי בטמפרטורת חדר (RT) עבור 20 דקות.
   4. Permeabilize התאים עם 0.5% טריטון X-100 10 דקות ב 4 ° C.
   5. שטוף את התרבותזמנים של שלושה עם גליצין 100 מ"מ, 10-15 דקות לכל שטיפה.
   6. לחסום את התאים עם 10% נסיוב עזים במאגר אם, בשם בלוק ראשוני, במשך שעה 1 ב RT.
   7. דגירה התרבויות עם עכבר אנטי 20 מיקרוגרם / עז מיליליטר F (ab ') ₂ שבר במאגר בלוק העיקרי ל30 דקות. שלב זה חשוב כדי לחסום את מיני IgG עכבר immunoreactive בMatrigel.
   8. דגירה עם נוגדן ראשוני בפתרון החסימה השני (עכבר אנטי +20 / מיליליטר עז בלוק ראשי מיקרוגרם F (ab ') 2 שבר) O / N ב 4 ° C.
   9. לשטוף שלוש פעמים עם חיץ IF עבור 10-15 דקות כל אחד עם נדנדה עדינה.
   10. דגירה עם נוגדני ניאון מצומדות משניים בIF חיץ 45 דקות.
   11. 3x לשטוף 10 דקות כל אחד עם חיץ IF עם נדנדה עדינה.
   12. הר השקופיות עם מגיב אנטי לדעוך מכיל DAPI לדמיין את הגרעינים.
   13. אפשר השקופיות לייבוש O / N ב RT.
   14. רכישת תמונה: לרכוש תמונות confocal במיל המושבהdsection של תאים שגודל על גבי Matrigel. לקבלת מידע נוסף לרכוש סדרה של סעיפים אופטיים לאורך כל אורכו של מבנה acinar ידי לערום Z.

3. שלוש ממדי תרבות ב2 היטב לשכת שקופיות לimmunoblotting

1. Precool שקופיות קאמריות 2 היטב על קרח. בצע את פעולות 2.1-2.4 דרוג את ריאגנטים לחדר שקופיות למשל מעיל 2 היטב עם 160 μl של Matrigel ולהוסיף 1.6 מיליליטר של התא / Matrigel לערבב היטב בכל השקופית 2 היטב.
2. קציר מבני acinar מMatrigel באמצעות ערכת קצירת תא תרבות 3D זמינה המסחרית בעקבות הוראות יצרן.
3. לדלל את המאגרים לשטוף תא וקציר התא ל1x וprecool עד 4 ° C. כביסה ודחיקה של Matrigel צריכה להתבצע על קרח.
4. שטוף מבני acinar 3x באמצעות החיץ לשטוף תא.
5. לאסוף acini ל15 צינורות צנטריפוגה מיליליטר באמצעות bu קצירת תאffer ואחריו 30 דגירה דקות על כיסא נדנדה ב 4 ° C. מערבבים את ההשעיה גם עם טפטפת 1 מיליליטר. זה ישבור את Matrigel בחתיכות קטנות ולשחרר את רוב התאים במאגר קצירת תא.
6. גלולה התאים ב XG 200 בצנטריפוגה בתרבות. הסר את השכבה הצפה של הידרוג'ל מתאי pelleted עם קצה פיפטה P200.
7. Resuspend lysates בחיץ מדגם SDS מצורף לערכה. יכול לשמש גם מאגר תמוגה ריפה.

4. כימות של הפנוטיפ שד שפיר לעומת ממאיר

1. לגדל תאים בtriplicates עבור כל קבוצת טיפול בעקבות צעדי 2.1-2.4.
2. קח את התמונות בניגוד שלב של מבני acinar מכל הטוב ב5X או 10X רזולוציה באמצעות מיקרוסקופ לעומת שלב מצורף למחלף שקופיות ומחשב. קח את התמונות על ידי העברת השקופיות מפריים אחד למשנהו ובכך מכסים את כולו גם של שקופית תאיים.
3. לספור את המספר הכולל של מבני acinar,מספר acini אחת עגול ושטוח ומספר מבני multiacinar או המבנים גדל באקראי חסר ארגון ועם תהליכי הסתעפות הבוקעים ממנה.
4. לחשב את אחוז המבנים בודדים עגולים acinar השטוח לעומת המבנים ממאירים ועלילה כגרף עמודות. לחשב את המשמעות על ידי מבחן t של הסטודנט.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

תרבות 3D ניתן להשתמש ביעילות כדי לבדל את הפנוטיפ ממאיר של תאי אפיתל שד אנושיים מהשד השפיר. תאים שפירים יחיד מצופים על Matrigel לגדול כמבנים כדוריים מאורגנים שיכול בקלות להיות צילמו כacini שטוח סיבוב בודד במישור אחד באמצעות הדמיה בניגוד שלב. התאים הממאירים בודדים מצופים על Ma...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

שתארנו כאן התרבות תלת ממדים של תאי אפיתל שד על קרום במרתף מחדש ואת השימושיות של מערכת זו כדי להבדיל בין פנוטיפ שפיר בשד לעומת ממאיר. גם מערכת זו יכולה לשמש לתרבות סוגי תאים שונים מרקמות בלוטות אחרות וכבר דווחה כי שימשה בהצלחה לאפיתל ערמונית התרבות, אפיתל הסימפונות, ות...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Growth Factor Reduced Matrigel	BD Biosciences	354230	Avoid repeat freeze thaw
Lab-Tek glass hamber slides 8-well	Thermo Fisher Scientific	177402	Precool on ice
Lab-Tek glass chamber slides 2-well	Thermo Fisher Scientific	177380	Precool on ice
Goat anti mouse F(ab´)2 fragment	Jackson Immunoresearch	115-006-006
Normal goat serum	Jackson Immunoresearch	005-000-121
Fluorescent conjugated Alexa antibodies	Molecular Probes		Please look at molecular probes website
Prolong gold antifade reagent with DAPI	Molecular Probes	P36935
3D Culture Cell Harvesting kit	Trevigen	3448-020-k
Anti-Apha-6-integrin	Fisher Scientific	MAB1378	1:100 dilution for IF
Anti-GM130	BD Biosciences	610822	1:100 dilution for IF
Anti-phospho-histone 3 (Ser10)FITC Conjugated	Fisher Scientific	16-222	1:100 dilution for IF
Anti-Cleaved caspase 3 (Asp 175)	Cell Signaling	9661s	1:50 dilution for IF
Anti-E-cadherin	BD Biosciences	610181	1:200 dilution for IF