전체 마운트 난자에있는 염색질 수정 및 핵 구조의 정량, 단일 세포 분석을위한 효율적인 방법<em&gt; 애기 장대</em

요약

우리는 면역 염색, 형광 제자리 교잡, 전체 마운트 애기 장대 난자의 양적, 고해상도 이미징 다음 DNA 염색 여기를 효율적이고 신뢰할 수있는 프로토콜을 제공합니다. 이 방법은 성공적 염색질 변형 및 핵 구조를 분석하는데 사용 하였다.

초록

꽃 피는 식물에서 체세포 - 투 - 생식 세포의 운명 전환은 성인 식물의 꽃 장기에 포자 어머니 세포의 사양 (SMCS)로 표시됩니다. 여성 SMC (megaspore 어머니 세포, MMC)는 난자 primordium의 차별화 및 감수 분열을 겪는다. 선택된 반수체 megaspore는 함께 액세서리 세포, 생식 세포에 상승을 줄 것이다 다세포 여성 배우체, 난자와 중앙 셀을 형성하기 위해 유사 분열을 겪는다. 난자 내부의 MMC, meiocyte과 여성 배우체의 제한된 접근성은 세포학에 대한 기술적 도전과 세포 유전은 단일 세포 수준에서 분석한다. 특히, 세포 핵 항원의 직접 또는 간접 면역이 식물 세포 및 단일 세포 이미징 내부의 시약의 가난한 침투에 의해 손상은 전체 마운트 조직에 광학 선명도의 부족에 의해 demised된다.

따라서, 우리는 nucl을 분석 할 수있는 효율적인 방법을 개발전체 마운트 포함 된 애기 장대의 난자에 하나의 셀의 높은 해상도에서 귀 조직과 염색질 수정. 이것은 현미경 슬라이드에 아크릴 아마이드 겔의 박층의 박리 및 고정 난자의 매립에 기초한다. 내장 된 난자는 면역 염색 시약으로 조직의 명확성과 침투성을 향상을 목표로 화학 및 효소 처리를 실시하고 있습니다. 그 치료는 세포 및 염색질 조직, DNA와 단백질 항원을 유지합니다. 샘플은 염색질 면역 염색, 원위치 혼성화 (FISH) 형광 및 이질 분석을위한 DNA 염색 등 다른 하류 세포 학적 분석을 위해 사용될 수있다. 3D 재구성 다음에 높은 해상도를 가진 공 초점 레이저 주사 현미경 (CLSM) 영상은, 단일 셀 해상도에서 정량 측정 할 수 있습니다.

서문

꽃 식물의 생식 계통의 설립은 SMCS의 차별화, 여성 MMC 및 남성 microspore 어머니 세포로 시작합니다. MMC는 난자 primordium의 원심 끝에서 하위 표피 nucellar 세포에서 개발하고 microspore 어머니 세포 깊은 꽃 기관 ^(1)의 내부에 위치하는 꽃밥 locule에 sporogenous 조직에서 개발하고 있습니다. SMCS는 유사 분열시 배우체로 야기 반수체 포자를 생산하는 세포의 감수 분열을 받다. 여성 배우체, 또는 배아 골목, 하나의 난자, 하나의 중앙 세포, 두 synergids 세 antipodals으로 구성되어 있습니다. 남성 배우체, 또는 꽃가루는, 하나의 식물 세포와 두 개의 정자 세포로 구성되어 있습니다. 남성 배우체가 상대적으로 접근 객체의 학습 남아있는 동안, 여성 배우체는 자체가 꽃 심피 묶인 난자 내부에 포함하고, 따라서 분자 및 세포 학적 분석에 대한 특정 문제를 제기한다. 그러나 최근에는 레이저를 이용한미세 절제는 transcriptomic는 MMC와 여성 gametophytic 세포 ^2-4의 분석을 허용하는 훌륭한 솔루션을 제공했다. 후보 유전자 발현뿐만 아니라 세포 학적 분석은 특정 직접 세포의 염색 또는 간접적으로 면역 염색을 사용하여 내인성 세포 구성 요소의 역학을 조사, 현장 하이브리드 또는 리포터 유전자 분석의 예 RNA를 허용하여, 분석한다. 특히, 함께 염색질 수정이나 염색질 구성 요소의 면역 염색으로, 생선, DNA 염색을 이용하여 세포 유전 학적 염색은 애기 장대 ⁵ 염색질 역학과 핵 조직을 명료하게 중심 접근 방식이다. 일반적으로 세포의 감수 분열이 아니라 ^6,7 meiocytes 식물 남성에서 조사 된 특정 염색체의 역 동성을 수반한다; 가능성이 동적 성적인 프로그래밍을 반영하는 더 큰 규모의 셀 특정 염색질 재구성, 꽃가루 개발 ^{8 ~ 10시에} 설명되어 있습니다. 대조적으로 인해여성 meiocyte와 배우체의 상대적 어려움에,이 조사는 적용 할 기술적으로 어려운 남아 있고, 자주 (아래 참조) 단면 또는 수동 해부 및 소화 효소를 필요로한다. 또, 전체의 실장 광학 명확성 널리 부족 그대로 난자의 생식 세포의 고해상도 영상에 장애물이다.

전체 마운트 난자의 염색체 조직의 세포 학적 분석을위한 고전적인 방법은 Feulgen의 염색 ^{11 ~ 13을} 사용합니다. 이는 단백질 변성을 초래하고, 따라서 염색질 구조의 파괴를 일으키는 DNA의 (차아 염소산을 이용하여) 산 가수 분해를 수반한다. 또한, 여성 meiocytes 및 gametophytic 세포의 염색체 조직 (예를 들어 ^{14 ~ 18 참조)} 세미 얇은 부분 또는 해부 배아 주머니와 MMC에 DAPI 염색과 면역 염색을 이용하여 관찰 할 수있다. 분명히, 그러나, 수동 해부 및 절편은 노동 집약적이 될 수 있습니다염색질 에피토프의 다수의 정성 및 정량 분석​​을 방해한다.

여기에서 우리는 전체 마운트 하류 세포 학적 염색의 다양한 적합한 애기 난자의 큰 숫자를 준비하는 효율적인 프로토콜을 제공합니다. 간단히, 꽃 봉오리가 정착 용액에 배양, 난자의 행은 심피에서 해부하고 꽃가루 meiocytes ^{(19, 20)에} 대해 수행으로 슬라이드에 아크릴 아미드에 포함. 내장 된 난자는 더 메탄올, 에탄올, 세포 벽 소화 permeabilization 전에 자일 렌에서 지워 고정되어 있습니다. 이 단계의 가능한 변화는 설명합니다. 샘플은 DNA 염색, 면역 염색, 물고기를 사용할 수 있습니다. 준비 모드는 효율적이며 (최대 16 슬라이드를 다른 다운 스트림 분석을 위해 하루에 제조 할 수있다) 병렬 실험 장치 할 수 있습니다. 설명 치료, 전체 마운트에 균일 한 신호를 활성화하고 잘 조직 학적, 세포의 보존세포 유형 간의 질적 및 양적 비교에 도움이 생식 세포와 주변 nucellar 세포에서 핵 조직. 보정, 3 차원 재구성 다음 CLSM 기반의 고해상도 영상은 형광 신호의 의미있는 정량적 인 측정이 가능합니다. 우리는 성공적으로 차별화 된 MMC ^(21)과 여성 배우체 ^{22 개발에} 염색질의 역학을 분석하기 위해이 절차를 사용; 우리는 여기에서 전체 마운트 난자의 이질 염색질 분석, 크로 마틴 면역 염색, GFP의 면역 염색과 물고기의 대표적인 결과를 제시한다. 우리는 또한 우리의 프로토콜이 다른 식물 조직 및 종에 적합 할 것이라고 믿는다.

프로토콜

절차는 그림 1에서 워크 플로에 ​​설명하고, 해부 및 조직의 매립에 대한 설정은 그림 2에 나타내었다.

1. 조직 고정

1. 얼음에 갓 만든 BVO 정착액 버퍼를 포함하는 미세 원심 분리 튜브에 20 ~ 30 심피를 수집합니다.
2. 부드러운 실온에서 진탕 조직 30 분 수정.
3. 400 X g에서 벤치 탑 마이크로 원심 1 분에 정착의 심피가 들어있는 튜브를 스핀.
4. 주의 깊게 정착 버퍼를 제거하고 PBT 1 ㎖​​를 추가, 얼음에 튜브를 배치합니다.

2. 해부 및 포함

1. 갓 만든, 5 %의 아크릴 아미드의 혼합 각각 200 ㎕ 씩 다섯 에펜 도르프 튜브를 준비합니다.
2. 다섯 Superfrost 슬라이드를 70 % 에탄올로 미리 청소하고 연필로 표시를 준비합니다.
3. 한 20 % APS의 나누어지는 얼음에 20 % 낮잠 각을 해동.
4. 컷 엔드 팁, 장소 4-5 심피을깨끗한 슬라이드에 그들, 액체의 초과를 제거합니다.
5. 미세 바늘 길이 상처를 확인하고 그림과 그림 2와 난자의 행을 해제 할 심피 벽을 분리, PBS (이하 10 μL)로 덮어서 건조하지.
6. 빨리 12 ㎕의 낮잠, 200 ㎕의 아크릴 아미드 믹스의 나누어지는 12 μL APS를 추가하고 혼합한다.
7. 해부 난자에 활성화 된 아크릴 아미드의 30 μl를 추가합니다.
8. 20 X 20mm의 커버 슬립 커버, 실내 온도, 45 ~ 60 분에서 중합 할 수 있습니다.
9. 면도날을 사용하여 커버 슬립을 제거합니다. 이 단계에서, 샘플은 PBS를 포함하는 코 플린 항아리에서 4 ° C에서 하룻밤 동안 유지 될 수있다.

3. 조직 처리

참고 : 3.2.1, 3.2.3, 3.3.2과 3.4.3를 제외한 모든 단계는 상온에서 화학 후드 아래에 80 ㎖의 용액으로 코 플린 단지에서 실시된다. 슬라이드에는 평면 팁 집게로 전송됩니다.

1. 조직의 설명과고정 :
   1. 메탄올에서 5 분 알을 품다.
   2. 에탄올에 5 분을 품어.
   3. 크실렌 (1:1) : 에탄올에 30 분 알을 품다.
   4. 에탄올에 5 분을 품어.
   5. 메탄올에서 5 분 알을 품다.
   6. 2.5 %의 포름 알데히드와 보완, 메탄올, PBT (1:1)에 15 분 알을 품다.
   7. PBT에서 2 × 10 분을 씻어. 이 단계에서, 슬라이드는 4 ℃에서 하룻밤 동안 유지 될 수있다
2. 세포벽 분해 :
   1. 얼음 세포벽 분해 믹스의 분취 량을 해동.
   2. 종이 타월에 수직으로 배치하여 액체의 과잉 배출, 코 플린 항아리에서 슬라이드를 타고.
   3. 아크릴 아미드 패드에 세포벽 분해 혼합 100 μl를 추가하고 23 X 46mm의 coverslip을 커버. 다른 슬라이드에 대해 반복합니다. (자료 참조) 습기 챔버에서 37 ° C에서 2 시간 동안 배양한다.
   4. PBT에서 슬라이드 2 × 5 분을 씻으십시오.
3. 치료의 RNase :
   1. 코 플린 항아리에서 슬라이드를 타고, 일 드레인이전과 액체의 전자 과잉.
   2. 1 % 트윈 20 1 시간 동안 37 ° C에서 습기 챔버와 PBS에서 100 ㎍ / ml로 RNAseA 100 ㎕ 씩 각 슬라이드를 품어.
   3. PBT에서 2 × 5 분 동안 슬라이드를 씻으십시오.
4. 후 고정 및 permeabilization :
   1. 갓 만든 PBT-F에서 20 분 동안 후 고정합니다.
   2. PBT에서 10 분 동안 슬라이드를 씻어.
   3. 4 ℃에서 2 % 트윈 (20)와 PBS에서 2 시간 동안 투과
   4. PBT에서 2 × 5 분 동안 슬라이드를 씻어.

4. 면역 염색

NOTE :이 단계에서, 일차 항체의 최적 농도는 서로 다른 희석 항체 (1:200, 1:500, 1:1000)를 사용하여 시험해야한다.

1. 4 ℃에서 12 ~ 24 시간 동안 0.2 % 트윈 (20)와 PBS에 희석 차 항체 100 ㎕ 씩 각 슬라이드를 품어
2. 부드러운 흔들림에 따라 실온에서 2-4 시간 동안 PBT에서 슬라이드를 씻으십시오.
3. 적용이차 항체 1:200 PBS + 0.2 % 트윈 20 ~ 24 시간 동안 4 ℃에서
4. 부드러운 흔들림에 따라 실온에서 1 시간 동안 PBT에서 슬라이드를 씻으십시오.
5. 15 분 동안 PBS에서 10 ㎍ / ㎖의 프로피 디움 요오드화물로 Counterstain 후 실온에서 부드럽게 진탕 PBS에서 15 분간 린스.
6. 반대로 퇴색 액체의 mountant 마운트는 10 ㎍ / ㎖의 프로피 디움 요오드 보충. 설치 매체가 CLSM으로 이미지를 획득하기 전에 1 시간 동안 강화하자.

5. 정량 이미징

1. 이미지 수집 :
   1. 이상적으로 더 장시간 촬상 ²³ 이상의 형광 신호의 보존 및 63X 글리세롤 침지 렌즈를 허용 공진 스캐닝 모드를 이용하여, CLSM을 이용한 고해상도 이미지를 획득.
   2. 엄격히 걸쳐 따르도록 표준 획득 절차를 정의하기 위해 이러한 실험의 시작에서 레이저 강도, 게인, 핀홀, 복셀의 크기 및 줌 배율 등 획득 파라미터를 테스트일관성있는 정량적 측정을위한 모든 슬라이드.
   3. 형광 색소 사이의 크로스 토크 (cross-talk)이 없음을 확인합니다. 존재하는 경우, 순차적 스캔을 설정합니다. 따로 따로가 아니라 동시에 전송 이미지를 획득.
   4. x 및 y 차원에서 가능한 가장 높은 해상도와 Z 치수 (나이 퀴 스트의 규칙)의 2 배 오버 샘플링과 시리얼, 입체 영상 획득을 수행합니다.
2. 이미지 처리 :
   1. 상업용 또는 오픈 소스 소프트웨어를 사용하여 세 가지 차원에서 일련의 이미지를 재구성.
   2. 3D에 대한 관심의 각 핵 (또는 셀)의 주위에 윤곽 표면을 정의합니다.
   3. 각 개체의 픽셀 강도의 합으로 각 채널에 형광의 양을.
   4. 통계 분석을위한 데이터를 Excel로 내 보냅니다. 예를 들면 DNA 염색 신호에 대한 항체 신호를 정상화.

결과

우리는 전체 마운트의 세포 학적 염색에 적합한 애기 난자의 대규모 준비 및 처리를위한 강력한 프로토콜을 제공합니다. 매립 덕분에, 난자는 3 차원 구조 (그림 3)를 유지한다. 또한, 광학 설명을 포함하여 조직 처리는 높은 해상도로 영상 세포 내 구조를 가능하게한다. 4 이질 염색질이 (더 디컨 볼 루션이 그림에 사용되지 않았다)도 눈에 초점을 정의, 밝은 표시 ?...

토론

꽃 피는 식물에서 여성의 생식 계통 따라서 기술적으로 도전적인 전체 마운트의 세포 학적 염색법을 렌더링, nucellus와 난자 teguments를 포함한 여러 세포 층에 의해 둘러싸여 있습니다. 여기에서 우리는 전체 마운트의 현장 하이브리드의 면역 염색, DNA 염색 및 형광으로 세포 학적 염색에 적합한 난자의 많은 수의 준비 및 처리를 가능하게하는 효율적인 프로토콜을 제시한다. 우리는 성공적 <...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Solutions
BVO Fixation Buffer (based on32)			2 mM EGTA, pH 7.5, 1% (v/v) formaldehyde, 10% DMSO, 1x PBS, 0.1% Tween-20
PBT			1x PBS, 0.1% Tween-20
PBT-F			1x PBT, 2.5% (v/v) formaldehyde
30% acrylamide:bisacrylamide			3 g acrylamide, 0.33 g bisacrylamide, 1x PBS (prepare 10 ml, store at 4 °C)
200 ml 5% acrylamide mix in PBS			34 ml 30% acrylamide:bisacrylamide, 166 ml 1x PBS (make fresh from 30% stock)
20% ammoniumpersulfte			0.2 g ammoniumpersulfte, 1 ml sterile water (prepare aliquots with 1 ml and store at -20 °C)
20% sodium sulfite			0.2 g sodium sulfite, 1 ml sterile water (prepare aliquots with 1 ml and store at -20 °C)
Cell wall enzyme mix			0.5% (w/v) cellulase, 1% (w/v) driselase, 0.5% (w/v) pectolyase
Reagents and Materials
Formaldehyde	Sigma-Aldrich	F1635
DMSO	Sigma	D5879
Tris	Amaresco	0497
Ethanol	Schaurlau	ET00102500
Methanol	Schaurlau	ME03062500
Xylene	ROTH	4436.1
Cellulase	Sigma	1794
Driselase	Sigma	D8037
pectolyase	Sigma	P5936
Tween-20	Merck	8.22184.0500
EGTA	Sigma	E-4378
acrylamide	Sigma	A-3553
bisacrylamide	Sigma	M2022	toxic
ammoniumpersulfate	Sigma	A9164
Sodium sulfite	Fluka	71988
Anti-trimethyl-Histone H3 (Lys4)	Upstate	07-473
Anti- monomethyl-Histone H3 (Lys27)	Upstate	07-448
Alexa Fluor 488~goat ~anti ~rabbit (H+L)	Molecular Probe	A11008
ProlongGold	Invitrogen	P36934
Propidium iodide	Sigma	P4170	toxic
DAPI	Sigma	D9542	toxic
RNAse A	Roche	10109169001
Coplin jar	Huber & CO	10.055
Forceps	DUMONT BIOLOGY
Shaker	Heidolph	543-12310-00-0
Moist chamber			A plastic box with damp paper towel inside, a plastic support is put into the box for supporting the slides and keep slides from the water.
Superfrost Plus slide	Thermo Fisher	J1800AMNZ	Menzel-Gläser
FISH Tag DNA KIt	Invitrogen	F32947
GFP booster	Chromotek