Un método eficaz para Cuantitativo, Análisis de celda única de la cromatina modificación y Arquitectura Nuclear en Todo el montaje en Óvulos<em&gt; Arabidopsis</em

Resumen

Ofrecemos aquí un protocolo eficiente y confiable para la inmunotinción, hibridación in situ fluorescente, la tinción de ADN seguido por cuantitativos, imágenes de alta resolución en óvulos de Arabidopsis thaliana todo el montaje. Este método fue utilizado con éxito para analizar modificaciones de la cromatina nuclear y de la arquitectura.

Resumen

En las plantas con flores, la transición destino de la célula somática-a-reproductiva está marcada por la especificación de las células madre de esporas (CML) en los órganos florales de la planta adulta. El SMC macho (célula madre megaspore, MMC) diferencia en el primordio óvulo y sufre meiosis. El megáspora haploide seleccionado a continuación, se somete a la mitosis para formar el gametofito multicelular hembra, lo que dará lugar a los gametos, la célula del huevo y célula central, junto con las células accesorias. La accesibilidad limitada de la MMC, meiocyte y gametofito femenino dentro del óvulo es técnicamente difícil para citológico y citogenético analiza a nivel de células individuales. En particular, la inmunodetección directa o indirecta de los epítopos celulares o nucleares se deteriora por la falta de penetración de los reactivos dentro de la imagen de células de plantas y de una sola célula es arrendada por la falta de claridad óptica en todo el montaje en los tejidos.

Por lo tanto, hemos desarrollado un método eficiente para analizar los nuclorganización del oído y la modificación de la cromatina en alta resolución de una de las células de todo el montaje óvulos Arabidopsis embebidos. Se basa en la disección y la incrustación de óvulos fijos en una capa delgada de gel de acrilamida en un portaobjetos de microscopio. Los óvulos incrustados son sometidos a los tratamientos químicos y enzimáticos destinados a mejorar la claridad del tejido y la permeabilidad a los reactivos de inmunotinción. Esos tratamientos preservar la organización, de ADN y de proteínas epítopos celulares y la cromatina. Las muestras se pueden utilizar para diferentes análisis citológicos aguas abajo, incluyendo la inmunotinción de la cromatina, hibridación in situ fluorescente (FISH), y la tinción de ADN para el análisis de la heterocromatina. Microscopía láser confocal (CLSM) de imágenes con alta resolución, seguida de reconstrucción 3D permite mediciones cuantitativas en la resolución de una sola célula.

Introducción

En las plantas con flores, el establecimiento de linajes reproductiva comienza con la diferenciación de las SMC, MMC hembra y de células madre de microsporas masculino. El MMC se desarrolla a partir de una célula nucellar sub-epidérmica en el extremo distal del primordio óvulo y la célula madre de microsporas se desarrolla a partir de tejido esporógena en la antera lóculo, que se encuentran en el interior de los órganos florales ^1. CML sufren meiosis para producir esporas haploides, que luego dan lugar a los gametofitos sobre la mitosis. El gametofito femenino o saco embrionario, se compone de un óvulo, una célula central, dos y tres sinérgidas antípodas. El gametofito masculino, o el polen, se compone de una célula vegetal y dos espermatozoides. Mientras que el gametofito masculino sigue siendo un objeto de estudio-de-relativamente accesible, el gametofito femenino está incrustado dentro del óvulo, en sí encerrado en el carpelo flor, y por lo tanto plantea retos específicos para los análisis moleculares y citológicos. Recientemente, sin embargo, con ayuda de lásermicrodisección ofrece una solución elegante que permite transcriptómica analiza en el MMC y células gametofítico femeninos ^2-4. Además de la expresión del gen candidato análisis, usando, por ejemplo ARN hibridación in situ o ensayos de gen reportero, análisis citológicos permite la investigación de la dinámica de los componentes celulares endógenos utilizando tinción celular directo específico o inmunotinción indirecta. En particular, la tinción citogenético mediante FISH y la tinción de ADN, junto con la inmunotinción de modificaciones de la cromatina o componentes de la cromatina son los enfoques centrales para dilucidar la dinámica de la cromatina y la organización nuclear de Arabidopsis ^5. Habitualmente, la meiosis implica dinámica de los cromosomas específicos que ha sido bien investigados en planta macho meiocytes ^6,7; además de gran escala, la reorganización de la cromatina de células específicos, reflejando probablemente la reprogramación epigenética dinámica ha sido descrita durante el desarrollo del polen ^8-10. Por el contrario, debidoa la relativa inaccesibilidad de la meiocyte hembra y gametofito, estas investigaciones siguen siendo técnicamente difíciles de aplicar, y a menudo requieren la disección de seccionamiento o manual y la digestión enzimática (ver más abajo). Además, la frecuente falta de claridad óptica en todo el montaje es un obstáculo para imágenes de alta resolución de las células reproductoras en óvulos intactos.

Un método clásico para el análisis citológico de organización de los cromosomas en óvulos de todo el montaje utiliza la tinción de Feulgen ^11-13. Se trata de la hidrólisis ácida (usando ácido hipocloroso) del ADN que resulta en desnaturalización de la proteína y por lo tanto causa la destrucción de la estructura de la cromatina. Alternativamente, organización de los cromosomas en meiocytes femeninas y células gametofítico se puede observar mediante DAPI y la inmunotinción de las secciones semi-delgadas o sacos embrionarios disecados y MMC (por ejemplo, ver ^14-18). Claramente, sin embargo, la disección manual y de corte pueden ser mano de obra intensiva yimpide en el análisis cualitativo y cuantitativo de un gran número de epítopos de la cromatina.

Aquí les ofrecemos un protocolo eficiente para preparar un gran número de óvulos Arabidopsis adecuados para una variedad de tinción citológica aguas abajo en todo el montaje. En breve, los brotes de flor se incuban en una solución de fijación, las filas de óvulos se disecan de la carpelo y embebidos en acrilamida en la diapositiva como se hizo para meiocitos polen ^19,20. Los óvulos incrustados se borrarán y se fijaron en metanol, etanol, y xileno antes de la digestión de la pared celular y permeabilización. Se discuten las posibles variaciones de estos pasos. Las muestras luego se pueden utilizar para la tinción de ADN, inmunotinción, y FISH. El modo de preparación es eficiente y permite paralelo experimental (hasta 16 diapositivas se pueden preparar en un día diferente para el análisis de aguas abajo). Los tratamientos descritos permiten señales homogéneas en todo el montaje e histológico, celular bien conservados,y la organización nuclear en las células reproductoras y las células circundantes que se benefician nucelar comparaciones cualitativas y cuantitativas entre los tipos de células. Calibrado, imágenes basadas en CLSM de alta resolución seguida de reconstrucción en 3 dimensiones permite mediciones cuantitativas significativas de señales fluorescentes. Hemos utilizado con éxito este procedimiento para analizar la dinámica de la cromatina en el MMC diferenciador ²¹ y desarrollando gametofito femenino ^22; Presentamos aquí los resultados representativos de análisis heterocromatina, inmunotinción cromatina, la inmunotinción GFP y FISH en todo el montaje óvulos. Además, creemos que nuestro protocolo será adecuado para otros tejidos y especies de plantas.

Protocolo

El procedimiento se describe en el flujo de trabajo en la Figura 1, y la configuración para la disección y la incrustación de tejidos se presentan en la Figura 2.

1. Fijación del tejido

1. Recoger 20-30 carpelos en un tubo de microcentrífuga que contiene recién hecho tampón fijador BVO en hielo.
2. Fijar el tejido 30 min con agitación suave a temperatura ambiente.
3. Haga girar los tubos que contienen los carpelos en fijador en una microcentrífuga de sobremesa 1 min a 400 x g.
4. Retire con cuidado el tampón fijador y agregar 1 ml de PBT, coloque los tubos en hielo.

2. Disección e incrustación

1. Preparar cinco tubos Eppendorf con cada 200 l de una recién hecha, 5% de mezcla de acrilamida.
2. Preparar cinco portaobjetos Superfrost pre-limpiados con etanol al 70% y se marcaron con un lápiz.
3. Descongelar una alícuota de 20% y 20% de APS NaPS cada uno, en el hielo.
4. Tome 4-5 carpelos con una punta de corte final, el lugarsobre una lámina limpia, eliminar el exceso de líquido.
5. Haga cortes longitudinales con una aguja fina y separar las paredes carpelo para liberar filas de óvulos como se muestra la Figura 2, evitar el secado, cubriendo con PBS (no más de 10 l).
6. Añadir rápidamente y mezclar 12 NaPS mu l, 12 APS mu l con una alícuota de 200 l de mezcla de acrilamida.
7. Añadir 30 l de la acrilamida activado en los óvulos disecados.
8. Tapar con un cubreobjetos mm 20 x 20, por no polimeriza a temperatura ambiente, 45 a 60 min.
9. Retire el cubreobjetos usando una cuchilla de afeitar. En esta etapa, las muestras se pueden mantener durante la noche a 4 ° C en un vaso de Coplin que contenía PBS.

3. Procesamiento de tejido

NOTA: Todos los pasos, excepto 3.2.1, 3.2.3, 3.3.2 y 3.4.3 se llevan a cabo en frascos de Coplin con 80 ml de solución bajo el capó química a temperatura ambiente. Las diapositivas se transfieren con una pinza de punta plana.

1. Clarificación de tejidos yfijación:
   1. Incubar 5 min en metanol.
   2. Incubar 5 min en etanol.
   3. Incubar 30 min en etanol: xileno (1:1).
   4. Incubar 5 min en etanol.
   5. Incubar 5 min en metanol.
   6. Incubar 15 min en metanol y PBT (01:01), complementado con 2,5% de formaldehído.
   7. Enjuague 2 x 10 min en PBT. En esta etapa, las diapositivas se pueden mantener durante la noche a 4 ° C.
2. La digestión de la pared celular:
   1. Descongelar una alícuota de la mezcla de la digestión de la pared celular en hielo.
   2. Tome un portaobjetos del frasco de Coplin, drenar el exceso de líquido, colocándolo en posición vertical sobre una toalla de papel.
   3. Añadir 100 l de mezcla de digestión de la pared celular sobre la almohadilla de acrilamida y cubrir con un cubreobjetos 23 mm x 46. Repita el procedimiento para las otras diapositivas. Incubar durante 2 horas a 37 ° C en una cámara húmeda (se describe en Materiales).
   4. Lavar el portaobjetos 2 x 5 min en PBT.
3. RNasa A de tratamiento:
   1. Tome un portaobjetos del frasco de Coplin, drene ªe exceso de líquido como antes.
   2. Incubar cada portaobjetos con 100 l de ARNasa A a 100 g / ml en PBS con 1% de Tween-20 durante 1 hora a 37 ° C en una cámara húmeda.
   3. Lavar los portaobjetos durante 2 x 5 min en PBT.
4. Posteriores a la fijación y permeabilización:
   1. Post-fijar durante 20 minutos en recién hecha PBT-F.
   2. Enjuagar los portaobjetos durante 10 minutos en PBT.
   3. Permeabilizar durante 2 horas en PBS con 2% de Tween-20 a 4 ° C.
   4. Enjuagar los portaobjetos durante 2 x 5 min en PBT.

4. Inmunotinción

NOTA: Para este paso, la concentración óptima del anticuerpo primario tiene que ser probado mediante el uso de diferentes diluciones (1:200, 1:500, 1:1000) de los anticuerpos.

1. Incubar cada portaobjetos con 100 l de anticuerpo primario diluido en PBS con 0,2% de Tween-20 durante 12-24 horas a 4 ° C.
2. Lavar los portaobjetos en PBT durante 2-4 horas a temperatura ambiente bajo agitación suave.
3. Aplicar la1:200 de anticuerpo secundario en PBS + 0,2% de Tween-20 durante 24 horas a 4 ° C.
4. Lavar los portaobjetos en PBT durante 1 hora a temperatura ambiente bajo agitación suave.
5. Contratinción con 10 g / ml de yoduro de propidio en PBS durante 15 min, luego enjuague 15 min en PBS bajo agitación suave, a temperatura ambiente.
6. Monte en anti-fading medio de montaje líquido suplementado con 10 mg / ml de yoduro de propidio. Deje que el medio de montaje se endurezca durante 1 hora antes de la adquisición de imágenes por CLSM.

5. Imagen Cuantitativa

1. La adquisición de imágenes:
   1. Adquirir imágenes de alta resolución utilizando CLSM, idealmente utilizando un modo de escaneo de resonancia, lo que permite una mejor conservación de las señales fluorescentes más prolongado de formación de imágenes ^23, y una lente de inmersión 63X glicerol.
   2. Compruebe los parámetros de adquisición, tales como la intensidad del láser, la ganancia, pinhole, tamaño de voxel y el factor de zoom al inicio del experimento para definir un procedimiento de adquisición estándar a seguir estrictamente lo largotodas las diapositivas para las mediciones cuantitativas consistentes.
   3. Verificar la ausencia de interferencia entre fluorocromos. Si está presente, establecer una exploración secuencial. Adquirir imágenes de transmisión por separado y no simultáneamente.
   4. Lleve a cabo la adquisición de imágenes en serie, en tres dimensiones con la resolución más alta posible en las dimensiones X e Y, y con sobremuestreo 2x en la dimensión z (la regla de Nyquist).
2. Tratamiento de la imagen:
   1. Reconstruir imágenes en serie en tres dimensiones utilizando software comercial o de código abierto.
   2. Definir las superficies de contorno alrededor de cada núcleo (o célula) de interés en 3D.
   3. Cuantificar la fluorescencia en cada canal como la suma de intensidades de los píxeles en cada objeto.
   4. Exportar los datos a Excel para su análisis estadístico. Normalizar las señales de anticuerpos contra las señales de tinción por ejemplo ADN.

Resultados

Proporcionamos un protocolo robusto para la preparación a gran escala y el procesamiento de óvulos Arabidopsis adecuados para la tinción citológica en todo el montaje. Gracias a la incrustación, los óvulos conservan una estructura de 3 dimensiones (Figura 3). Además, el procesamiento de tejido incluyendo la clarificación óptica permite estructuras subcelulares de formación de imágenes en alta resolución. Figura 4 muestra la tinción de ADN en primordios óvulo todo ...

Discusión

En las plantas con flores, el linaje reproductivo femenino está rodeado por varias capas de células incluyendo la nucela y los tegumentos de óvulos, haciendo así la tinción citológica en todo el montaje técnicamente difícil. Aquí presentamos un protocolo eficiente que permite la preparación y elaboración de un gran número de óvulos adecuados para la tinción citológica como inmunotinción, la tinción de ADN y la hibridación fluorescente in situ en todo el montaje. Se utilizó con éxito...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Solutions
BVO Fixation Buffer (based on32)			2 mM EGTA, pH 7.5, 1% (v/v) formaldehyde, 10% DMSO, 1x PBS, 0.1% Tween-20
PBT			1x PBS, 0.1% Tween-20
PBT-F			1x PBT, 2.5% (v/v) formaldehyde
30% acrylamide:bisacrylamide			3 g acrylamide, 0.33 g bisacrylamide, 1x PBS (prepare 10 ml, store at 4 °C)
200 ml 5% acrylamide mix in PBS			34 ml 30% acrylamide:bisacrylamide, 166 ml 1x PBS (make fresh from 30% stock)
20% ammoniumpersulfte			0.2 g ammoniumpersulfte, 1 ml sterile water (prepare aliquots with 1 ml and store at -20 °C)
20% sodium sulfite			0.2 g sodium sulfite, 1 ml sterile water (prepare aliquots with 1 ml and store at -20 °C)
Cell wall enzyme mix			0.5% (w/v) cellulase, 1% (w/v) driselase, 0.5% (w/v) pectolyase
Reagents and Materials
Formaldehyde	Sigma-Aldrich	F1635
DMSO	Sigma	D5879
Tris	Amaresco	0497
Ethanol	Schaurlau	ET00102500
Methanol	Schaurlau	ME03062500
Xylene	ROTH	4436.1
Cellulase	Sigma	1794
Driselase	Sigma	D8037
pectolyase	Sigma	P5936
Tween-20	Merck	8.22184.0500
EGTA	Sigma	E-4378
acrylamide	Sigma	A-3553
bisacrylamide	Sigma	M2022	toxic
ammoniumpersulfate	Sigma	A9164
Sodium sulfite	Fluka	71988
Anti-trimethyl-Histone H3 (Lys4)	Upstate	07-473
Anti- monomethyl-Histone H3 (Lys27)	Upstate	07-448
Alexa Fluor 488~goat ~anti ~rabbit (H+L)	Molecular Probe	A11008
ProlongGold	Invitrogen	P36934
Propidium iodide	Sigma	P4170	toxic
DAPI	Sigma	D9542	toxic
RNAse A	Roche	10109169001
Coplin jar	Huber & CO	10.055
Forceps	DUMONT BIOLOGY
Shaker	Heidolph	543-12310-00-0
Moist chamber			A plastic box with damp paper towel inside, a plastic support is put into the box for supporting the slides and keep slides from the water.
Superfrost Plus slide	Thermo Fisher	J1800AMNZ	Menzel-Gläser
FISH Tag DNA KIt	Invitrogen	F32947
GFP booster	Chromotek