Une méthode efficace pour quantitative, analyse unicellulaire de la chromatine Modification et architecture nucléaire dans l&#39;ensemble du montage ovules dans<em&gt; Arabidopsis</em

Résumé

Nous fournissons ici un protocole efficace et fiable pour immunologique, hybridation fluorescente in situ, la coloration de l'ADN suivie quantitative, imagerie à haute résolution dans des ovules d'Arabidopsis thaliana l'ensemble du montage. Cette méthode a été utilisée avec succès pour analyser des modifications de la chromatine nucléaire et de l'architecture.

Résumé

Chez les plantes à fleurs, la transition du destin cellulaire somatique à la reproduction est marquée par la spécification des cellules mères de spores (SMC) dans les organes floraux de la plante adulte. Le SMC femelle (cellule mère de mégaspore, MMC) distingue dans l'ébauche ovule et subit la méiose. Le mégaspore haploïde sélectionné est ensuite soumis à la mitose pour former le gamétophyte femelle multicellulaire, qui donnera naissance aux gamètes, l'ovule et la cellule centrale, avec des cellules accessoires. L'accessibilité limitée de la console MMC, meiocyte et gamétophyte femelle à l'intérieur de l'ovule est techniquement difficile pour cytologique et cytogénétique des analyses au niveau d'une seule cellule. En particulier, immunodétection directe ou indirecte d'épitopes cellulaires ou nucléaires est affaiblie par la faible pénétration des réactifs à l'intérieur de l'imagerie cellulaire végétale et une seule cellule est affermé par le manque de clarté optique dans l'ensemble du montage tissus.

Ainsi, nous avons développé une méthode efficace pour analyser les nucll'organisation de l'oreille et la modification de la chromatine à haute résolution de la cellule unique dans l'ensemble du montage ovules d'Arabidopsis embarqués. Il est basé sur la dissection et l'incorporation d'ovules fixes dans une fine couche de gel d'acrylamide sur une lame de microscope. Les ovules embarqués sont soumis à des traitements chimiques et enzymatiques visant à améliorer la clarté des tissus et de la perméabilité des réactifs d'immunomarquage. Ces traitements préserver organisation, ADN et de protéines épitopes cellulaires et la chromatine. Les échantillons peuvent être utilisés pour différentes analyses cytologiques aval, y compris la chromatine immunocoloration, l'hybridation in situ par fluorescence (FISH), et la coloration de l'ADN pour l'analyse de l'hétérochromatine. La microscopie confocale à balayage laser (CLSM), l'imagerie à haute résolution, suivie d'une reconstruction 3D permet des mesures quantitatives à seule cellule de résolution.

Introduction

Chez les plantes à fleurs, l'établissement de lignées de reproduction commence par la différenciation des CML, MMC féminine et masculine cellule microspores mère. La MMC se développe à partir d'une cellule nucellaire sous-épidermique à l'extrémité distale de l'ébauche ovule, et la cellule mère des microspores se développe à partir du tissu sporogène dans la loge des anthères, qui sont situés profondément à l'intérieur des organes floraux ^1. SMC subissent une méiose pour produire des spores haploïdes, qui donnent alors lieu à des gamétophytes sur la mitose. Le gamétophyte femelle, ou sac embryonnaire, se compose d'un ovule, une cellule centrale, deux synergides et trois antipodes. Le gamétophyte mâle, ou le pollen, est composé d'une cellule végétative et deux spermatozoïdes. Alors que le gamétophyte mâle reste une étude d'objet de relativement accessible, le gamétophyte femelle est incorporé dans l'ovule, se joint à la carpelle de fleur, et pose donc des défis particuliers pour les analyses moléculaires et cytologiques. Récemment, cependant, assistée par lasermicrodissection offert une solution élégante permettant des analyses du transcriptome dans la console MMC et les cellules gamétophytiques femmes ^2-4. En plus de l'expression du gène candidat analyses, par exemple, en utilisant l'hybridation in situ de l'ARN ou des dosages de gène rapporteur dans les analyses cytologiques permet l'étude des dynamiques de composants cellulaires endogènes en utilisant une coloration spécifique cellulaire directe ou indirecte immunomarquage. En particulier, la coloration cytogénétique utilisant FISH et coloration de l'ADN, avec immunomarquage des modifications de la chromatine ou des composants de la chromatine sont des approches centrales à élucider la dynamique de la chromatine et l'organisation nucléaire chez Arabidopsis ^5. Typiquement, la méiose entraîne la dynamique des chromosomes spécifiques qui a été bien étudiés dans plante mâle méiocytes ^6,7; encore à grande échelle, la réorganisation de la chromatine spécifique de la cellule, ce qui reflète probablement la reprogrammation épigénétique dynamique a été décrite au cours du développement du pollen ^8-10. En revanche, en raisonà l'inaccessibilité relative de la meiocyte femelle et gamétophyte, ces enquêtes restent techniquement difficile à appliquer, et nécessitent souvent dissection sectionnement ou manuel et la digestion enzymatique (voir ci-dessous). En outre, l'absence fréquente de clarté optique dans l'ensemble du montage est un obstacle à l'imagerie haute résolution des cellules reproductrices dans ovules intacts.

Une méthode classique pour l'analyse cytologique de l'organisation des chromosomes entiers dans des ovules de montage utilise la coloration de Feulgen ^11-13. Elle implique une hydrolyse acide (en utilisant de l'acide hypochloreux) de l'ADN qui en résulte provoque la dénaturation des protéines et la destruction de la structure de la chromatine ainsi. Alternativement, l'organisation des chromosomes dans méiocytes femmes et les cellules gamétophytiques peut être observée en utilisant la coloration DAPI et immunomarquage sur coupes semi-fines ou sacs embryonnaires disséqués et MMC (par exemple voir ^14-18). Il est clair, cependant, la dissection manuelle et la coupe peut être beaucoup de travail etentrave sur l'analyse qualitative et quantitative d'un grand nombre d'épitopes de la chromatine.

Ici, nous fournissons un protocole efficace pour préparer un grand nombre d'ovules Arabidopsis pour une variété de coloration cytologique en aval dans l'ensemble du montage. En bref, les boutons floraux sont incubées dans une solution de fixation, des rangées de ovules sont disséqués du carpelle et intégrés dans l'acrylamide sur la diapositive que fait pour méiocytes de pollen ^19,20. Les ovules sont incorporés en outre compensées et fixés dans le méthanol, l'éthanol, le xylène et avant la digestion de la paroi cellulaire et de perméabilisation. Des variations possibles de ces étapes sont décrites. Les échantillons peuvent ensuite être utilisés pour la coloration de l'ADN, une immunocoloration et FISH. Le mode de préparation est efficace et permet parallèle expérimental (jusqu'à 16 lames peuvent être préparés d'une journée d'analyse en aval différent). Les traitements décrits permettent signaux homogènes dans l'ensemble du montage et bien conservés histologique, cellulaire,et l'organisation nucléaire dans les cellules reproductrices et les cellules environnantes qui bénéficient nucellaires comparaisons qualitatives et quantitatives entre les types cellulaires. Calibré, l'imagerie à haute résolution basée sur CLSM suivie d'une reconstruction en 3 dimensions permet des mesures quantitatives significatives de signaux fluorescents. Nous avons utilisé avec succès cette procédure pour analyser la dynamique de la chromatine dans la console MMC de différenciation ²¹ et le développement gamétophyte femelle ^22; Nous présentons ici des résultats représentatifs de l'analyse de l'hétérochromatine, immunologique de la chromatine, la GFP immunologique et FISH dans l'ensemble du montage ovules. Nous croyons en outre que notre protocole sera adapté pour d'autres tissus végétaux et des espèces.

Protocole

La procédure est décrite dans le flux de travail dans la figure 1, et la configuration de la dissection et l'incorporation de tissus sont présentés dans la figure 2.

1. Fixation tissulaire

1. Recueillir 20-30 carpelles dans un tube de centrifugeuse contenant fraîchement tampon fixateur BVO sur la glace.
2. Fixer le tissu 30 min en agitant doucement à température ambiante.
3. Faites tourner les tubes contenant les carpelles en fixateur dans une paillasse centrifuger 1 min à 400 x g.
4. Retirez soigneusement le tampon fixateur et ajouter 1 ml de PBT, placer les tubes sur la glace.

2. Dissection and Embedding

1. Préparer cinq tubes Eppendorf avec chacun 200 pl d'une fraîchement préparé, 5% d'acrylamide mélange.
2. Préparer cinq lames Superfrost pré-nettoyées à l'éthanol à 70% et étiquetés avec un crayon.
3. Décongeler une aliquote de 20% et 20% APS NaPS chacun, sur la glace.
4. Prenez 4-5 carpelles avec une pointe coupe-fin, le lieueux sur une lame propre, éliminer l'excès de liquide.
5. Faire des coupes longitudinales avec une aiguille fine et détacher les murs de carpelles de libérer les lignes de ovules comme le montre la figure 2, éviter le séchage en couvrant avec du PBS (pas plus de 10 pi).
6. Ajouter rapidement et mélanger 12 NaPS pi, 12 pi APS avec une aliquote de 200 ul acrylamide mélange.
7. Ajouter 30 ul de l'acrylamide activé sur les ovules disséqués.
8. Couvrir avec une lamelle mm 20 x 20, laisser polymériser à température ambiante, 45-60 min.
9. Retirer la lamelle couvre-objet en utilisant une lame de rasoir. A ce stade, les échantillons peuvent être conservés pendant une nuit à 4 ° C dans une jarre de Coplin contenant du PBS.

3. Traitement des tissus

NOTE: Toutes les étapes, sauf 3.2.1, 3.2.3, 3.3.2 et 3.4.3 sont effectués dans des bocaux de Coplin avec 80 ml de solution sous le capot chimique à température ambiante. Les lames sont transférés avec une pointe plate-pince.

1. clarification des tissus etfixation:
   1. Incuber 5 min dans du methanol.
   2. Incuber 5 min dans de l'éthanol.
   3. Incuber 30 min dans de l'éthanol: xylène (1:1).
   4. Incuber 5 min dans de l'éthanol.
   5. Incuber 5 min dans du methanol.
   6. Incuber 15 min dans du methanol et le PBT (1:01), complété avec 2,5% de formaldehyde.
   7. Rincer 2 x 10 min en PBT. A ce stade, les lames peuvent être conservées pendant une nuit à 4 ° C.
2. paroi cellulaire digestion:
   1. Décongeler une aliquote de la paroi cellulaire digestion mélange sur de la glace.
   2. Prenez une diapositive de la cuve à rainures, drainer l'excès de liquide en le plaçant à la verticale sur une serviette en papier.
   3. Ajouter 100 pi de la paroi cellulaire digestion mélange sur le pavé de l'acrylamide et couvrir avec une lamelle 23 mm x 46. Répétez l'opération pour les autres diapositives. Incuber pendant 2 heures à 37 ° C dans une chambre humide (décrit dans Matériels).
   4. Laver les lames 2 x 5 min en PBT.
3. RNase A de traitement:
   1. Prenez une diapositive de la cuve à rainures, égoutter èmee excès de liquide que précédemment.
   2. Incuber chaque lame avec 100 pl de RNase A à 100 ug / ml dans du PBS avec 1% de Tween-20 pendant 1 h à 37 ° C dans une chambre humide.
   3. Laver les lames de 2 x 5 min en PBT.
4. Post-fixation et perméabilisation:
   1. Post-fixer pendant 20 min dans fraîchement PBT-F.
   2. Rincer les lames pendant 10 minutes dans le PBT.
   3. Perméabiliser pendant 2 h dans du PBS avec 2% de Tween-20 à 4 ° C.
   4. Rincer les lames de 2 x 5 min en PBT.

4. Immunocoloration

NOTE: Pour cette étape, la concentration optimale de l'anticorps primaire doit être testée en utilisant différentes dilutions (1:200, 1:500, 1:1000) d'anticorps.

1. Incuber chaque lame avec 100 pi d'anticorps primaire dilué dans du PBS avec 0,2% de Tween-20 pendant 12 à 24 heures à 4 ° C.
2. Laver les lames en PBT pour 2-4 heures à température ambiante sous agitation douce.
3. Appliquer le1:200 d'anticorps secondaire dans du PBS + 0,2% de Tween-20 pendant 24 h à 4 ° C.
4. Laver les lames dans PBT pendant 1 heure à température ambiante sous agitation douce.
5. Contre-colorer avec 10 pg / ml d'iodure de propidium dans du PBS pendant 15 min, puis rincer 15 min dans du PBS sous agitation douce, à température ambiante.
6. Mont en milieu de montage anti-décoloration de liquide supplémenté avec 10 pg / ml d'iodure de propidium. Que le milieu de montage durcir pendant 1 heure avant l'acquisition d'images par CLSM.

5. Imagerie quantitative

1. acquisition de l'image:
   1. Acquérir des images de haute résolution en utilisant CLSM, de préférence en utilisant un mode de balayage de résonance, ce qui permet une meilleure conservation des signaux de fluorescence au cours de l'imagerie ²³ prolongée, et une lentille à immersion 63X de glycérol.
   2. Testez les paramètres d'acquisition tels que l'intensité du laser, le gain, sténopé, la taille de voxel et le facteur de zoom au début de l'expérience de définir une procédure d'acquisition standard pour suivre strictement tout au long detoutes les diapositives pour des mesures quantitatives cohérentes.
   3. Vérifier l'absence de diaphonie entre fluorochromes. Le cas échéant, mettre en place une analyse séquentielle. Acquérir les images de transmission séparément et non simultanément.
   4. Effectuer une acquisition d'image de série, en trois dimensions avec la plus haute résolution possible dans les dimensions X et Y et avec 2x suréchantillonnage dans la dimension z (la règle de Nyquist).
2. Traitement de l'image:
   1. Reconstruire des images de série en trois dimensions en utilisant un logiciel de source commerciale ou ouvert.
   2. Définir des surfaces de contour autour de chaque noyau (ou cellule) d'intérêt en 3D.
   3. Quantifier la fluorescence dans chaque canal à la somme des intensités de pixels dans chaque objet.
   4. Exporter les données vers Excel pour des analyses statistiques. Normaliser les signaux d'anticorps contre les signaux de coloration par exemple d'ADN.

Résultats

Nous fournissons un protocole robuste pour la préparation à grande échelle et le traitement des ovules Arabidopsis appropriés pour la coloration cytologique dans l'ensemble du montage. Merci à l'encastrement, les ovules conservent une structure en 3 dimensions (Figure 3). En outre, le traitement des tissus, y compris la clarification optique permet des structures sous-cellulaires d'imagerie à haute résolution. Figure 4 montre coloration de l'ADN dans l...

Discussion

Chez les plantes à fleurs, la lignée reproducteur féminin est entouré de plusieurs couches de cellules, y compris le nucelle et les téguments de l'ovule, ce qui rend la coloration cytologique en tout montage techniquement difficile. Nous présentons ici un protocole efficace permettant à l'élaboration et au traitement d'un grand nombre d'ovules appropriés pour la coloration cytologique comme immunologique, la coloration de l'ADN et l'hybridation fluorescente in situ l'ensembl...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Solutions
BVO Fixation Buffer (based on32)			2 mM EGTA, pH 7.5, 1% (v/v) formaldehyde, 10% DMSO, 1x PBS, 0.1% Tween-20
PBT			1x PBS, 0.1% Tween-20
PBT-F			1x PBT, 2.5% (v/v) formaldehyde
30% acrylamide:bisacrylamide			3 g acrylamide, 0.33 g bisacrylamide, 1x PBS (prepare 10 ml, store at 4 °C)
200 ml 5% acrylamide mix in PBS			34 ml 30% acrylamide:bisacrylamide, 166 ml 1x PBS (make fresh from 30% stock)
20% ammoniumpersulfte			0.2 g ammoniumpersulfte, 1 ml sterile water (prepare aliquots with 1 ml and store at -20 °C)
20% sodium sulfite			0.2 g sodium sulfite, 1 ml sterile water (prepare aliquots with 1 ml and store at -20 °C)
Cell wall enzyme mix			0.5% (w/v) cellulase, 1% (w/v) driselase, 0.5% (w/v) pectolyase
Reagents and Materials
Formaldehyde	Sigma-Aldrich	F1635
DMSO	Sigma	D5879
Tris	Amaresco	0497
Ethanol	Schaurlau	ET00102500
Methanol	Schaurlau	ME03062500
Xylene	ROTH	4436.1
Cellulase	Sigma	1794
Driselase	Sigma	D8037
pectolyase	Sigma	P5936
Tween-20	Merck	8.22184.0500
EGTA	Sigma	E-4378
acrylamide	Sigma	A-3553
bisacrylamide	Sigma	M2022	toxic
ammoniumpersulfate	Sigma	A9164
Sodium sulfite	Fluka	71988
Anti-trimethyl-Histone H3 (Lys4)	Upstate	07-473
Anti- monomethyl-Histone H3 (Lys27)	Upstate	07-448
Alexa Fluor 488~goat ~anti ~rabbit (H+L)	Molecular Probe	A11008
ProlongGold	Invitrogen	P36934
Propidium iodide	Sigma	P4170	toxic
DAPI	Sigma	D9542	toxic
RNAse A	Roche	10109169001
Coplin jar	Huber & CO	10.055
Forceps	DUMONT BIOLOGY
Shaker	Heidolph	543-12310-00-0
Moist chamber			A plastic box with damp paper towel inside, a plastic support is put into the box for supporting the slides and keep slides from the water.
Superfrost Plus slide	Thermo Fisher	J1800AMNZ	Menzel-Gläser
FISH Tag DNA KIt	Invitrogen	F32947
GFP booster	Chromotek