שיטה יעילה לניתוח כמותי, תא בודד של הכרומטין שינוי ואדריכלות גרעינית בהר שלם-ביציות ב<em&gt; ארבידופסיס</em

Summary

אנו מספקים כאן פרוטוקול יעיל ואמין עבור immunostaining, הקרינה הכלאה באתר, מכתים DNA ואחרי הדמיה בביציות thaliana ארבידופסיס כל הר כמותיים, ברזולוציה גבוהה. שיטה זו השתמשה בהצלחה כדי לנתח שינויי הכרומטין ואדריכלות גרעינית.

Abstract

בצמחים פורחים, המעבר גורל תא סומטי לרבייה מתאפיין במפרט של תאי אם נבג (SMCs) באיברים פרחוניים של הצמח הבוגר. נקבת SMC (תא האם megaspore, MMC) מבדיל בprimordium הביצית ועובר מיוזה. Megaspore הפלואידים שנבחר לאחר מכן עובר מיטוזה ליצירת הנשית gametophyte רב תאי, שיהיה להצמיח תאי הרבייה, תא הביצית ותא מרכזי, יחד עם תאי אבזר. הנגישות המוגבלת של MMC, meiocyte וgametophyte הנשי בתוך הביצית היא מאתגרת מבחינה טכנית לציטולוגיה וציטוגנטית מנתח ברמת תא בודדת. במיוחד, immunodetection ישיר או העקיף של אפיטופים סלולריים או גרעיניים נפגעים על ידי חדירה ירודה של חומרים כימיים בתוך ההדמיה תא צמח ותא בודד demised ידי חוסר הבהירות אופטית ברקמות כל הר.

לכן, פיתחנו שיטה יעילה לנתח nuclארגון אוזן ושינוי הכרומטין ברזולוציה גבוהה של תא בודד בכל הר ביציות ארבידופסיס משובצים. היא מבוססת על נתיחה והטבעה של ביציות קבועות בשכבה דקה של ג'ל acrylamide בשקופית מיקרוסקופית. הביציות מוטבעות חשופים לטיפולים כימיים והאנזימטית שמטרתן שיפור בהירות וחדירות רקמה לחומרים הכימיים immunostaining. טיפולים אלה לשמר אפיטופים ארגון, דנ"א וחלבון תאיים והכרומטין. הדגימות יכולות לשמש לניתוחים שונים במורד הזרם ציטולוגית, כוללים immunostaining הכרומטין, הקרינה הכלאה באתרו (FISH), ומכתים DNA לניתוח heterochromatin. הדמיה מיקרוסקופית סריקת לייזר confocal (CLSM), עם רזולוציה גבוהה, ואחריו שחזור 3D מאפשרת למדידות כמותיות ברזולוציה תא בודד.

Introduction

בצמחים פורחים, הקמת שושלות רבייה מתחילה בבידול של SMCs, MMC הנשי ותא האם נבגון גברי. MMC מתפתח מתא nucellar תת אפידרמיס בקצה הדיסטלי של primordium הביצית, והתא האם נבגון מתפתח מרקמת sporogenous במאבק locule, אשר ממוקמים עמוק בתוך האיברים פרחוניים ^1. SMCs לעבור מיוזה לייצר נבגים הפלואידים, אשר לאחר מכן להצמיח gametophytes על מיטוזה. נקבת gametophyte, או שק עובר, מורכב מתא אחד ביצה, תא מרכזי אחד, שתיים ושלוש synergids antipodals. Gametophyte הגברי, או האבקה, מורכבת מתא אחד של צמח ושני תאי זרע. בעוד gametophyte הזכר נשאר מחקר אובייקט-of-יחסית נגיש, הנשי gametophyte מוטבע בתוך הביצית, את עצמו מוקף בcarpel הפרח, ובכך מציב אתגרים ספציפיים לניתוחים מולקולריים וציטולוגיה. לאחרונה, עם זאת, בסיוע לייזרmicrodissection הציע פתרון אלגנטי המאפשר transcriptomic מנתח בMMC ותאי gametophytic הנשיים ^2-4. בנוסף לביטוי גני מועמד מנתח, תוך שימוש למשל RNA הכלאה באתר או מבחני גן כתב, ניתוחי ציטולוגית מאפשר חוקרים את הדינמיקה של מרכיבים תאיים אנדוגני באמצעות מכתים ספציפי ישיר הסלולר או immunostaining העקיף. במיוחד, מכתים ציטוגנטית באמצעות דגים ומכתימים-DNA, יחד עם immunostaining של שינויי הכרומטין או רכיבי הכרומטין גישות מרכזיות על מנת להבהיר דינמיקת הכרומטין וארגון גרעיני בארבידופסיס ^5. בדרך כלל, מיוזה כרוכה דינמיקה של כרומוזום מסוימת שנחקרה היטב בזכר מפעל meiocytes ^6,7; בקנה מידה גדול עוד יותר, ארגון מחדש הכרומטין תא ספציפי, סביר המשקף את תכנות מחדש אפיגנטיים דינמי תוארה במהלך התפתחות אבקת ^8-10. לעומת זאת, בשללנגישות היחסית של נקבת meiocyte וgametophyte, החקירות אלה נשארים קשות מבחינה טכנית ליישם, ולעתים קרובות דורשות נתיחת חתך או הוראות ועיכול אנזימטי (ראה להלן). בנוסף, חוסר הרווח של בהירות אופטית בכל ההר הוא מכשול להדמיה ברזולוציה גבוהה של תאי רבייה בביציות ללא פגע.

שיטה קלאסית לניתוח ציטולוגית של ארגון כרומוזום בביציות כל הר משתמשת בהכתמה של Feulgen ^11-13. זה כרוך הידרוליזה חומצה (באמצעות חומצת hypochlorous) של ה-DNA שתוצאת denaturation חלבון ובכך גורם להרס של מבנה הכרומטין. לחלופין, ארגון כרומוזום בmeiocytes הנשי ותאי gametophytic ניתן לצפות באמצעות מכתים DAPI וimmunostaining על סעיפי חצי דקים או שקי עובר גזורים וMMC (למשל לראות ^14-18). עם זאת, ברור נתיחה וחתך במדריך יכולים להיות עבודה אינטנסיבית ופוגע בניתוח האיכותי וכמותי של מספר גדול של אפיטופים הכרומטין.

כאן אנו מספקים פרוטוקול יעיל להכין מספר גדול של ביציות ארבידופסיס מתאימות למגוון של מכתים ציטולוגית במורד הזרם בכל ההר. בקיצור, ניצני פרחים מודגרת בפתרון מקבע, שורות של ביציות הם גזורים מcarpel והמשובצת בacrylamide בשקופית כפי שנעשו לmeiocytes האבקה ^19,20. הביציות מוטבעות נמחקות נוספת וקבוע במתנול, אתנול, וקסילן לפני דופן תא עיכול וpermeabilization. וריאציות אפשריות של צעדים אלה הם דנו. הדגימות לאחר מכן ניתן להשתמש עבור מכתים DNA, immunostaining, ודגים. מצב ההכנה הוא יעיל ומאפשר לניסוי הגדרה מקבילה (אפשר להכין עד 16 שקופיות ביום לניתוח במורד הזרם שונה). הטיפולים שתוארו יאפשר אותות הומוגנית בכל ההר והשתמרו היסטולוגית, סלולארי טוב,וארגון גרעיני בתאי רבייה ותאים המקיפים nucellar אשר נהנים השוואות איכותיות וכמותית בין סוגי תאים. מכויל, הדמיה ברזולוציה גבוהה המבוססת על CLSM ואחריו שחזור 3 ממדים מאפשרת מדידת כמותית משמעותית של אותות ניאון. אנחנו השתמשנו בהצלחה בהליך זה כדי לנתח את דינמיקת הכרומטין בMMC ההבחנה ²¹ ופיתוח נשי gametophyte ^22; אנו מציגים כאן תוצאות נציג של ניתוח heterochromatin, immunostaining הכרומטין, immunostaining GFP ודגים בביציות כל הר. בנוסף, אנו מאמינים כי הפרוטוקול שלנו יהיה מתאים לרקמות צמח אחרות ומינים.

Protocol

ההליך מתואר בזרימת העבודה באיור 1, וההתקנה לנתיחה והטבעה של רקמות מוצגות באיור 2.

1. קיבוע רקמות

1. לאסוף 20-30 carpels בצינור microfuge המכיל חיץ מקבע BVO טרי על קרח.
2. תקן את דקות הרקמות 30 עם עדין רועד בטמפרטורת חדר.
3. ספין הצינורות המכילים carpels במקבע בדקות microcentrifuge המעבדתיים 1 ב400 x גרם.
4. להסיר בזהירות את החיץ מקבע ולהוסיף 1 מיליליטר של PBT, למקם את הצינורות על קרח.

2. Dissection והטבעה

1. הכן חמישה צינורות Eppendorf עם כל 200 μl של טרי, תערובת acrylamide 5%.
2. הכן חמש שקופיות Superfrost מראש לנקות עם 70% אתנול ושכותרתו עם עיפרון.
3. הפשירו aliquot אחד APS 20% ותנומות 20% כל אחת, על קרח.
4. קח 4-5 carpels עם קצה חיתוך קצה, מקוםשלהם בשקופית נקייה, להסיר את עודפי נוזלים.
5. לבצע חתכים אורך עם מחט דקה ולנתק את קירות carpel לשחרר שורות של ביציות כאיור מוצג 2, להימנע מייבוש על ידי כיסוי עם PBS (לא יותר מ 10 μl).
6. מהירות להוסיף ולערבב 12 תנומות μl, 12 APS μl עם aliquot של 200 תמהיל acrylamide μl.
7. הוסף 30 μl של acrylamide מופעל על הביציות גזורים.
8. כסה עם coverslip מ"מ 20 x 20, בואו פלמר בטמפרטורת חדר, 45-60 דקות.
9. הסר את coverslip באמצעות סכין גילוח. בשלב זה, יכולה להישמר דגימות לילה ב 4 ° C בצנצנת Coplin המכילה PBS.

3. עיבוד רקמות

הערה: כל הצעדים מלבד 3.2.1, 3.2.3, 3.3.2 ו 3.4.3 מתבצעים בצנצנות Coplin עם 80 מיליליטר פתרון מתחת למכסת המנוע הכימי בטמפרטורת חדר. שקופיות מועברות עם מלקחיים שטוח קצה.

1. הבהרה ורקמותקיבעון:
   1. דגירה 5 דקות במתנול.
   2. דגירה 5 דקות באתנול.
   3. דגירה 30 דקות באתנול: קסילן (1:1).
   4. דגירה 5 דקות באתנול.
   5. דגירה 5 דקות במתנול.
   6. דגירה 15 דקות במתנול וPBT (1:1), השלימה עם פורמלדהיד 2.5%.
   7. יש לשטוף 2 x 10 דקות בPBT. בשלב זה, יכולה להישמר שקופיות לילה בשעה 4 ° C.
2. דופן תא עיכול:
   1. הפשירו aliquot של תמהיל עיכול דופן תא על קרח.
   2. קח את שקופית מצנצנת Coplin, לנקז את עודף הנוזלים על ידי הצבתו בצורה אנכית על מגבת נייר.
   3. הוספה של תערובת עיכול דופן תא 100 μl מעל משטח acrylamide ולכסות עם coverslip מ"מ 23 x 46. חזור לשקופיות האחרות. דגירה עבור שעה 2 על 37 מעלות צלזיוס בתא לח (שמתוארת בחומרים).
   4. שטוף את דקות 2 x 5 שקופיות בPBT.
3. RNase טיפול:
   1. קח את שקופית מצנצנת Coplin, ניקוז העודף דואר של נוזל כמו קודם.
   2. דגירה כל שקופית עם של RNAseA 100 μl ב100 מיקרוגרם / מיליליטר PBS עם Tween-20 1% עבור שעה 1 ב 37 מעלות צלזיוס בתא לח.
   3. שטוף את השקופיות עבור 2 x 5 דקות בPBT.
4. לאחר קיבוע וpermeabilization:
   1. פוסט לתקן עבור 20 דקות בטריות PBT-F.
   2. שטוף את השקופיות עבור 10 דקות בPBT.
   3. Permeabilize עבור שעה 2 ב-PBS עם Tween-20 2% ב 4 ° C.
   4. שטוף את השקופיות עבור 2 x 5 דקות בPBT.

4. Immunostaining

הערה: לצעד זה, הריכוז האופטימלי של הנוגדן הראשוני יש להיבדק על ידי שימוש בדילולים שונים (1:200, 1:500, 1:1000) של הנוגדנים.

1. דגירה כל שקופית עם של נוגדן ראשוני 100 μl המדולל PBS עם 20-Tween 0.2% לשעה 12-24 ב 4 ° C.
2. שטוף את השקופיות בPBT במשך 2-4 שעות בטמפרטורת חדר בטלטול עדין.
3. החל1:200 נוגדן המשני ב-PBS + 0.2% Tween-20 ל24 שעות ב 4 ° C.
4. לשטוף שקופיות PBT במשך שעה 1 בטמפרטורת חדר מתחת לטלטול עדין.
5. Counterstain עם יודיד 10 מיקרוגרם / מיליליטר propidium ב-PBS במשך 15 דקות, ואז לשטוף 15 דקות ב-PBS בטלטול עדין, בטמפרטורת חדר.
6. ההר בmountant נוזל אנטי דהייה בתוספת 10 מיקרוגרם / מיליליטר propidium יודיד. בואו ההרכבה בינונית להקשיח עבור שעה 1 לפני רכישת תמונות על ידי CLSM.

5. הדמיה כמותי

1. רכישת תמונה:
   1. לרכוש תמונות ברזולוציה גבוהות באמצעות CLSM, באופן אידיאלי באמצעות מצב סריקת תהודה, המאפשר שימור טוב יותר של אותות ניאון מעל ההדמיה ממושכת ^23, ועדשת 63x טבילת גליצרול.
   2. בדוק את הפרמטרים הרכישה כגון עוצמת לייזר, רווח, חריר, גודל voxel וגורם הזום בתחילת הניסוי להגדיר הליך רכישה סטנדרטי להקפיד לעקוב לאורךכל השקופיות למדידות כמותיות עקביות.
   3. ודא העדר הדיבור צולב בין fluorochromes. אם קיימים, להגדיר סריקה רציפה. לרכוש תמונות שידור בנפרד ולא בו זמנית.
   4. לבצע רכישת סדרתי, תלת ממדי תמונה עם הרזולוציה הגבוהה ביותר אפשרית ובממדי x y ועם דגימת יתר 2x בממד z (שלטונו של נייקוויסט).
2. עיבוד תמונה:
   1. לשחזר תמונות סידוריים בשלושת ממדים באמצעות תוכנת קוד מסחרית או פתוחה.
   2. הגדרת משטחי גובה סביב כל גרעין (או סלולרי) של עניין ב-3D.
   3. לכמת הקרינה בכל ערוץ כסכום של עוצמות פיקסל בכל אובייקט.
   4. לייצא את הנתונים ל-Excel עבור ניתוחים סטטיסטיים. לנרמל את אותות נוגדנים נגד אותות מכתים למשל ה-DNA.

תוצאות

אנו מספקים פרוטוקול חזק להכנה בקנה מידה גדולה ועיבוד של ביציות ארבידופסיס מתאימות לצביעת ציטולוגית בכל ההר. הודות להטבעה, הביציות לשמר מבנה 3 ממדים (איור 3). יתר על כן, עיבוד הרקמות כולל הבהרה אופטית מאפשר מבני subcellular הדמיה ברזולוציה גבוהה. איור 4...

Discussion

בצמחים פורחים, שושלת הרבייה הנשית מוקפת בכמה שכבות תאים הכוללים nucellus וteguments הביצית, ובכך הופכת את צביעת ציטולוגית בכל הר מאתגר מבחינה טכנית. כאן אנו מציגים פרוטוקול יעיל המאפשר העריכה ולעיבוד של מספר רב של ביציות מתאימות לצביעת ציטולוגית כגון immunostaining, מכתים DNA וקרינת...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Solutions
BVO Fixation Buffer (based on32)			2 mM EGTA, pH 7.5, 1% (v/v) formaldehyde, 10% DMSO, 1x PBS, 0.1% Tween-20
PBT			1x PBS, 0.1% Tween-20
PBT-F			1x PBT, 2.5% (v/v) formaldehyde
30% acrylamide:bisacrylamide			3 g acrylamide, 0.33 g bisacrylamide, 1x PBS (prepare 10 ml, store at 4 °C)
200 ml 5% acrylamide mix in PBS			34 ml 30% acrylamide:bisacrylamide, 166 ml 1x PBS (make fresh from 30% stock)
20% ammoniumpersulfte			0.2 g ammoniumpersulfte, 1 ml sterile water (prepare aliquots with 1 ml and store at -20 °C)
20% sodium sulfite			0.2 g sodium sulfite, 1 ml sterile water (prepare aliquots with 1 ml and store at -20 °C)
Cell wall enzyme mix			0.5% (w/v) cellulase, 1% (w/v) driselase, 0.5% (w/v) pectolyase
Reagents and Materials
Formaldehyde	Sigma-Aldrich	F1635
DMSO	Sigma	D5879
Tris	Amaresco	0497
Ethanol	Schaurlau	ET00102500
Methanol	Schaurlau	ME03062500
Xylene	ROTH	4436.1
Cellulase	Sigma	1794
Driselase	Sigma	D8037
pectolyase	Sigma	P5936
Tween-20	Merck	8.22184.0500
EGTA	Sigma	E-4378
acrylamide	Sigma	A-3553
bisacrylamide	Sigma	M2022	toxic
ammoniumpersulfate	Sigma	A9164
Sodium sulfite	Fluka	71988
Anti-trimethyl-Histone H3 (Lys4)	Upstate	07-473
Anti- monomethyl-Histone H3 (Lys27)	Upstate	07-448
Alexa Fluor 488~goat ~anti ~rabbit (H+L)	Molecular Probe	A11008
ProlongGold	Invitrogen	P36934
Propidium iodide	Sigma	P4170	toxic
DAPI	Sigma	D9542	toxic
RNAse A	Roche	10109169001
Coplin jar	Huber & CO	10.055
Forceps	DUMONT BIOLOGY
Shaker	Heidolph	543-12310-00-0
Moist chamber			A plastic box with damp paper towel inside, a plastic support is put into the box for supporting the slides and keep slides from the water.
Superfrost Plus slide	Thermo Fisher	J1800AMNZ	Menzel-Gläser
FISH Tag DNA KIt	Invitrogen	F32947
GFP booster	Chromotek