Tüm montaj ovüllerindeki in Kromatin Modifikasyonu ve Nükleer Mimarlık Kantitatif, Tek hücreli Analizi için Etkin Bir Yöntem<em&gt; Arabidopsis</em

Özet

Biz İmmunosteyn, floresan in situ hibridizasyon, tüm montaj Arabidopsis thaliana ovüllerindeki kantitatif, yüksek çözünürlüklü görüntüleme ile takip DNA boyama için burada etkin ve güvenilir bir protokol sağlar. Bu yöntem başarıyla kromatin modifikasyonları ve nükleer mimarisi kullanılarak analiz edildi.

Özet

Çiçekli bitkilerde, somatik-to-üreme hücresi kader geçiş yetişkin bitkinin çiçek organlarında spor anne hücrelerin şartnamede (SMC'ler) ile işaretlenir. Kadın SMC (Megaspor anne hücre, MMC) yumurta hücresi primordiumunun içinde ayırır ve mayoz uğrar. Seçilen haploid Megaspor sonra birlikte aksesuar hücreleri ile, gamet sebebiyet verecek çok hücreli dişi gametofit, yumurta hücresi ve merkez hücre oluşturmak için mitoz uğrar. Ovüldeki içindeki MMC, meiocyte ve dişi gametopitin sınırlı erişilebilirlik sitolojik için teknik olarak zor ve sitogenetik tek hücre düzeyinde analiz eder. Özel olarak, hücresel ya da nükleer epitoplar doğrudan ya da dolaylı immunodeteksiyon bitki hücresi ve tek hücre görüntüleme içindeki reaktiflerin zayıf penetrasyon ile bozulur tüm montaj dokularda optik berraklık eksikliğinden demize edilir.

Böylece, Nucl analiz etmek için etkili bir yöntem geliştirditüm montaj gömülü Arabidopsis ovüllerindeki tek bir hücrede yüksek çözünürlükte kulak organizasyon ve kromatin modifikasyonu. Bu, bir mikroskop lamı üzerine akrilamid jel ince bir tabaka olarak diseksiyon ve sabit ovüllerin gömülmesi dayanmaktadır. Gömülü ovüller immüno-boyama reaktiflere doku açıklık ve geçirgenlik iyileştirmeyi amaçlayan kimyasal ve enzimatik tedavilere tabi tutulur. Bu tedaviler hücresel ve kromatin organizasyonu, DNA ve protein epitoplar korumak. Numuneler Kromatin immüno-lekeleme, in situ hibridizasyon (FISH) floresan ve heterokromatin analiz için DNA lekeleme gibi farklı alt sitolojik analizi için kullanılabilir. 3D rekonstrüksiyon geçmez yüksek çözünürlüklü konfokal lazer tarama mikroskobu (CLSM) görüntüleme, tek hücreli çözünürlükte nicel ölçümler sağlar.

Giriş

Çiçekli bitkilerde üreme soy kurulması SMC'lerinin farklılaşması, kadın MMC ve erkek Mikrospor anne hücre ile başlar. MMC ovül primordiumunun uzak ucunda bir alt epidermal nucellar hücreden gelişen ve mikrospor anne hücre derin çiçek organları ¹ içinde bulunan anter lokül içinde sporogenous dokusundan gelişir. SMC'ler sonra mitoz üzerine gametofitleri doğuran haploid sporlar, üretmek için mayoz tabi. Dişi gametofit veya embriyo kesesi, bir yumurta hücresinin, tek bir merkezi hücrenin, iki synergids ve üç zıtlar oluşur. Erkek gametofit veya polen, bir bitkisel hücre ve iki sperm hücrelerinin oluşmaktadır. Erkek gametofit nispeten erişilebilir nesne-of-çalışma devam ederken, kadın gametofitin kendisi çiçek karpelin içine, ovüldeki içine gömülü, ve dolayısıyla moleküler ve sitolojik analizler belirli zorluklar teşkil edilir. Ancak son zamanlarda, lazer desteklimikrodisseksiyon Transkriptomik MMC ve kadın gemotofitik hücrelerde ^2-4 analizleri sağlayan zarif bir çözüm sundu. Aday gen ekspresyonuna ek olarak sitolojik analizleri, belirli hücre boyama doğrudan ya da dolaylı immüno-lekeleme kullanılarak, endojen hücre bileşenlerinin dinamiklerini araştıran, in situ melezleme ya da raportör gen deneyleri, örneğin RNA sağlar kullanarak analiz eder. Özellikle, birlikte kromatin modifikasyon veya kromatin bileşenleri immün ile, FISH ve DNA boyama kullanılarak sitogenetik boyama Arabidopsis'de ⁵ kromatin dinamikleri ve nükleer organizasyon aydınlatmak için merkezi yaklaşımlardır. Tipik olarak, mayoz de ^6,7 meiocytes bitki erkekte araştırılmıştır spesifik kromozom dinamikleri gerektirir; muhtemelen dinamik epigenetik yeniden programlama yansıtan daha büyük ölçekli, hücreye özel kromatin düzenlenmesi, polen gelişimi sırasında ^8-10 tarif edilmiştir. Buna karşın, nedenikadın meiocyte ve gametofit göreli erişilememesi nedeniyle, bu soruşturmaların uygulamak teknik olarak zor kalır ve sık sık (aşağıya bakınız) kesit veya manuel diseksiyonu ve enzimatik sindirim gerektirir. Buna ek olarak, tüm montaj içinde optik netlik yaygın olmaması sağlam ovüllerindeki üreme hücrelerinin yüksek çözünürlüklü görüntüleme için bir engeldir.

Tüm montaj ovüllerindeki kromozom örgüt sitolojik analizi için klasik bir yöntem Feulgen en lekelenme ^11-13 kullanır. Protein denatürasyonu ile sonuçlanır ve bu nedenle, kromatin yapısının yok edilmesine neden olan DNA (hipokloröz asit kullanılarak) asit hidrolizi içerir. Alternatif olarak, kadın meiocytes ve gemotofitik hücrelerde kromozom organizasyonu (örneğin ^14-18 bakınız) yarı-ince kesitler veya disseke embriyo keseleri ve MMC Dapi ve immun boyama kullanılarak görülebilir. Açıkçası, ancak, manuel diseksiyon ve kesit yoğun emek olabilir vekromatin epitoplarının büyük bir sayıda nitel ve nicel analizi engellemektedir.

Burada bütün montaj içinde alt sitolojik lekelenme çeşitli için uygun Arabidopsis ovüller, çok sayıda hazırlanması için etkin bir protokol sağlar. Kısaca, çiçek tomurcukları bir sabitleyici çözelti içinde inkübe edilir, ovüller sıraları karpelin ayrılır ve polen meiocytes ^19,20 için yapıldığı gibi slayt üzerinde akrilamid gömülü. Gömülü ovüller bundan başka, metanol, etanol, ve hücre duvarı sindirim ve nüfuziyet önce iksilen içinde temizlendi ve sabitlenir. Bu adımların olası varyasyonları tartışılmıştır. Numuneler daha sonra DNA lekeleme, imüno ve FISH için kullanılabilir. Hazırlık modu verimli ve (en fazla 16 slaytlar farklı alt analizi için bir gün içinde hazırlanabilir) paralel deneysel set-up sağlar. Açıklanan tedaviler, tüm montaj içinde homojen sinyalleri etkinleştirmek ve iyi histolojik, hücresel konservelerive hücre tipleri arasında nitel ve nicel karşılaştırmaları yarar üreme hücreleri ve çevresindeki nucellar hücrelerde nükleer organizasyonu. Kalibre, 3-boyutlu rekonstrüksiyon ardından CLSM-tabanlı yüksek çözünürlüklü görüntüleme floresan sinyalleri anlamlı kantitatif ölçümleri sağlar. Biz başarıyla ayırt MMC ²¹ ve dişi gametofit ²² gelişmekte kromatin dinamiklerini analiz etmek için bu prosedürü kullanılır; biz burada tüm montaj ovüllerindeki heterokromatinin analizi, kromatin immünoboyamayla, GFP İmmunosteyn ve FISH temsilcisi sonuçlarını sunmak. Bu protokol daha da diğer bitki dokularında ve türleri için uygun olacağına inanıyoruz.

Protokol

Prosedür, Şekil 1 'de iş akışı tarif edilmektedir, ve diseksiyon ve dokuların yerleştirilmesi için kurulum Şekil 2'de sunulmuştur.

1.. Doku Fixation

1. Buz üzerinde taze BVO sabitleyici tampon içeren bir mikrofuj tüp içinde 20-30 carpels toplayın.
2. Yumuşak, oda sıcaklığında çalkalanarak doku 30 dak.
3. 400 x g de bir tezgah üstü mikrosantrfuj 1 dakika içinde sabitleyici carpels ihtiva eden tüpler dönerler.
4. Dikkatlice sabitleyici tamponunu çıkarın ve PBT 1 ml eklemek, buz üzerinde tüpleri.

2.. Diseksiyon ve katıştırma

1. Bir taze yapılmış,% 5 akrilamid karışımı her 200 ul beş Eppendorf tüpleri hazırlayın.
2. Beş Superfrost slaytlar% 70 etanol ile önceden temizlenmiş ve bir kalem ile etiketlenmiş hazırlayın.
3. Bir% 20 APS bölüntüsünün ve buz üzerinde% 20 Naps her çözülme.
4. Bir kesim uç ucu, yer ile 4-5 carpels alıntemiz bir slayt üzerine onları, sıvı fazlalığı kaldırın.
5. Ince bir iğne ile uzunlamasına kesim yapın ve gösterildiği gibi, Şekil 2 ovüller satır serbest bırakmak için meyve yaprağı duvarları ayırmak, PBS (en fazla 10 ul) ile kaplayarak kurumayı önlemek.
6. Çabuk 12 ul Naps, 200 ul akrilamid karışımı bir bölümüyle 12 ul APS ekleyin ve karıştırın.
7. Kesilmiş ovüllerde üzerine aktive akrilamidin 30 ul ekle.
8. 20 x 20 mm lamel ile kaplayın, oda sıcaklığında 45-60 dk polimerize edelim.
9. Bir jilet kullanarak lamel çıkarın. Bu aşamada, numuneler PBS içeren bir Coplin kavanoz içinde 4 ° C'de bir gece boyunca muhafaza edilebilir.

3.. Doku İşleme

Not: 3.2.1, 3.2.3, 3.3.2 ve 3.4.3 dışındaki tüm aşamalar oda sıcaklığında kimyasal başlık altında 80 ml solüsyonu ile Coplin kavanoz içinde gerçekleştirilmektedir. Slaytlar düz uçlu forseps ile aktarılır.

1. Doku açıklama vesabitleme:
   1. Metanol içinde 5 dakika inkübe edin.
   2. Etanol içinde 5 dakika inkübe edin.
   3. Ksilen (1:1): Etanol içinde 30 dakika inkübe edin.
   4. Etanol içinde 5 dakika inkübe edin.
   5. Metanol içinde 5 dakika inkübe edin.
   6. % 2.5 formaldehit ile tamamlanır, metanol ve PBT (1:1) içinde 15 dakika inkübe edin.
   7. PBT 2 x 10 dakika durulayın. Bu aşamada, slaytlar, 4 ° C de bir gece tutulabilir
2. Hücre duvarı sindirim:
   1. Buz üzerinde hücre duvarı sindirim karışımı bir kısım çözülme.
   2. Bir kağıt havlu üzerinde dikey yerleştirerek sıvının aşırı drenaj, Coplin kavanoz bir slayt atın.
   3. Akrilamid pad üzerinde hücre duvarı sindirim karışımı 100 ul ekleyin ve 23 x 46 mm lamel ile kaplayın. Diğer slaytlar için tekrarlayın. (Malzemelerde anlatılan) bir nem odası içinde 37 ° C'de 2 saat boyunca inkübe edilir.
   4. PBT slaytlar 2 x 5 dakika yıkanır.
3. Bir tedavi RNaz:
   1. Coplin kavanoz bir slayt atın, inci tahliyedaha önce olduğu gibi, fazla sıvının e.
   2. % 1 Tween-20, 1 saat boyunca 37 ° C'de nemli bir odaya ile PBS içinde 100 ug / ml 'de RnazA 100 ul her bir slayt inkübe edin.
   3. PBT 2 x 5 dakika boyunca slaytlar yıkayın.
4. Post-fiksasyon ve permeabilizasyon:
   1. Taze yapılmış PBT-F 20 dakika için Post-fix.
   2. PBT içinde 10 dakika için slaytlar durulayın.
   3. 4 ° C'de% 2 Tween-20 ile PBS içinde 2 saat boyunca geçirgen
   4. PBT 2 x 5 dakika boyunca slaytlar durulayın.

4. İmmünoboyama

NOT: Bu adımda, birincil antikorun optimum konsantrasyonu, değişik seyreltiler antikorların (1:200, 1:500, 1:1000) kullanılarak test edilmesi gerekir.

1. 4 ° C'de 12-24 saat süre ile% 0.2 Tween-20 ile PBS içinde seyreltilmiş birincil antikor, 100 ul her bir slayt inkübe
2. Nazik çalkalama altında oda sıcaklığında 2-4 saat boyunca PBT slaytlar yıkayın.
3. Uygulaİkincil antikor 1:200 PBS +% 0.2 Tween-20, 24 saat boyunca 4 ° C'de
4. Nazik çalkalama altında oda sıcaklığında 1 saat boyunca PBT slaytlar yıkayın.
5. 15 dakika boyunca PBS içinde 10 ug / ml propidyum iyodür Counterstain, daha sonra oda sıcaklığında, hafifçe çalkalayarak, PBS içinde 15 dakika durulayın.
6. Anti-solma sıvı mountant Mount 10 ug / ml propidyum iyodür ile takviye edilmiştir. Montaj orta CLSM görüntüleri almadan önce 1 saat boyunca sertleşmeye bırakın.

5.. Sayısal Görüntüleme

1. Görüntü edinimi:
   1. Ideal daha uzun görüntüleme üzerinde ²³ floresan sinyallerin korunması ve 63X gliserol daldırma objektifi sağlayan bir rezonans tarama modunu kullanarak, CLSM kullanarak yüksek çözünürlüklü görüntüler elde.
   2. Kesinlikle boyunca takip için standart bir toplama prosedürü tanımlamak için böyle bir deney başında lazer yoğunluğu, kazanç, iğne deliği, voksel boyutu ve yakınlaştırma faktörü olarak satın alma parametreleri testTutarlı kantitatif ölçümler için tüm slaytlar.
   3. Fluorochromes arasında çapraz konuşma olmadığını doğrulayın. Eğer varsa, sıralı bir tarama kurmak. Ayrı ayrı ve eş zamanlı iletim görüntü kazanır.
   4. X ve y boyutlarında mümkün olan en yüksek çözünürlükte ve z boyut (Nyquist kuralı) 2x Oversampling ile seri, üç boyutlu görüntü alımı gerçekleştirin.
2. Görüntü işleme:
   1. Ticari veya açık kaynak kodlu yazılım kullanarak üç boyutlu olarak seri görüntüleri yeniden.
   2. 3D ilgi her çekirdek (veya hücre) etrafında kontur yüzeyleri tanımlayın.
   3. Her nesne piksel yoğunluklarının toplamı olarak, her kanaldaki floresansı ölçmek.
   4. Istatistiksel analizler için Excel'e veri ihracat. Örneğin, DNA boyama sinyallerine karşı antikor sinyallerini normalleştirmek.

Sonuçlar

Bu tam montaj sitolojik boyanması için uygun olan Arabidopsis ovüller, büyük ölçekli hazırlanması ve işlenmesi için sağlam bir protokol sağlar. Gömme sayesinde, ovülller bir 3-boyutlu yapı (Şekil 3) korur. Ayrıca, optik açıklama dahil olmak üzere doku işleme yüksek çözünürlükte görüntüleme hücre içi yapıları sağlar. 4 heterokromatinin (hayır Dekonvolüsyonun bu resim için kullanılan) de göze çarpan odaklar tanımlandığı gibi parlak g?...

Tartışmalar

Çiçekli bitkilerde, dişi üreme soy nedenle teknik zorlu tüm montaj sitolojik lekelenme render nucellus ve ovül teguments dahil olmak üzere birçok hücre tabakası ile çevrilidir. Burada örneğin tam montaj in situ hibridizasyon immüno-boyama, DNA boyama ve floresan gibi sitolojik boyanması için uygun ovüller, çok sayıda hazırlanmasını ve işlenmesini sağlayan etkin bir protokol sunmaktır. Başarıyla Arabidopsis ^21,22 dişi üreme tohum çizgisi analizi için kullanılı...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Solutions
BVO Fixation Buffer (based on32)			2 mM EGTA, pH 7.5, 1% (v/v) formaldehyde, 10% DMSO, 1x PBS, 0.1% Tween-20
PBT			1x PBS, 0.1% Tween-20
PBT-F			1x PBT, 2.5% (v/v) formaldehyde
30% acrylamide:bisacrylamide			3 g acrylamide, 0.33 g bisacrylamide, 1x PBS (prepare 10 ml, store at 4 °C)
200 ml 5% acrylamide mix in PBS			34 ml 30% acrylamide:bisacrylamide, 166 ml 1x PBS (make fresh from 30% stock)
20% ammoniumpersulfte			0.2 g ammoniumpersulfte, 1 ml sterile water (prepare aliquots with 1 ml and store at -20 °C)
20% sodium sulfite			0.2 g sodium sulfite, 1 ml sterile water (prepare aliquots with 1 ml and store at -20 °C)
Cell wall enzyme mix			0.5% (w/v) cellulase, 1% (w/v) driselase, 0.5% (w/v) pectolyase
Reagents and Materials
Formaldehyde	Sigma-Aldrich	F1635
DMSO	Sigma	D5879
Tris	Amaresco	0497
Ethanol	Schaurlau	ET00102500
Methanol	Schaurlau	ME03062500
Xylene	ROTH	4436.1
Cellulase	Sigma	1794
Driselase	Sigma	D8037
pectolyase	Sigma	P5936
Tween-20	Merck	8.22184.0500
EGTA	Sigma	E-4378
acrylamide	Sigma	A-3553
bisacrylamide	Sigma	M2022	toxic
ammoniumpersulfate	Sigma	A9164
Sodium sulfite	Fluka	71988
Anti-trimethyl-Histone H3 (Lys4)	Upstate	07-473
Anti- monomethyl-Histone H3 (Lys27)	Upstate	07-448
Alexa Fluor 488~goat ~anti ~rabbit (H+L)	Molecular Probe	A11008
ProlongGold	Invitrogen	P36934
Propidium iodide	Sigma	P4170	toxic
DAPI	Sigma	D9542	toxic
RNAse A	Roche	10109169001
Coplin jar	Huber & CO	10.055
Forceps	DUMONT BIOLOGY
Shaker	Heidolph	543-12310-00-0
Moist chamber			A plastic box with damp paper towel inside, a plastic support is put into the box for supporting the slides and keep slides from the water.
Superfrost Plus slide	Thermo Fisher	J1800AMNZ	Menzel-Gläser
FISH Tag DNA KIt	Invitrogen	F32947
GFP booster	Chromotek