세 가지 차원 문화 : 유방 세포의 악성 변형 대 일반 선포 건축을 연구하는 도구

요약

재구성 기저막에 유방 상피 세포의 3 차원 배양 양성 유방의 생체 구조를 요점을 되풀이하고, 양성 유방 표현형에서 악성 표현형을 구별 할 수있는 유용한 방법입니다. 중요한 것은,이 시스템은 다른 조직에서 침습성 암 연구에 적용 할 수있다.

초록

침윤성 암은 전이에 인접 조직과 성향의 침입을 특징으로 악성 상피 종양의 그룹입니다. 암세포 및 그들의 미시 사이에서 신호의 상호 작용은 유방암의 성장 및 생물학적 행동 ^하나에 강력한 영향을 미친다. 그러나, 세포 외 기질 (extracellular matrix)에서이 신호의 대부분은 손실되거나 세포가 단층으로 두 가지 차원의 문화 (2D)에서 재배 할 때의 관련성은 understudied 아르됩니다. 최근, 재구성 기저막의 입체 (3D) 문화는 양성 및 악성 유방 세포의 조직 구조를 다시 요약 선택의 방법으로 떠오르고있다. 3D에서 자란 세포는 세포 외 기질에서 중요한 단서를 유지하고 생리학 관련 생체 시스템 ^2,3을 제공합니다. 참고로, 제 ^4에 비해 3D로 성장하면 세포가 다르게 행동 것을 제안 성장하는 증거가있다. 3D 문화효과적으로 ³ 개인 양성 유방 표현형에서 악성 표현형을 구별하는 수단으로하고 세포 및 분자 시그널링을 뒷받침 위해 사용될 수있다. 양성 상피 세포의 구별되는 특징 중 하나는 꼭대기 세포질은 루멘으로하고 기초 세포질이 기저막에 달려있다 그래서 그들은 편광되는 것입니다. 이 apico - 기초 극성은 세포의 해체와 우연히 주변의 기질에 침투 세관을 anastomosing 및 분기의 형성을 특징으로 침윤성 암에 손실됩니다. 양성 선 및 침윤 암 사이의 이러한 조직 병리학 적 차이는 3D ^6,7에서 재현 할 수 있습니다. 다른 분자 및 세포 생물학 기술, 3 차원의 cultur와 함께 세포 증식, 극성 및 세포 사멸에 대한 검증 분자 마커의 발현을 차등 한 라운드 선포 구조의 정량과 같은 적절한 읽기 아웃을하거나 사용전자 나은 악성 변환시와 책임 신호를 서술의 세포 변화를 이해하는 중요한 도구를 제공 할 수 있습니다.

서문

재구성 기저막에 유방 상피 세포의 3 차원 배양 (3D)는 복잡한 표현형 정상 유방과 유방암 ^2,3의 관련 신호를 연구하는 중요한 모델 시스템입니다. 유방의 기능 단위는 꽈리에있는 나뭇 가지의 작은 관으로 구성 터미널 덕트 소엽 단위 (TDLU)입니다. 선포 세포는 기저막 ^(5)에 의해 둘러싸여있다 두 세포층, 상피 및 근 상피 세포로 구성된 매우 조직 구조이다. 일반 선포 세포의 가장 두드러진 특징은 휴대 편광, 기본 기저막에 부착 전문 세포 - 세포 연락처입니다. 이 복잡​​한 조직은 침략 암에 중단됩니다. 세포는 단층으로 재배되는 널리 사용되는 2 차원의 문화, 선포 세포의 형성을 허용하지 않습니다. 따라서, 단층 배양 상피 세포 간의 복잡한 관계를 캡처하는 시스템을 제공 부족정상 유방과 유방암에서의 규제 완화. 유방 세포의 기능 monotypic 상피 문화는 여러 실험실 ^2,3에서 개발되었다. 3D 배양 Engelbreth-홀름 - 스웜 마우스 육종 세포 유래 가용화 엑기스이며 시판되고 리겔에 유방암 세포의 성장을 포함한다. 콜라겐 같은 다른 3D 하층은 I도 사용된다. 유방 세포는 세포가 매트 ^리겔이에 매립 배양 3D 임베디드 분석법에 의해 3 차원으로 배양 할 수있다. 또한, 세포는 또한 리겔의 적은 양을 필요로하고, 위상 콘트라스트 이미지에 의해 콜로니 형성의 시간 경과 감시를 용이하게하고 현장 영상 ^2에 이상적입니다로 비용 효과적인 3D 오버레이 분석,라고, 최고 분석에 3D로 배양 될 수있다 ^-3. 베스트 분석에 3D는 선포 표현형 및 유전자 발현 프로파일 ⁽⁷⁾ 사이의 상호 관계를 정의하는 데 사용되었다.

3D 문화 effectiv 할 수 있습니다엘리 침윤 암에서 정상과 양성 세포를 구별하는 데 사용됩니다. 정상 및 양성 유방 세포가 침윤 암 세포가 루멘없이 청소와 다산과 우연히 성장하는 반면 성장이 리겔의 중심에있는 잘 정의 된 루멘 편파 구조를 체포 형성한다. E6/E7은 인간의 유방 상피 세포와 섬유 낭종 성 변화와 36 세 환자에서 분리 된 자발적 불후의 세포주가 성공적으로 3D ^3.8에 양성 유방 표현형을 탈환하는 데 사용되었습니다 및 지낸입니다 MCF10A 세포주를, 불후의 여러 분자 ^8,9의 종양 및 종양 억제 기능을 연구하기위한 모델 시스템. 이러한 양성 세포는 렌티 바이러스 / 레트로 바이러스의 도입으로 그 유전자 (들)을 조작 할 수 있도록 설계 할 수있다. 관심의 유전자 (들)은 종양 억제 경우 그 유전자가 양성 세포의 발암 유전자 과발현 경우, shRNA를 매개 최저는 반면 악성 변화로 이어질 것악성 표현형을 표시해야합니다. 두 경우 모두 3D로 형성된 선포 구조는 악성 변화를 캡처 할 수 있습니다.

3D로 도금 양성 단일 세포는 구형 구조를 증식 원형 형성하기 시작합니다. 일 5-8 셀이 구형 집합체 마트 리겔과 접촉하는 세포의 주변 편광 층 및 마트 리겔과 접촉이없는 적은 편광 세포의 내측 질량으로 분화한다. 다음 10-15 일에서 내부 세포 사멸이 명확한 루멘을 형성하여 죽기 시작합니다. 악성 세포는 우연히 자신의 극성을 잃고 성장할 것입니다. 고도의 악성 세포는 일반적으로 구조를 분기 형성한다. 표현형의 이러한 차이는 시간 경과 위상 콘트라스트 이미지에 의해 현장에서 관련 분자 마커로 면역 염색에 의해 캡처 할 수 있습니다. 가장 일반적으로 사용되는 마커는 증식 마커 포스 포 히스톤 3 apoptot와 ​​조합하여, 알파 -6 - 인테그린, 기저 극성 마커 아르IC 마커는 카스파 제 3을 절단. 후자 꽈리의 중심 정상적인 양성 유방 세포의 기능에 루멘을 형성가 있는지를 결정하는 것이 중요하다. 다른 극성과 세포 - 세포 접촉 마커 GM130, 라미닌, ERM, E-cadherin의 (가) 있습니다. 교대 유방암 세포주 관심 유전자를 조작하기 위하여 설계 될 수있다. 체포 더 성장이 경우 복귀 양성 표현형으로 사용할 수 암 표현형을 구별 할 독출.

3D 문화는 신중 악성 변형 ^10-11에 관련된 신호 전달 경로를 묘사하는 데 사용할 수 있습니다. 사용하여 위의 읽기 아웃, 약물 억제제, 차단 항체 나 재조합 단백질을 언급하는 것은 악성 변화를 선도하는 분자 신호에 정확하게 할 수 있습니다. 여러 실험실에서 지속적인 노력으로는 RNA를 분리하고 또한 면역 블롯 및 면역에 해물을 준비하는 차원에서 세포를 추출 할 수noprecipitation. 이러한 전략은 프로토콜 단계적 상세한 방법에 설명되어 있습니다.

프로토콜

1. 재료의 준비 및 문화 미디어

1. 4 ° CO / N.에 (GFR) 리겔 감소 해동 성장 인자
2. 37 ° C.에 필요한 세포주에 대한 완벽한 미디어를 따뜻하게 MCF10A-ATCC는 미디어를 지정; HME-햄 F-12 배지는 5 % 소 태아 혈청, 1 ㎍ / ㎖의 하이드로 코르티손, 5 ㎍ / ㎖의 인슐린, 10 ng의 / ㎖의 표피 성장 인자, 및 100 NG / ㎖ 콜레라 독소로 보충; 5 % FBS, 2 ㎍ / ㎖의 하이드로 코티손, 5 ㎍ / ml의 인슐린 보충 SUM149 햄의 F-12 미디어; 및 MDA-MB-231-10% FBS-DMEM
3. 얼음에 8 잘 챔버 슬라이드를 Precool.
4. 조직 문화 후드 및 용품을 준비합니다.

8 잘 회의소 슬라이드 2. 3 차원 문화

1. 코트 각 GFR 마트 리젤의 40 μL와 8 아니라 슬라이드의 잘. 슬라이드의 중앙에 리겔을 추가 한 다음 P200 피펫 팁을 사용하여 확산. 거품을 피하고으로 이어질 수있는 overspreading, 가능한 한 균일 확산을 시도메 니스 커스 (meniscus)를 형성.
2. 5 % CO _2에서 37 ° C에서 슬라이드를 품어. 리겔이 응고하는 동안, 세포를 Trypsinize 수집하고 4 분 동안 조직 문화 원심 분리기 150 XG에 스핀.
3. 세포를 계산하고 각각의 세포주의 완전한 미디어에 12,500 세포 / ml로 희석. 2 %에 GFR 마트 리겔을 추가하고 리겔 프리 코트 챔버 슬라이드의 각 웰에 400 μl를 추가합니다.
4. CO ₂ 배양기에서 슬라이드를 품어. 십오일 때까지 매 4 ^일째 신선한 전체 미디어 변경을 제공합니다.
5. GFR 마트 리겔에 세포 성장 동안 억제제의 연구는 3 일마다 억제제 보충 된 신선한 미디어 변화이어서 도금시 완전한 미디어 소분자 억제제를 추가 들어 : 약리학 억제제로 처리.
6. 정제 된 단백질과 치료 :
   1. 셀 플레이트 다음은 2.1-2.3 단계를 반복합니다. 문화가 혈청 starvati 다음 4 일 동안 성장 할 수 있도록 허용16 시간 동안에.
   2. 5 일에, FBS는 혈청에 굶주린 세포에 용지를 보충 0.1 %에서 정제 된 단백질의 적절한 농도로 세포를 처리합니다. 이일 후 정제 된 단백질과 신선한 미디어 변화를 준다.
   3. 10 일째에 완전한 HME 매체와 에어컨 미디어를 교체합니다. 문화가 다른 5 일 동안 성장 할 수 있습니다.
7. 리겔에 성장 선포 구조의 면역 형광 염색 :
   1. 2 % 파라 포름 알데히드, 0.5 % 트리톤 X-100 및 1X PBS, pH 7.4의 100 mM의 글리신을 준비합니다. 0.1 % 소 혈청 알부민, 0.2 % 트리톤 X-100, 0.05 % 트윈 -20을 함유하는 1X PBS로 구성 면역 버퍼 (버퍼 IF)를 준비한다.
   2. 주의 깊게 에어컨 미디어를 대기음하는 P200 피펫 팁을 사용합니다.
   3. 20 분 동안 실온 (RT)에서 2 % 갓 준비 파라 포름 알데히드로 선포 구조를 수정.
   4. 4 ℃에서 10 분 동안 0.5 % 트리톤 X-100 세포를 투과
   5. 문화를 씻으의 세 100 mM의 글리신, 각각의 세척을위한 10 ~ 15 분 타임스.
   6. 실온에서 1 시간 동안 기본 블록 호출하면 버퍼의 10 % 염소 혈청과 세포를 차단합니다.
   7. 20 ㎍ / ㎖의 염소 항 마우스 F (AB ') 30 분 기본 블록 _{버퍼에있는} 조각과 문화를 품다. 이 단계는 매트 리겔에서 면역 마우스 IgG의 종을 차단하는 것이 중요하다.
   8. 두 번째 차단 솔루션 1 차 항체와 부화 4 ° C에서 (기본 블록 20 ㎍ / ㎖의 염소 항 마우스 F (ab ') 2 단편) O / N
   9. 15 분 부드러운 요동과 각 IF 버퍼로 3 회 씻는다.
   10. 45 분 IF 버퍼에 형광 복합 이차 항체와 부화.
   11. 10 분 동안 세척 배 부드러운 요동과 IF 버퍼 각.
   12. 핵을 시각화하기 위해 DAPI를 포함하는 안티 - 페이드 시약과 슬라이드를 장착합니다.
   13. 슬라이드는 실온에서 O / N을 건조하도록 허용합니다.
   14. 이미지 수집 : 식민지 마일의 공 촛점 이미지 획득리겔의 상단에 성장 세포의 dsection. 자세한 내용은 Z의 적층하여 포상 구조의 전체 길이에 걸쳐 광 부분의 시리즈를 얻기.

3. 면역 블롯 2 잘 회의소 슬라이드에서 3 차원 문화

1. 얼음이 잘 챔버 슬라이드를 Precool. 단계에 따라 2.1-2.4 리겔의 160 μL와 2 - 잘 챔버 슬라이드, 예를 들면 코트 시약을 확장 셀 / 리겔의 1.6 ml의 2 - 웰 슬라이드의 각 웰에 혼합을 추가합니다.
2. 제조업체의 지침에 따라 상업적으로 이용 가능한 3D 배양 세포 수확 키트를 사용하여 리겔에서 선포 구조를 수확.
3. 배에서 4 ° C.에 precool하는 세포 세척 및 세포 수확 버퍼를 희석 리겔의 세척 및 쫓아 내기 얼음에 수행되어야한다.
4. 셀 세척 버퍼를 사용하여 3 배 선포 구조를 씻으십시오.
5. 세포 수확 BU를​​ 사용하여 15 ㎖의 원심 분리기 튜브로 선포 세포를 수집ffer 4 ℃에서 로커에 30 분 인큐베이션 1 ㎖ 피펫 잘 현탁액을 섞는다. 이 작은 조각의 리겔을 중단하고 세포 수확 버퍼에있는 세포의 대부분을 해제합니다.
6. 문화 원심 분리기 200 XG에서 세포 펠렛. P200 피펫 팁과 펠렛 세포에서 하이드로 겔의 떠있는 레이어를 제거합니다.
7. 키트 구비 SDS 샘플 버퍼 용 해물을 재현 탁. RIPA 용해 완충액을 사용할 수도있다.

악성 대 양성 유방 표현형의 4. 정량

1. 단계 2.1-2.4 다음 각 처리 세트에 대한 삼중의 세포를 성장.
2. 5X 또는 슬라이드 시프터 및 컴퓨터에 연결된 위상차 현미경을 이용하여 10 배의 해상도를 각 웰로부터 포상 구조의 위상차 이미지를 가라. 한 프레임에서 다른 프레임으로 슬라이드를 이동하고, 따라서 챔버 슬라이드의 전체를 잘 커버하여 이미지를 가져 가라.
3. 포상 구조의 전체 개수를 세어한 라운드 플랫 선포 세포와 multiacinar 구조 나 조직을 부족 우연히 성장 구조의 수와 그것에서 나오는 분기 프로세스와 수.
4. 한 라운드 플랫 선포 구조에 대 악성 구조의 비율 및 열 그래프로 플롯을 계산합니다. 학생의 T-테스트에서 중요성을 계산합니다.

결과

3D 배양 효과적으로 양성 유방에서 인간 유방 상피 세포의 악성 표현형을 구별 할 수있다. 리겔에 도금 단일 양성 세포는 쉽게 위상 콘트라스트 이미지를 사용하여 하나의 평면에 하나의 둥근 플랫 선포 세포로 이미지화 할 수있는 조직 구형 구조로 성장한다. 마트 리겔에 도금 한 악성 세포가 우연히 성장 매우 높은 굴절률을 표시 한 평면에서 이미지 어렵다. 도 1에 도시 된 바와 같?...

토론

우리는 여기에서 재구성 기저막에 유방 상피 세포의 세 가지 차원의 문화와 악성 대 양성 유방 표현형을 구별하는이 시스템의 유용성을 설명했다. 이 시스템은 또한 다른 선의 조직 배양에서 다른 세포 유형에 이용 될 수 있고, 성공적으로 ^12-14 몇 ^{가지 이름을} 배양 전립선 상피 기관지 상피 및 갑상선 상피 세포에 사용 된 것으로보고되었다. 3D 배양의 중요성은 생리 학적으로 관?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Growth Factor Reduced Matrigel	BD Biosciences	354230	Avoid repeat freeze thaw
Lab-Tek glass hamber slides 8-well	Thermo Fisher Scientific	177402	Precool on ice
Lab-Tek glass chamber slides 2-well	Thermo Fisher Scientific	177380	Precool on ice
Goat anti mouse F(ab´)2 fragment	Jackson Immunoresearch	115-006-006
Normal goat serum	Jackson Immunoresearch	005-000-121
Fluorescent conjugated Alexa antibodies	Molecular Probes		Please look at molecular probes website
Prolong gold antifade reagent with DAPI	Molecular Probes	P36935
3D Culture Cell Harvesting kit	Trevigen	3448-020-k
Anti-Apha-6-integrin	Fisher Scientific	MAB1378	1:100 dilution for IF
Anti-GM130	BD Biosciences	610822	1:100 dilution for IF
Anti-phospho-histone 3 (Ser10)FITC Conjugated	Fisher Scientific	16-222	1:100 dilution for IF
Anti-Cleaved caspase 3 (Asp 175)	Cell Signaling	9661s	1:50 dilution for IF
Anti-E-cadherin	BD Biosciences	610181	1:200 dilution for IF