Dreidimensional Kulturen: Ein Werkzeug, um Architektur zu studieren Normale acinar gegen maligne Transformation von Brustzellen

Zusammenfassung

Dreidimensionale Kultur von Säugetier-Epithelzellen auf einem rekonstituierten Basalmembran ist eine nützliche Methode, um die in vivo-Architektur der gutartigen Brust rekapitulieren und den malignen Phänotyp von gutartigen Brust Phänotyp zu differenzieren. Wichtiger ist, kann dieses System angewandt werden, um invasive Karzinome in anderen Geweben zu untersuchen.

Zusammenfassung

Invasive Mammakarzinome sind eine Gruppe von malignen epithelialen Tumoren gekennzeichnet durch die Invasion von benachbarten Geweben und Neigung zu metastasieren. Das Zusammenspiel von Signalen zwischen Krebszellen und ihrer Mikroumgebung übt einen starken Einfluss auf das Wachstum von Brustkrebs und biologischen Verhalten ^ein. Die meisten dieser Signale aus der extrazellulären Matrix verloren gehen oder ihre Relevanz under wird, wenn Zellen in einem zweidimensionalen Kultur (2D) als Monolayer gezüchtet. In den letzten Jahren hat dreidimensionale (3D) Kultur auf einer rekonstituierten Basalmembran als Methode der Wahl, um die Gewebearchitektur von benignen und malignen Brustzellen rekapitulieren entstanden. Zellen in 3D gewachsen behalten die wichtigen Signale aus der extrazellulären Matrix und einen physiologisch relevanten ex vivo-System ^2,3. Zu beachten ist, gibt es immer mehr Hinweise darauf, dass Zellen verhalten sich anders, wenn im Vergleich zu 2D in 3D ⁴ gewachsen. 3D-Kulturkann effektiv als ein Mittel, um die malignen Phänotyp von der gutartigen Brust Phänotyp zu differenzieren und für die Untermauerung der zellulären und molekularen Signal verwendet werden ³ beteiligt. Eines der charakteristischen Merkmale von gutartigen epithelialen Zellen ist, dass sie polarisiert sind, so daß die apikale Zytoplasma zu dem Lumen und der basalen Zytoplasma ruht auf der Basalmembran. Diese apikal-basalen Polarität in der invasiven Mammakarzinome, die durch zelluläre Desorganisation und Bildung anastomosierenden und Verzweigung Tubuli, die planlos infiltriert das umgebende Stroma gekennzeichnet sind verloren. Diese histopathologischen Unterschiede zwischen gutartigen Drüse und invasives Karzinom in 3D ^6,7 reproduziert werden. Mit den entsprechenden Lese-outs, wie die Quantifizierung der einzelnen Runde acinar Strukturen oder differentielle Expression von validierten molekulare Marker für Zellproliferation, Apoptose Polarität und in Kombination mit anderen molekularen und zellbiologischen Techniken, 3D-culturE kann ein wichtiges Instrument, um die zellulären Veränderungen während der malignen Transformation und für die Abgrenzung der zuständigen Melde besser zu verstehen ist.

Einleitung

Dreidimensionale Kultur (3D) von Brust-Epithelzellen auf rekonstituierte Basalmembran ist ein wichtiges Modellsystem, um die komplexe Phänotyp und zugehörige Signalisierung der normalen Brust und Brustkrebs ^2,3 studieren. Die funktionelle Einheit der Brust ist der Endkanal lobulären Einheit (TDLU), die von einer kleinen Leitung, die Verzweigungen in Acini besteht. Die Acini sind hochorganisierten Strukturen, zwei Zellschichten, Epithel und Myoepithelzellen, die durch eine Basalmembran ⁵ umgeben sind, besteht. Die prägnantesten Merkmale des normalen Azini sind zelluläre Polarisation, Anbringung an der zugrunde liegenden Basalmembran und spezialisierten Zell-Zell-Kontakten. Dieses komplizierte Organisation ist in invasiven Karzinomen gestört. Die weit verbreiteten 2D Kulturen, in denen Zellen werden als Monoschichten gezüchtet, nicht für die Bildung der Acini zu ermöglichen. Somit wird die Monoschichtkultur fehlen in der Bereitstellung eines Systems, um die komplexen Beziehungen zwischen Epithelzellen zu erfassenin normalen Brust und ihre Deregulierung bei Brustkrebs. Funktionelle monotypic epithelialen Kulturen der Brustzellen wurden in mehreren Laboratorien ^2,3 entwickelt. 3D-Kultur geht das Wachstum von Brust-Zellen auf Matrigel, die eine gelösten Extrakt aus Engelbreth-Holm-Swarm-Maus-Sarkom-Zellen abgeleitet ist und im Handel erhältlich. Andere 3D-Substrate wie Kollagen I werden ebenfalls verwendet. Die Brust-Zellen in 3D mit 3D-Embedded-Test, bei dem Zellen kultiviert in Matrigel ² eingebettet sind kultiviert werden. Alternativ können Zellen durch 3D auf Assay kultiviert werden, die auch als 3D-Overlay-Assay, die kostengünstig ist, wie es erfordert weniger Volumen von Matrigel und erleichtert Zeitraffer-Überwachung der Koloniebildung durch Phasenkontrast-Bildgebung und ist ideal für in situ-Bildgebung ^{2 -3.} Die 3D auf Test ist verwendet worden, um die Korrelation zwischen der acinar Phänotyp und Genexpressionsprofil ⁷ definieren.

3D-Kultur kann effektiver werdenEly verwendet, um normale und benignen Zellen von invasiven Karzinomen zu unterscheiden. Normal-und gutartigen Brustzellen bilden Wachstum verhaftet polarisierten Strukturen mit einem gut definierten Hohlraum in der Mitte auf der Erwägung, dass Matrigel invasiven Karzinomzellen überaus produktiv und planlos wachsen ohne Lichtung des Lumens. E6/E7 verewigt menschlichen Brust Epithelzellen und MCF10A Zelllinie, die eine spontan immortalisierte Zelllinie aus einem 36-jährigen Patienten mit Mastopathie isoliert, wurden erfolgreich eingesetzt, um die gutartige Brust Phänotyp in 3D ^3,8 zurückzuerobern und wurden als serviert wird, ist ein Modellsystem, um die onkogene und Tumor-Suppressor-Funktion von mehreren Molekülen ^8,9 studieren. Diese gutartigen Zellen können verändert werden, um Gen (e) von Interesse durch die Einführung von Lentiviren / Retrovirus manipulieren. Wenn das Gen (e) von Interesse ist ein Tumorsuppressor, werden shRNA-vermittelten Knockdown zu einer malignen Transformation wohin führen, wenn das Gen von Interesse ist ein Onkogen-Überexpression in benignen Zellensollte einen malignen Phänotyp zeigen. In beiden Fällen sind die in 3D gebildet acinar Strukturen können die maligne Transformation zu erfassen.

Gutartige Einzelzellen in 3D vernickelt beginnen sich zu vermehren und bilden runde kugelförmige Strukturen. 5-8 Tage nach dieser sphärische Aggregat von Zellen wird in eine Umgebung polarisierte Schicht von Zellen, die in Kontakt mit dem Matrigel ist, und einer inneren Masse von weniger polarisierten Zellen, die Kontakt mit dem Matrigel fehlt unterscheiden. In den nächsten 10 bis 15 Tagen werden die inneren Zellen werden beginnen, durch Apoptose bildet eine klare Lumen sterben. Die malignen Zellen wachsen ihre Polarität planlos zu verlieren. Sehr bösartige Zellen bilden in der Regel Verzweigungsstrukturen. Diese Unterschiede im Phänotyp kann durch Zeitablauf Phasenkontrast-Bildgebung und durch in situ-Immunfärbung mit relevanten molekularen Marker erfasst werden. Die am häufigsten verwendeten Marker sind alpha 6-Integrin, eine basale Polaritätsmarkierung, in Verbindung mit dem Proliferationsmarker Phospho-Histon-3 und der apoptotic Marker Caspase-3 gespalten. Letzteres ist wichtig, um zu bestimmen, ob die Lumenbildung in der Mitte der Acini einem Merkmal der normalen und benignen Zellen. Andere Polarität und Zell-Zell-Kontakt Marker umfassen GM130, Laminin, ERM, E-Cadherin. Abwechselnd die Brustkrebszelllinien konstruiert werden, um das Gen von Interesse manipulieren. In diesem Fall wird eine Rückkehr zu mehr Wachstum verhaftet kann gutartig Phänotyp verwendet werden, wie ein ausgelesen, um von der Krebs-Phänotyp unterscheiden.

3D-Kultur kann auch verwendet werden, um sorgfältig die Signalwege in der malignen Transformation beteiligt ^10-11 abzugrenzen. Mit Hilfe der oben genannten Lese-outs, pharmakologische Inhibitoren, blockierende Antikörper oder rekombinante Proteine ​​kann auf molekularer Signal die zu malignen Transformation ermitteln werden kann. Mit anhaltenden Bemühungen von verschiedenen Labors ist es möglich, die Zellen zu extrahieren, um aus 3D-RNA isolieren und bereiten auch Lysate für Immunoblotting und Immunnoprecipitation. Diese Strategien werden in einer schrittweisen und detailliert in dem Protokoll beschrieben.

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Protokoll

1. Herstellung von Materialien und Kultur Medien

1. Tauwetter Wachstumsfaktor reduziert (GFR) Matrigel bei 4 ° CO / N.
2. Warm up für komplette Medien erforderlich Zelllinie bei 37 ° C MCF10A-ATCC angegebenen Medien; Die HME-Ham F-12-Medium, ergänzt mit 5% fötalem Rinderserum, 1 ug / ml Hydrocortison, 5 ug / ml Insulin, 10 ng / ml epidermalen Wachstumsfaktor, und 100 ng / ml Cholera-Toxin; Die SUM149-Ham F-12 Medium mit 5% FBS, 2 &mgr; g / ml Hydrocortison und 5 ug / ml Insulin; und MDA-MB-231-10% haben FBS-DMEM
3. Vorkühlung eine 8-Well-Kammer-Folie auf Eis.
4. Bereiten Gewebekultur Kapuze und Zubehör.

2. Dreidimensional Kultur in 8-Well Chamber Slide

1. Mantel jedes Well der 8-Well-Objektträger mit 40 ul GFR Matrigel. Fügen Sie den Matrigel in der Mitte der Folie und dann verteilt mit einem P200 Pipettenspitze. Versuchen Sie, so gleichmäßig wie möglich zu verbreiten, die Vermeidung von Blasen und Überspreizung, die dazu führen könnenMeniskusbildung.
2. Die Objektträger bei 37 ° C unter 5% CO _2. Während die Matrigel verfestigt, trypsinize die Zellen, sammeln und Spin bei 150 xg in Gewebekulturzentrifuge für 4 min.
3. Zählen Sie die Zellen und mit Wasser auf 12.500 Zellen / ml in kompletten Medien der jeweiligen Zelllinie. In GFR Matrigel bis 2%, und fügen Sie 400 ul in jede Vertiefung einer Matrigel schwemmt Kammer Rutsche.
4. Inkubieren Sie die Folien in der CO _2-Inkubator. Geben frisch komplette Medien ändert sich jeden ^4. Tag bis 15 Tage.
5. Behandlung mit pharmakologischen Inhibitoren: Bei Inhibitorstudien hinzuzufügen Kleinmolekül-Inhibitoren der vollständigen Medien zum Zeitpunkt der Beschichtung, gefolgt von frischem Medium wechselt mit den Inhibitoren ergänzt alle drei Tage während der Anzucht der Zellen auf Matrigel GFR.
6. Behandlung mit gereinigtem Protein:
   1. Platte die Zellen folgende Schritte 2.1-2.3. Ermöglichen, dass die Kulturen für 4 Tage, gefolgt von Serum wachsen starvatiauf 16 Stunden.
   2. Am Tag 5, behandeln Sie die Zellen mit entsprechenden Konzentration von gereinigten Protein in 0,1% FBS Medien, um den Serumversorgten Zellen. Geben frisch Medienwechsel mit gereinigtem Protein nach 2 Tagen.
   3. Am Tag 10 ersetzen den konditionierten Medien mit kompletter HME Medien. Lassen Sie die Kulturen für weitere 5 Tage wachsen.
7. Immunfluoreszenzfärbung von auf Matrigel gewachsen acinar Strukturen:
   1. Herstellung von 2% Paraformaldehyd, 0,5% Triton X-100 und 100 mM Glycin in 1 × PBS, pH 7,4. Vorbereitung Immunpuffer (IF-Puffer), der aus 1x PBS, enthaltend 0,1% aufweist Rinderserumalbumin, 0,2% Triton X-100, 0,05% Tween-20.
   2. Verwenden Sie ein P200 Pipettenspitze sorgfältig absaugen konditionierten Medien.
   3. Befestigen Sie die acinar Strukturen mit 2% frisch zubereitet Para bei Raumtemperatur (RT) für 20 min.
   4. Permeabilisierung der Zellen mit 0,5% Triton X-100 für 10 min bei 4 ° C.
   5. Waschen Sie die Kulturs dreimal mit 100 mM Glycin, 10-15 Minuten für jede Waschung.
   6. Blockieren der Zellen mit 10% Ziegenserum in IF-Puffer, genannt Primärblock, für 1 h bei RT.
   7. Die Kulturen mit 20 &mgr; g / ml Ziege-anti-Maus F (ab ') _2-Fragment in der Grundblock-Puffer für 30 min inkubieren. Dieser Schritt ist wichtig, um die Maus-IgG immunreaktive Spezies in dem Matrigel blockieren.
   8. Inkubieren mit primärem Antikörper in der zweiten Blockierlösung (Primärblock +20 ug / ml Ziege-anti-Maus F (ab ') 2-Fragment) O / N bei 4 ° C.
   9. Dreimal für jeweils unter leichtem Schütteln 10-15 min mit IF-Puffer waschen.
   10. Inkubation mit fluoreszierenden konjugierten Sekundärantikörper in IF-Puffer für 45 min.
   11. Wash 3x für jeweils 10 Minuten mit IF-Puffer unter leichtem Schütteln.
   12. Montieren Sie die Folien mit Anti-Fade Reagenz, das DAPI, um die Kerne zu visualisieren.
   13. Lassen Sie die Folien in O / N bei RT trocknen.
   14. Bildaufnahme: Erfassung von konfokalen Bildern in der Kolonie midsection von Zellen auf Matrigel gewachsen. Für weitere Informationen zu erwerben eine Reihe von optischen Abschnitten über die gesamte Länge der Azinus-Struktur durch Z Stapeln.

3. Dreidimensional Kultur in 2-Kammer und Objektträger für Immunoblotting

1. Vorkühlung eine 2-Kammer und Schlitten auf Eis. Befolgen Sie die Schritte 2.1-2.4 Aufstockung der Reagenzien für die 2-Kammer auch Dia zB Mantel mit 160 ul Matrigel und fügen Sie 1,6 ml Zell / Matrigel mischen, um jede Vertiefung der 2-und Rutsche.
2. Ernten Sie die acinar Strukturen aus dem Matrigel Verwendung des kommerziell erhältlichen 3D-Kultur der Zellernte Kit folgenden Anweisungen des Herstellers.
3. Verdünne die Zellen zu waschen und Zellernte Puffer 1x und Vorkühlung auf 4 ° C Waschen und Verdrängen von Matrigel sollten auf Eis durchgeführt werden.
4. 3x mit dem Zellwaschpuffer waschen acinar Strukturen.
5. Sammeln Sie die Acini in 15 ml Zentrifugenröhrchen mit Zellernte buffer durch 30 min Inkubation auf einem Schüttler bei 4 ° C, gefolgt Mix Suspension auch mit einer 1 ml Pipette. Dadurch wird die Matrigel in kleine Stücke brechen und die meisten der Zellen in der Zellernte-Puffer.
6. Pelletieren Sie die Zellen bei 200 × g in einer Kultur zentrifugiert. Entfernen Sie die Schwimmschicht aus Hydrogel aus den pelletierten Zellen mit einem P200 Pipettenspitze.
7. Resuspendieren der Lysate in SDS-Probenpuffer mit dem Kit bei. RIPA Lysepuffer können ebenfalls verwendet werden.

4. Quantifizierung von malignen vs Gutartige Brust Phänotyp

1. Wachsen Zellen in dreifacher Ausführung für jede Behandlung Satz folgende Schritte 2.1-2.4.
2. Nehmen Phasenkontrastbilder von acinar Strukturen aus jeder Vertiefung bei 5X oder 10X Auflösung mit einem Phasenkontrastmikroskop zu einer Folie Schieber und einen Computer angeschlossen ist. Nehmen die Bilder durch Bewegen des Schiebers von einem Rahmen zum anderen und somit über die gesamte Vertiefung der Kammerobjektträger.
3. Zählen Sie die Anzahl der acinar Strukturen,die Anzahl der einzelnen runden flachen Acini und der Anzahl der multiacinar Strukturen oder planlos gewachsenen Strukturen fehlen Organisation und Prozesse mit Verzweigung von ihr ausgeht.
4. Berechnen Sie den prozentualen Anteil der einzelnen runden flachen Strukturen acinar vs malignen Strukturen und Grundstück als Säulendiagramm. Berechnen Sie die Bedeutung von Student-t-Test.

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Ergebnisse

3D Kultur effektiv zur malignen Phänotyp von menschlichen Brustepithelzellen von gutartigen Brust unterscheiden. Einzel benignen Zellen auf Matrigel vergoldet wachsen, wie organisiert kugelförmige Gebilde, die leicht als einzige runde, flache Acini in einer Ebene mit Phasenkontrast-Abbildung abgebildet werden kann. Die einzelnen malignen Zellen auf Matrigel vergoldet wachsen planlos, zeigen sehr hohen Brechungsindex und sind in einer Ebene schwer zu Bild. Wie in Fig. 1 gezeigt, ist die benigne HME und...

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Diskussion

Wir haben hier die dreidimensionale Kultur von Brustepithelzellen auf einer rekonstituierten Basalmembran und die Nützlichkeit des Systems, zwischen bösartigen gegen gutartige Brust Phänotyp differen beschrieben. Dieses System kann auch zur Bildung verschiedener Zelltypen anderer Drüsengewebe verwendet werden, und es wurde berichtet, um erfolgreich zu Kultur Prostata-Epithelzellen, bronchiale Epithelzellen und Schilddrüsen-Epithelzellen verwendet haben, um nur einige zu nennen ^12-14. Die Bedeutung der 3D...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Growth Factor Reduced Matrigel	BD Biosciences	354230	Avoid repeat freeze thaw
Lab-Tek glass hamber slides 8-well	Thermo Fisher Scientific	177402	Precool on ice
Lab-Tek glass chamber slides 2-well	Thermo Fisher Scientific	177380	Precool on ice
Goat anti mouse F(ab´)2 fragment	Jackson Immunoresearch	115-006-006
Normal goat serum	Jackson Immunoresearch	005-000-121
Fluorescent conjugated Alexa antibodies	Molecular Probes		Please look at molecular probes website
Prolong gold antifade reagent with DAPI	Molecular Probes	P36935
3D Culture Cell Harvesting kit	Trevigen	3448-020-k
Anti-Apha-6-integrin	Fisher Scientific	MAB1378	1:100 dilution for IF
Anti-GM130	BD Biosciences	610822	1:100 dilution for IF
Anti-phospho-histone 3 (Ser10)FITC Conjugated	Fisher Scientific	16-222	1:100 dilution for IF
Anti-Cleaved caspase 3 (Asp 175)	Cell Signaling	9661s	1:50 dilution for IF
Anti-E-cadherin	BD Biosciences	610181	1:200 dilution for IF