Um método eficiente para Quantitativa, Análise de células Único de cromatina Modificação e Arquitetura Nuclear em Todo-mount óvulos em<em&gt; Arabidopsis</em

Resumo

Nós fornecemos aqui um protocolo eficiente e confiável para a imunocoloração, hibridação in situ fluorescente, a coloração do DNA seguido de quantitativo, imagem de alta resolução em Arabidopsis thaliana óvulos inteiros de montagem. Este método foi utilizado com sucesso para analisar as modificações da cromatina e arquitectura nuclear.

Resumo

Em plantas com flores, a transição destino de células somáticas-to-reprodutiva é marcada pela especificação de células-mãe de esporos (PMEs) em órgãos florais da planta adulta. O SMC feminino (célula mãe de megásporo, MMC) diferencia no primórdio óvulo e sofre meiose. O megásporo haplóide selecionado então sofre mitose para formar o gametófito multicelular feminino, o que dará origem aos gametas, o óvulo ea célula central, juntamente com células acessórias. A acessibilidade limitada do MMC, meiocyte e gametófito feminino no interior do óvulo é tecnicamente desafiador para citológico e análises citogenéticas em nível de célula única. Particularmente, imunodetecção directa ou indirecta de epítopos celulares ou nucleares é prejudicada pela falta de penetração dos reagentes no interior da célula vegetal e de uma única célula de imagem é demised pela falta de claridade óptica em todo-montagem tecidos.

Assim, desenvolvemos um método eficiente para analisar os nuclorganização orelha e modificação da cromatina em alta resolução de uma única célula em Todo-mount óvulos Arabidopsis incorporados. Ele baseia-se na incorporação de dissecção e óvulos fixos em uma fina camada de gel de acrilamida a uma lâmina de microscópio. Os óvulos embarcados são submetidos a tratamentos químicos e enzimáticos com o objetivo de melhorar a clareza do tecido e permeabilidade aos reagentes de positividade. Esses tratamentos preservar organização, DNA e proteínas epítopos celulares e cromatina. As amostras podem ser utilizadas para diferentes análises citológicas a jusante, incluindo a imunocoloração da cromatina, hibridação in situ fluorescente (FISH), e a coloração de ADN para análise de heterocromatina. Microscopia confocal a laser (CLSM) de imagem, com alta resolução, seguido de reconstrução 3D permite medições quantitativas na resolução de uma única célula.

Introdução

Em plantas com flores, o estabelecimento de linhagens de reprodução inicia-se com a diferenciação de células musculares lisas, MMC feminino e célula-mãe microspore masculino. A MMC desenvolve a partir de uma célula nucelar sub-epidérmica na ponta distal do primórdio óvulo, e a célula mãe micrósporos se desenvolve a partir de tecido esporogênico na antera lóculo, que estão localizados no fundo dos órgãos florais ^1. SMCs sofrer meiose para produzir esporos haplóides, que depois dão origem aos gametófitos sobre mitose. O gametófito feminino ou saco embrionário, consiste de uma célula-ovo, uma célula central, dois sinérgides e três antípodas. O gametófito masculino, ou o pólen, é composto de uma célula vegetativa e duas células espermáticas. Enquanto o gametófito masculino continua a ser um objeto de estudo-de-relativamente acessível, o gametófito feminino é incorporado dentro do óvulo, por sua vez incluído no carpelo flor, e, assim, coloca desafios específicos para análises moleculares e citológicas. Recentemente, no entanto, de laser assistidamicrodissection ofereceu uma solução elegante que permite análises transcriptomic no MMC e células gametófitos femininos ^2-4. Em adição à expressão do gene candidato analisa, por exemplo, utilizando ARN de hibridação in situ ou ensaios de gene repórter, análises citológicas permite investigar a dinâmica de componentes celulares endógenas utilizando coloração celular directa específica ou imunocoloração indirecta. Particularmente, coloração citogenética utilizando FISH e coloração do DNA, juntamente com imunocoloração de modificações da cromatina ou componentes de cromatina são abordagens centrais para elucidar a dinâmica da cromatina e organização nuclear em Arabidopsis ^5. Normalmente, a meiose implica dinâmica cromossômicas específicas que tem sido bem investigados em planta macho meiócitos ^6,7; ainda em grande escala, específico de célula cromatina reorganização, provavelmente refletindo a reprogramação epigenética dinâmica foi descrito durante o desenvolvimento do pólen ^8-10. Por outro lado, devidoà relativa inacessibilidade do meiocyte fêmea e gametófito, estas investigações continuam tecnicamente difíceis de aplicar, e exigem muitas vezes a dissecção de corte ou manual e digestão enzimática (ver abaixo). Além disso, o prevalente falta de clareza óptica em todo o monte é um obstáculo para imagens de alta resolução de células reprodutivas em óvulos intactas.

Um método clássico para a análise citológica da organização cromossômica em óvulos inteiros de montagem usa coloração de Feulgen ^11-13. Trata-se hidrólise ácida (utilizando um ácido hipocloroso) do ADN o que resulta em desnaturação das proteínas e, assim, causa a destruição da estrutura da cromatina. Alternativamente, organização cromossomo em meiócitos femininos e células gametófitos podem ser observados por meio da coloração DAPI e imunocoloração em seções semi-finas ou sacos de embriões dissecados e MMC (por exemplo ver ^14-18). Claramente, no entanto, a dissecção manual e corte pode ser de trabalho intensivo eimpede a análise qualitativa e quantitativa de um grande número de epítopos de cromatina.

Aqui nós fornecemos um protocolo eficiente para preparar um grande número de óvulos Arabidopsis adequados para uma variedade de coloração citológica jusante em todo-mount. Em breve, botões de flores são incubadas numa solução fixadora, linhas de óvulos são dissecados do carpelo e incorporado em acrilamida na corrediça, como feito para meiócitos pólen ^19,20. Os óvulos são incorporados mais afastada e fixadas em metanol, etanol, e xileno, antes da digestão da parede celular e permeabilização. São discutidas possíveis variações destes passos. As amostras podem em seguida ser utilizado para a coloração de ADN, a imunocoloração, e FISH. O modo de preparação é eficiente e permite a paralela conjunto experimental (até 16 lâminas pode ser preparado de um dia para análise a jusante diferente). Os tratamentos descritos permitem sinais homogêneas em todo-mount e bem preservado histológico, celular,e organização nuclear em células reprodutivas e células nucelares vizinhas que beneficiam comparações qualitativas e quantitativas entre os tipos de células. Calibrado, imagens de alta resolução baseado em CLSM seguido de reconstrução em 3 dimensões permite medições quantitativas significativas de sinais fluorescentes. Temos utilizado com sucesso este procedimento para analisar a dinâmica da cromatina no MMC diferenciando ²¹ e desenvolvendo gametófito feminino ^22; Apresentamos aqui resultados representativos de análise heterochromatin, immunostaining cromatina, GFP imunocoloração e peixes em todo-montagem óvulos. Além disso, acreditamos que o nosso protocolo irá ser adequado para outros tecidos e espécies vegetais.

Protocolo

O procedimento é descrito no fluxo de trabalho na Figura 1, e a configuração para a dissecção e a incorporação de tecidos são apresentados na Figura 2.

1. Fixação do tecido

1. Recolher 20-30 carpelos em um tubo de microcentrífuga contendo feita recentemente tampão fixador BVO em gelo.
2. Fixar o tecido 30 min com agitação suave à temperatura ambiente.
3. Girar os tubos contendo as carpelos em fixador em uma microcentrífuga de bancada 1 min a 400 x g.
4. Retire cuidadosamente o tampão fixador e adicionar 1 ml de PBT, colocar os tubos no gelo.

2. Dissection and Embedding

1. Preparar cinco tubos de Eppendorf com 200 ul de cada uma feita recentemente, 5% de mistura de acrilamida.
2. Prepare cinco lâminas Superfrost pré-limpos com etanol 70% e marcadas com um lápis.
3. Descongelar uma alíquota de 20% de EPA e 20% NaPS cada, em gelo.
4. Toma 4-5 carpelos com uma ponta de corte-end, lugarlos numa lâmina de limpeza, remover o excesso de líquido.
5. Faça cortes longitudinais com uma agulha fina e retire as paredes carpelo para liberar fileiras de óvulos como mostra a Figura 2, evitar a secagem cobrindo com PBS (não mais de 10 mL).
6. Adicione rapidamente e misturar 12 ml, 12 NaPS APS ul com uma alíquota de 200 mL da mistura de acrilamida.
7. Adicionar 30 ul da acrilamida activado para os óvulos dissecados.
8. Cubra com uma lamela mm 20 x 20, vamos polimerização à temperatura ambiente, 45-60 min.
9. Retirar as lamelas usando uma lâmina de barbear. Nesta fase, as amostras podem ser mantidas durante a noite a 4 ° C num frasco Coplin contendo PBS.

3. Processamento de Tecidos

NOTA: Todas as etapas, exceto 3.2.1, 3.2.3, 3.3.2 e 3.4.3 são realizadas em frascos Coplin com 80 ml da solução sob o capô química à temperatura ambiente. Slides são transferidos com um de ponta plana fórceps.

1. Clarificação tecido efixação:
   1. Incubar 5 min em metanol.
   2. Incubar 5 min em etanol.
   3. Incubar 30 minutos em etanol: xileno (1:1).
   4. Incubar 5 min em etanol.
   5. Incubar 5 min em metanol.
   6. Incubar 15 minutos em metanol e PBT (1:1), complementado com 2,5% de formaldeído.
   7. Lavar 2 x 10 minutos em PBT. Neste estágio, os slides podem ser mantidas durante a noite a 4 ° C.
2. Digestão da parede celular:
   1. Descongelar uma aliquota da mistura de digestão da parede celular em gelo.
   2. Tome um slide da jarra de Coplin, drenar o excesso de líquido, colocando-o verticalmente sobre uma toalha de papel.
   3. Adicione 100 ml de mistura de digestão da parede celular sobre a almofada de acrilamida e cobrir com uma lamela mm 23 x 46. Repita o procedimento para os demais slides. Incubar durante 2 horas a 37 ° C numa câmara húmida (descrito em Materiais).
   4. Lavar as lâminas 2 x 5 minutos em PBT.
3. RNase A de tratamento:
   1. Tome um slide da jarra de Coplin, escorra ªe o excesso de líquido, como antes.
   2. Incubar cada lâmina com 100 ul de ARNase A a 100 ng / mL em PBS com 1% de Tween-20 durante 1 hora a 37 ° C numa câmara húmida.
   3. Lavar as lâminas durante 2 x 5 minutos em PBT.
4. Pós-fixação e permeabilização:
   1. Post-correção para 20 min no recentemente feito PBT-F.
   2. Lavar as lâminas por 10 minutos em PBT.
   3. Permeabilizar durante 2 horas em PBS com 2% de Tween-20 a 4 ° C.
   4. Lavar as lâminas por 2 x 5 minutos em PBT.

4. Imunocoloração

NOTA: Para este passo, a concentração óptima do anticorpo primário tem de ser testada por meio de diferentes diluições (1:200, 1:500, 1:1000) dos anticorpos.

1. Incubar cada lâmina com 100 uL de anticorpo primário diluído em PBS com 0,2% de Tween-20 durante 12-24 horas a 4 ° C.
2. Lavar as lâminas em PBT durante 2-4 horas à temperatura ambiente, sob agitação suave.
3. Aplique o1:200 de anticorpo secundário em PBS + 0,2% de Tween-20 durante 24 horas a 4 ° C.
4. Lavar as lâminas em PBT durante uma hora à temperatura ambiente, sob agitação suave.
5. Contracoloração com 10 ug / ml de iodeto de propidio em PBS durante 15 minutos, depois enxaguar 15 min em PBS, sob agitação suave, à temperatura ambiente.
6. Monte em anti-desbotamento montagem líquido suplementado com 10 mg / ml de iodeto de propídio. Deixe o meio de montagem endurecer por 1 hora antes de adquirir imagens por CLSM.

5. Imagens quantitativas

1. A aquisição de imagens:
   1. Adquirir imagens de alta resolução usando CLSM, o ideal é usar um modo de digitalização de ressonância, o que permite uma melhor preservação dos sinais fluorescentes sobre imagem prolongada ^23, e uma lente de imersão 63X de glicerol.
   2. Teste os parâmetros de aquisição, como a intensidade do laser, o ganho, pinhole, tamanho voxel e fator de zoom no início do experimento para definir um procedimento de aquisição padrão a seguir rigorosamente todotodos os slides para medições quantitativas consistentes.
   3. Determinar a ausência de cross-talk entre fluorocromos. Se estiver presente, configurar uma verificação seqüencial. Adquirir imagens de transmissão separadamente e não simultaneamente.
   4. Realize serial, aquisição de imagem tridimensional com resolução mais alta possível nos dimensões X e Y e com oversampling 2x na dimensão z (regra de Nyquist).
2. Processamento de imagem:
   1. Reconstruir imagens de série em três dimensões usando o software de fonte comercial ou aberto.
   2. Definir superfícies de contorno ao redor de cada núcleo (ou célula) de interesse em 3D.
   3. Quantificar a fluorescência em cada canal, como a soma da intensidade dos pixels de cada objecto.
   4. Exportar os dados para o Excel para análises estatísticas. Normalizar sinais de anticorpos contra os sinais de coloração, por exemplo DNA.

Resultados

Nós fornecemos um protocolo robusto para a preparação em grande escala e de processamento de óvulos Arabidopsis adequados para exames citológicos em todo-mount. Graças à incorporação, os óvulos manter uma estrutura 3-dimensional (Figura 3). Além disso, o processamento de tecidos, incluindo esclarecimento de imagem óptico permite estruturas subcelulares em alta resolução. Figura 4 mostra a coloração de DNA em todo primórdios óvulo de montagem onde heterochromat...

Discussão

Em plantas com flores, a linhagem reprodutor feminino é cercado por várias camadas de células, incluindo o nucelo e os tegumentos óvulo, tornando assim a coloração citológica em toda montagem tecnicamente desafiador. Aqui apresentamos um protocolo eficiente que permite a preparação e processamento de um grande número de óvulos adequados para a coloração citológica como imunomarcação, a coloração do DNA e hibridização fluorescente in situ no todo-mount. Foi utilizado com sucesso para...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Solutions
BVO Fixation Buffer (based on32)			2 mM EGTA, pH 7.5, 1% (v/v) formaldehyde, 10% DMSO, 1x PBS, 0.1% Tween-20
PBT			1x PBS, 0.1% Tween-20
PBT-F			1x PBT, 2.5% (v/v) formaldehyde
30% acrylamide:bisacrylamide			3 g acrylamide, 0.33 g bisacrylamide, 1x PBS (prepare 10 ml, store at 4 °C)
200 ml 5% acrylamide mix in PBS			34 ml 30% acrylamide:bisacrylamide, 166 ml 1x PBS (make fresh from 30% stock)
20% ammoniumpersulfte			0.2 g ammoniumpersulfte, 1 ml sterile water (prepare aliquots with 1 ml and store at -20 °C)
20% sodium sulfite			0.2 g sodium sulfite, 1 ml sterile water (prepare aliquots with 1 ml and store at -20 °C)
Cell wall enzyme mix			0.5% (w/v) cellulase, 1% (w/v) driselase, 0.5% (w/v) pectolyase
Reagents and Materials
Formaldehyde	Sigma-Aldrich	F1635
DMSO	Sigma	D5879
Tris	Amaresco	0497
Ethanol	Schaurlau	ET00102500
Methanol	Schaurlau	ME03062500
Xylene	ROTH	4436.1
Cellulase	Sigma	1794
Driselase	Sigma	D8037
pectolyase	Sigma	P5936
Tween-20	Merck	8.22184.0500
EGTA	Sigma	E-4378
acrylamide	Sigma	A-3553
bisacrylamide	Sigma	M2022	toxic
ammoniumpersulfate	Sigma	A9164
Sodium sulfite	Fluka	71988
Anti-trimethyl-Histone H3 (Lys4)	Upstate	07-473
Anti- monomethyl-Histone H3 (Lys27)	Upstate	07-448
Alexa Fluor 488~goat ~anti ~rabbit (H+L)	Molecular Probe	A11008
ProlongGold	Invitrogen	P36934
Propidium iodide	Sigma	P4170	toxic
DAPI	Sigma	D9542	toxic
RNAse A	Roche	10109169001
Coplin jar	Huber & CO	10.055
Forceps	DUMONT BIOLOGY
Shaker	Heidolph	543-12310-00-0
Moist chamber			A plastic box with damp paper towel inside, a plastic support is put into the box for supporting the slides and keep slides from the water.
Superfrost Plus slide	Thermo Fisher	J1800AMNZ	Menzel-Gläser
FISH Tag DNA KIt	Invitrogen	F32947
GFP booster	Chromotek