Eine effiziente Methode zur quantitativen, Einzel-Zell-Analyse von Chromatin Modifikation und Reaktor Architektur in Whole-Mount-Samenanlagen in<em&gt; Arabidopsis</em

Zusammenfassung

Wir bieten hier eine effiziente und zuverlässige Protokoll für die Immunfärbung, Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung, DNA-Färbung, gefolgt von quantitativen und hochauflösende Bildgebung in der whole-mount Arabidopsis thaliana Samenanlagen. Diese Methode wurde erfolgreich eingesetzt, um Chromatin-Modifikationen und Zellkernarchitektur zu analysieren.

Zusammenfassung

In blühenden Pflanzen ist der somatisch-to-Keimzelle Schicksal Übergang von der Spezifikation der Sporenmutterzellen (SMCs) in Blütenorgane der erwachsenen Pflanze markiert. Die weibliche SMC (Megaspore Mutterzelle, MMC) unterscheidet in der Samenanlage Primordium und Meiose. Das ausgewählte haploiden Megaspore läuft dann Mitose die vielzelligen weiblichen Gametophyten, die zu den Gameten geben wird, die Eizelle und Zentralzellen bilden zusammen mit akzessorischen Zellen. Die begrenzte Zugänglichkeit der MMC, meiocyte und weiblichen Gametophyten innerhalb der Samenanlage ist technisch anspruchsvoll für die zytologische und zytogenetische Analysen auf Einzelzellebene. Insbesondere ist eine direkte oder indirekte Immundetektion von zellulären oder Kern Epitope durch schlechte Penetration der Reagenzien innerhalb der Pflanzenzelle und Einzelzellenabbildungs ​​beeinträchtigt wird durch den Mangel an optischer Klarheit in whole-mount Gewebe demised.

So eine effiziente Methode, um die nucl analysieren entwickelten wirOhr Organisation und Chromatin-Modifikation bei hoher Auflösung von Einzelzell ganz-Mount eingebettet Arabidopsis Samenanlagen. Es ist auf Dissektion und Einbettung von festen Eizellen in einer dünnen Schicht aus Acrylamid-Gel auf einen Objektträger beruht. Die Samenanlagen eingebettet werden, um chemische und enzymatische Behandlungen zur Verbesserung der Gewebe Klarheit und Durchlässigkeit für die Immunfärbung Reagenzien unterzogen. Diese Behandlungen erhalten zellulären und Chromatin-Organisation, DNA-und Protein-Epitope. Die Proben können für unterschiedliche nachgeschaltete zytologische Analysen einschließlich Chromatin Immunfärbung, Fluoreszenz in situ Hybridisierung (FISH), und DNA-Färbung für Heterochromatin Analyse verwendet werden. Die konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie (CLSM) Bildgebung mit hoher Auflösung, gefolgt von 3D-Rekonstruktion erlaubt eine quantitative Messungen an Einzelzellauflösung.

Einleitung

In blühenden Pflanzen, die Einrichtung von Fortpflanzungslinien beginnt mit der Differenzierung von SMC, MMC weiblichen und männlichen Pollenmutterzelle. Die MMC entwickelt sich aus einer Unter nucellar epidermalen Zelle an der distalen Spitze der Samenanlage primordium und die Pollenmutterzellen entwickelt von sporenbildenden Gewebes in der Anthere locule, die tief in den Blütenorganen ¹ angeordnet sind. SMCs Meiose haploide Sporen, die dann führen zu den Gametophyten bei der Mitose zu produzieren. Der weibliche Gametophyt oder Embryosack, besteht aus einer Eizelle, einer Zentralzelle, zwei und drei Synergiden antipodals. Der männliche Gametophyt oder Pollen, wird von einem vegetative Zelle und zwei Spermazellen zusammengesetzt. Während die männlichen Gametophyten bleibt ein relativ zugänglich Objekt-of-Studie wird die weiblichen Gametophyten innerhalb der Samenanlage eingebettet ist, sich selbst in der Blüte Fruchtblatt umschlossen und damit besondere Herausforderungen, um molekulare und zytologische Analysen. Kürzlich jedoch lasergestützteMikrodissektion bot eine elegante Lösung, die Transkriptom-Analysen in der MMC und weiblichen Zellen gametophytische ^2-4. Neben den Kandidaten-Gen-Expressionsanalysen, zB mit RNA in situ Hybridisierung oder Reporter-Gen-Assays, zytologische Analysen ermöglicht die Untersuchung der Dynamik der endogenen zellulären Komponenten mit spezifischen zellulären direkte oder indirekte Immunfärbung. Insbesondere zytogenetische Färbung mit FISH und DNA-Färbung zusammen mit Immunfärbung von Chromatin-Veränderungen oder Chromatin-Komponenten sind zentrale Ansätze zur Chromatin-Dynamik und Atom-Organisation in Arabidopsis ⁵ aufzuklären. Typischerweise bringt Meiose spezifische Chromosomendynamik, die auch in pflanzlichen männlichen sucht wurde meiocytes ^6,7; weitere Groß, zellspezifische Chromatin Reorganisation wahrscheinlich reflektiert dynamische epigenetische Reprogrammierung während der Pollenentwicklung ^10.8 beschrieben. Im Gegensatz dazu aufgrundder relativen Unzugänglichkeit des weiblichen Gametophyten meiocyte und bleiben diese Untersuchungen technisch schwierig anzuwenden, und erfordern oft Schnitte oder manuelle Präparation und enzymatische Verdauung (siehe unten). Darüber hinaus ist die vorherrschende Mangel an optischer Klarheit ganz-mount ein Hindernis für die hochauflösende Bildgebung von Keimzellen in intakten Eizellen.

Eine klassische Methode für die zytologische Analyse der Chromosomenorganisation in whole-mount Eizellen verwendet Feulgen-Färbung ^13.11. Es handelt Säurehydrolyse (unter Verwendung unterchlorige Säure) der DNA, die in Protein-Denaturierung und damit zu Zerstörungen führt der Chromatinstruktur. Alternativ kann Chromosom Organisation in der weiblichen meiocytes und gametophytische Zellen mit DAPI-Färbung und Immunfärbung auf Semidünnschnitten oder seziert Embryosäcke und MMC (siehe beispielsweise ^14-18) beobachtet werden. Fest steht jedoch, manuelle Präparation und Schnitte kann arbeitsintensiv sein undbehindert die qualitative und quantitative Analyse einer Vielzahl von Chromatin-Epitope.

Hier bieten wir eine effiziente Protokoll, um eine große Anzahl von Arabidopsis Samenanlagen geeignet für eine Vielzahl von nachgelagerten zytologische Färbung im gesamten Montage vorzubereiten. Kurz gesagt, sind Blütenknospen in einer Fixierungslösung inkubiert werden Zeilen von Eizellen aus dem Fruchtblatt seziert und in Acrylamid eingebettet auf Folie wie für Pollen meiocytes ^19,20 getan. Die eingebetteten Samenanlagen weiter geklärt und in Methanol, Ethanol und Xylol vor der Zellwand Verdauung und Permeabilisierung befestigt. Mögliche Variationen dieser Schritte werden diskutiert. Die Proben können dann für DNA-Färbung, Immunfärbung und FISH verwendet werden. Der Vorbereitungsmodus ist effizient und ermöglicht parallele Versuchsaufbau (bis zu 16 Objektträger kann an einem Tag für unterschiedliche nachgeschaltete Analyse vorbereitet werden). Die beschriebenen Behandlungen ermöglichen homogene Signale in Vollmontage und gut erhaltenen histologischen, Mobilfunk,und Kernorganisation in Keimzellen und die umliegenden nucellar Zellen, die qualitative und quantitative Vergleiche zwischen Zelltypen profitieren. Kalibriert, CLSM-basierte hochauflösende Bildgebung, gefolgt von 3-dimensionalen Rekonstruktion ermöglicht aussagekräftige quantitative Messungen von Fluoreszenzsignalen. Wir dieses Verfahren erfolgreich eingesetzt, um Chromatin-Dynamik in der Differenzierung und Entwicklung von ^MMC-21 weiblichen Gametophyten ²² zu analysieren; wir hier präsentieren, repräsentative Ergebnisse von Heterochromatin-Analyse, Immunfärbung Chromatin, GFP-Immunfärbung und FISH in whole-mount Samenanlagen. Wir glauben weiterhin, dass unser Protokoll wird für andere Pflanzengewebe und Arten sein.

Protokoll

Das Verfahren wird im Arbeitsablauf in Fig. 1 beschrieben, und die Einrichtung für die Präparation und Einbetten von Geweben sind in Figur 2 dargestellt.

1. Gewebefixierung

1. Sammeln 20-30 Fruchtblätter in ein Mikrozentrifugenröhrchen mit frisch gemacht BVO Fixierungspuffer auf Eis.
2. Fix das Gewebe 30 min unter leichtem Schütteln bei Raumtemperatur.
3. Drehen Sie die Rohre, die die Fruchtblätter in Fixiermittel in einer Tischmikrozentrifuge 1 min bei 400 x g.
4. Entfernen Sie vorsichtig die Fixierungspuffer und 1 ml PBT, legen Sie die Röhrchen auf Eis.

2. Dissection and Embedding

1. Bereiten fünf Eppendorf-Röhrchen mit je 200 ul einer frisch zubereiteten, 5% Acrylamid-Mix.
2. Vorbereitung fünf Superfrost Objektträger mit 70% Ethanol vorgereinigt und mit einem Bleistift markiert.
3. Tauwetter ein Aliquot von 20% und 20% APS NaPS je, auf Eis.
4. Nehmen Sie 4-5 Fruchtblättern mit einem Cut-Endrohr, Ortsie auf einen sauberen Objektträger, entfernen Sie das überschüssige Flüssigkeit.
5. Machen Längsschnitte mit einer feinen Nadel und nehmen die Fruchtblatt Wände, um Reihen von Samenanlagen wie gezeigt Abbildung 2 zu lösen, vermeiden Trocknung durch Abdecken mit PBS (nicht mehr als 10 ul).
6. Schnelles Hinzufügen und mischen 12 ul NaPS, 12 ul APS mit einem Aliquot von 200 ul Acrylamid-Mix.
7. In 30 ul der Aktiv Acrylamid auf die Samenanlagen seziert.
8. Deckel mit einem 20 x 20 mm Deckglas, lassen Sie polymerisieren bei Raumtemperatur 45-60 min.
9. Entfernen Sie das Deckglas mit einer Rasierklinge. In diesem Stadium können die Proben über Nacht bei 4 ° C in einer Glasküvette mit PBS aufbewahrt.

3. Gewebeverarbeitung

HINWEIS: Alle Schritte außer 3.2.1, 3.2.3, 3.3.2 und 3.4.3 sind in Coplin Gläser mit 80 ml Lösung unter der chemischen Abzug bei Raumtemperatur durchgeführt. Folien sind mit einem Flachbild-Spitze Pinzette übertragen.

1. Tissue Klärung undFixierung:
   1. Inkubation 5 min in Methanol.
   2. Inkubation 5 min in Ethanol.
   3. Inkubieren 30 min in Ethanol: Xylol (1:1).
   4. Inkubation 5 min in Ethanol.
   5. Inkubation 5 min in Methanol.
   6. Inkubieren 15 min in Methanol und PBT (1:1) mit 2,5% Formaldehyd ergänzt.
   7. Spülen Sie 2 x 10 min in PBT. In diesem Stadium können Folien über Nacht bei 4 ° C aufbewahrt werden
2. Zellwand Verdauung:
   1. Tauwetter ein Aliquot der Zellwand Verdauung Mix auf Eis.
   2. Nehmen Sie eine Folie aus der Glasküvette, lassen Sie das überschüssige Flüssigkeit, indem Sie sie senkrecht auf einem Papiertuch.
   3. 100 l Zellwand Verdauung Mix über die Acrylamid-Pad und mit einem 23 x 46 mm Deckglas. Wiederholen Sie dies für die anderen Folien. Inkubation für 2 h bei 37 ° C in einer feuchten Kammer (in Materials beschrieben).
   4. In PBT Waschen Sie die Folien 2 x 5 min.
3. RNase A-Behandlung:
   1. Nehmen Sie eine Folie aus der Glasküvette, abtropfen the überschüssige Flüssigkeit wie zuvor.
   2. Inkubieren jede Folie mit 100 ul RNAseA bei 100 ug / ml in PBS mit 1% Tween-20 für 1 h bei 37 ° C in einer feuchten Kammer.
   3. Für 2 x 5 min in PBT Waschen Sie die Dias.
4. Post-Fixierung und Permeabilisierung:
   1. Post-fix für 20 min in frisch gemachte PBT-F.
   2. Spülen Sie die Objektträger für 10 min in PBT.
   3. Durchdringbar für 2 h in PBS mit 2% Tween-20 bei 4 ° C
   4. Spülen Sie die Folien für 2 x 5 min in PBT.

4. Immunfärbung

HINWEIS: Bei diesem Schritt hat die optimale Konzentration des primären Antikörpers durch Verwendung von verschiedenen Verdünnungen (1:200, 1:500, 1:1000) der Antikörper getestet werden.

1. Inkubieren jede Folie mit 100 ul des primären Antikörpers in PBS mit 0,2% Tween-20 verdünnt 12-24 Stunden bei 4 ° C.
2. Waschen der Objektträger in PBT für 2-4 h bei Raumtemperatur unter leichtem Schütteln.
3. Wenden Sie dasSekundär-Antikörper 1:200 in PBS + 0,2% Tween-20 für 24 Stunden bei 4 ° C
4. Waschen Folien in PBT für 1 h bei Raumtemperatur unter leichtem Schütteln.
5. Mit 10 ug / ml Propidiumiodid in PBS für 15 min Gegenfärbung, dann spülen 15 min in PBS unter leichtem Schütteln bei Raumtemperatur.
6. Berg in der Anti-Fading-Flüssigkeit mountant mit 10 ug / ml Propidiumiodid ergänzt. Lassen Sie die Montagemedium aushärten 1 Stunde vor dem Erwerb durch CLSM Bilder.

5. Quantitative Bildgebung

1. Bildaufnahme:
   1. Erwerben Sie hochauflösende Bilder mit CLSM, idealerweise mit einer Resonanz-Scanmodus, die bessere Erhaltung der Fluoreszenzsignale über längere Bild ²³ und einen 63X Glycerin Sionslinse ermöglicht.
   2. Testen Sie die Aufnahmeparameter wie Laserintensität, Verstärkung, Lochkamera, Voxel-Größe und Zoom-Faktor zu Beginn des Experiments, um eine Standarderwerbsverfahren zu definieren, um in ganz strikt befolgenAlle Folien für konsistente quantitative Messungen.
   3. Überprüfen Sie, ob das Fehlen von Übersprechen zwischen Fluorochrome. Falls vorhanden, einen sequentiellen Scan eingestellt. Erwerben Sie separat und nicht gleichzeitig Übertragungs Bilder.
   4. Führen seriell, dreidimensionale Bildaufnahme mit höchster Auflösung in x-und y-Abmessungen und mit 2x Oversampling in der z-Dimension (Nyquist-Regel).
2. Bildverarbeitung:
   1. Rekonstruieren Serien Bilder in drei Dimensionen mit kommerziellen oder Open-Source-Software.
   2. Definieren Konturflächen um jeden Kern (oder Zelle) von Interesse in 3D.
   3. Quantifizierung der Fluoreszenz in jedem Kanal die Summe der Pixelintensitäten in jedem Objekt.
   4. Exportieren Sie die Daten in Excel für statistische Auswertungen. Normalisieren Antikörper gegen Signale zB DNA-Färbung Signale.

Ergebnisse

Wir bieten eine robuste Protokoll für die großtechnische Herstellung und Verarbeitung von Arabidopsis Samenanlagen geeignet für zytologische Färbung ganz-mount. Durch die Einbettung sind die Samenanlagen behalten eine 3-dimensionale Struktur (Fig. 3). Darüber hinaus ist die Gewebeverarbeitung einschließlich der optischen Klärung ermöglicht die Abbildung subzellulärer Strukturen mit hoher Auflösung. Abbildung 4 zeigt DNA-Färbung in whole-mount Eizelle Primordia wo Het...

Diskussion

In blühenden Pflanzen wird die weiblichen Fortpflanzungs Abstammung von mehreren Zellschichten einschließlich der Nucellus der Samenanlage und teguments umgeben, damit Rendering zytologische Färbung in whole-mount technisch anspruchsvoll. Hier stellen wir eine effiziente Protokoll ermöglicht die Erstellung und Bearbeitung einer großen Anzahl von Eizellen geeignet für zytologische Färbung wie Immunfärbung, DNA-Färbung und Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung ganz-mount. Wir erfolgreich verwendet sie für ...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Solutions
BVO Fixation Buffer (based on32)			2 mM EGTA, pH 7.5, 1% (v/v) formaldehyde, 10% DMSO, 1x PBS, 0.1% Tween-20
PBT			1x PBS, 0.1% Tween-20
PBT-F			1x PBT, 2.5% (v/v) formaldehyde
30% acrylamide:bisacrylamide			3 g acrylamide, 0.33 g bisacrylamide, 1x PBS (prepare 10 ml, store at 4 °C)
200 ml 5% acrylamide mix in PBS			34 ml 30% acrylamide:bisacrylamide, 166 ml 1x PBS (make fresh from 30% stock)
20% ammoniumpersulfte			0.2 g ammoniumpersulfte, 1 ml sterile water (prepare aliquots with 1 ml and store at -20 °C)
20% sodium sulfite			0.2 g sodium sulfite, 1 ml sterile water (prepare aliquots with 1 ml and store at -20 °C)
Cell wall enzyme mix			0.5% (w/v) cellulase, 1% (w/v) driselase, 0.5% (w/v) pectolyase
Reagents and Materials
Formaldehyde	Sigma-Aldrich	F1635
DMSO	Sigma	D5879
Tris	Amaresco	0497
Ethanol	Schaurlau	ET00102500
Methanol	Schaurlau	ME03062500
Xylene	ROTH	4436.1
Cellulase	Sigma	1794
Driselase	Sigma	D8037
pectolyase	Sigma	P5936
Tween-20	Merck	8.22184.0500
EGTA	Sigma	E-4378
acrylamide	Sigma	A-3553
bisacrylamide	Sigma	M2022	toxic
ammoniumpersulfate	Sigma	A9164
Sodium sulfite	Fluka	71988
Anti-trimethyl-Histone H3 (Lys4)	Upstate	07-473
Anti- monomethyl-Histone H3 (Lys27)	Upstate	07-448
Alexa Fluor 488~goat ~anti ~rabbit (H+L)	Molecular Probe	A11008
ProlongGold	Invitrogen	P36934
Propidium iodide	Sigma	P4170	toxic
DAPI	Sigma	D9542	toxic
RNAse A	Roche	10109169001
Coplin jar	Huber & CO	10.055
Forceps	DUMONT BIOLOGY
Shaker	Heidolph	543-12310-00-0
Moist chamber			A plastic box with damp paper towel inside, a plastic support is put into the box for supporting the slides and keep slides from the water.
Superfrost Plus slide	Thermo Fisher	J1800AMNZ	Menzel-Gläser
FISH Tag DNA KIt	Invitrogen	F32947
GFP booster	Chromotek