Эффективный метод для количественного, анализа одноклеточные хроматина Модификация и ядерной архитектуры в целом монтажа яйцеклеток в<em&gt; Arabidopsis</em

Резюме

Мы предоставляем здесь эффективную и надежную протокол для иммуноокрашивания, флуоресцентная в гибридизация, окрашивания ДНК с последующим количественным, изображений с высоким разрешением в целом монтажа арабидопсис яйцеклеток. Этот метод был успешно использован для анализа хроматина модификации и ядерной архитектуры.

Аннотация

В цветущих растений, судьба клеток переход соматической к репродуктивного отмечен спецификации спор материнских клеток (ГМК) в цветочных органов взрослого растения. Самка SMC (мегаспоры материнская клетка, MMC) отличает в яйцеклетки зачатка и претерпевает мейоз. Выбранный гаплоидны мегаспоры затем подвергается митоза, чтобы сформировать многоклеточный женского гаметофита, которая даст начало гамет, яйцеклетку и центрального ячейку вместе с вспомогательными клетками. Ограниченная доступность из ГМК, meiocyte и женского гаметофита внутри яйцеклетки технически сложным для цитологического и цитогенетического анализа на уровне одной клетки. В частности, прямое или косвенное иммунодетекции сотовых или ядерных эпитопов нарушается плохим проникновением реагентов внутри изображений клеток растений и одноклеточных является наследству отсутствием оптической прозрачности в целом монтажа тканей.

Таким образом, мы разработали эффективный метод для анализа Nuclорганизация уха и модификация хроматина в высоком разрешении одной клетки в целом монтажа встроенных Arabidopsis яйцеклеток. Он основан на рассечения и вложения основных яйцеклеток в тонком слое акриламида гель на предметное стекло. Встроенные яйцеклетки подвергаются химической и ферментативных обработок, направленных на улучшение ясности тканей и проницаемость к иммуноокрашивания реагентов. Эти процедуры сохранить клеточные и организации хроматина, ДНК и белка эпитопы. Образцы могут быть использованы для различных последующих цитологических анализов, в том числе хроматина иммунным окрашиванием, флуоресценции в гибридизация (FISH) и окрашивания ДНК для анализа гетерохроматина. Конфокальной лазерной сканирующей микроскопии (CLSM) изображений, с высоким разрешением, а затем 3D-реконструкции позволяет для количественных измерений при разрешении одноклеточных.

Введение

В цветущих растений, создание репродуктивных линий начинается с дифференциации ГМК, женской MMC и мужской микроспора материнской клетки. ГМК развивается из суб-эпидермального нуцеллярных камере в дистальной части семяпочки зачатка, и микроспора материнская клетка развивается из спорообразующих ткани в пыльников гнезде, которые расположены глубоко внутри цветочных органов ^1. ГМК пройти мейоз производить гаплоидные споры, которые затем дают начало к гаметофитов на митоза. Женского гаметофита, или зародышевого мешка, состоит из одной яйцеклетки, одной центральной ячейки, две синергид и три antipodals. Мужского гаметофита, или пыльца, состоит из одного вегетативной клетки и двух сперматозоидов. В то время как мужского гаметофита остается относительно доступным статьям исследование, женский гаметофит встраивается внутрь яйцеклетки, сам заключенный в цветочном пестика, и, таким образом ставит конкретные задачи перед молекулярных и цитологических анализов. Однако в последнее время с помощью лазерамикродиссекции предложил элегантное решение, позволяющее транскриптомных анализирует в ГМК и женских гаметофитного клеток ^2-4. В дополнение к экспрессии генов кандидата анализирует, используя, например, РНК в гибридизация или гена-репортера анализов, цитологические анализы позволяет исследовать динамику эндогенных клеточных компонентов, использующих конкретные постоянного сотовой окрашивания или косвенный иммуноокрашивания. В частности, цитогенетический окрашивание с использованием рыбы и окрашивание ДНК вместе с иммунным модификаций хроматина или компонентов хроматина являются центральными подходы для выяснения динамики хроматина и ядерной организации в Arabidopsis ^5. Как правило, мейоза влечет за собой конкретные динамику хромосом, который был хорошо исследованы в растительной мужчина meiocytes ^6,7; дальнейших крупномасштабных, реорганизация хроматина соты, вероятно, отражает динамический эпигенетическую перепрограммирования был описан во время развития пыльцы ^8-10. В противоположность этому, в результатеотносительной недоступности женского meiocyte и гаметофита, эти исследования остаются технически трудно применять, и часто требуют секционирования или ручной вскрытие и ферментативного расщепления (см. ниже). Кроме того, распространены отсутствие оптической прозрачности в целом монтажа является препятствием для изображений с высоким разрешением половых клеток у интактных яйцеклеток.

Классический метод цитологического анализа организации хромосом в целом монтажа яйцеклеток использует окрашивание Фельгену в ^11-13. Она включает в себя кислотного гидролиза (с использованием хлорноватистой кислоты) ДНК, что приводит к денатурации белков и, таким образом, вызывает разрушение структуры хроматина. Кроме того, организации хромосом в женских meiocytes и гаметофитного клеток можно наблюдать с помощью DAPI окрашивание и иммуноокрашивания на полу-тонких срезов или расчлененных зародышевых мешков и MMC (см., например, ^14-18). Ясно, однако, руководство вскрытие и секционирования может быть трудоемким ипрепятствует на качественном и количественном анализе большого количества хроматина эпитопов.

Здесь мы предлагаем эффективный протокол подготовить большое количество Arabidopsis яйцеклеток, пригодных для различных вниз по течению окрашивания цитологического в целом монтажа. Короче говоря, бутоны инкубируют в закрепителя решения, ряды яйцеклеток расчленены из пестика и заливали в акриламида на слайде, как это сделано для пыльцы meiocytes ^19,20. Встроенные яйцеклетки дополнительно очищен и фиксировали в метаноле, этаноле, и ксилол до клеточной стенки пищеварения и проницаемости. Обсуждаются возможные вариации этих шагов. Образцы затем могут быть использованы для окрашивания ДНК, иммуноокрашивания, и рыба. Режим подготовка является эффективным и позволяет параллельно экспериментальной установки (до 16 слайдов, могут быть получены в день для различных вниз по течению анализа). Лечение описанные включить однородные сигналы в целом монтажа и хорошо сохранились гистологические, сотовой,и ядерная организация в репродуктивных клеток и окружающих нуцеллярных клеток, которые пользуются качественные и количественные сравнения между типами клеток. Калиброванный, CLSM основе с высоким разрешением изображения с последующим 3-мерной реконструкции позволяет значимые количественные измерения флуоресцентных сигналов. Мы успешно использовали эту процедуру для анализа динамики хроматина в дифференциации MMC ²¹ и разработке женского гаметофита ^22; мы представляем здесь репрезентативные результаты анализа гетерохроматина, хроматина иммуноокрашивания, GFP иммуноокрашивания и рыба в целом монтажа яйцеклеток. Мы также считаем, что наш протокол будут пригодны для других тканей и видов растений.

протокол

Эта процедура описана в рабочий процесс на рисунке 1, а установка для вскрытия и вложения тканей представлены на рисунке 2.

1. Тканей Фиксация

1. Сбор 20-30 плодолистиков в пробирке, содержащей свежеприготовленный БВО фиксирующий буфер на льду.
2. Закрепите ткань 30 мин при осторожном встряхивании при комнатной температуре.
3. Вращайте пробирки, содержащие плодолистиков в фиксатора в настольный микроцентрифуги 1 мин при 400 х г.
4. Удалить внимательно фиксирующий буфер и добавить 1 мл PBT, поместить пробирки на льду.

2. Вскрытие и внедрение

1. Подготовьте пять Эппендорф труб друг с 200 мкл свежеприготовленного, 5% акриламида смеси.
2. Подготовьте пять SuperFrost слайды предварительно очищенную с 70% этанола и помечены карандашом.
3. Оттепель один аликвоты 20% APS и 20% НПД каждый, на льду.
4. Возьмите 4-5 плодолистиков с отключения кончиком, местоих на чистую слайд, удалить избыток жидкости.
5. Сделать продольные разрезы с помощью тонкой иглы и отсоедините пестика стены, чтобы освободить ряды яйцеклеток, как показано рисунке 2, избежать высыхания, покрывая с PBS (не более 10 мкл).
6. Быстро добавить и смешать 12 мкл НПД, 12 мкл APS с аликвоты 200 мкл акриламида смеси.
7. Добавить 30 мкл активированного акриламида на рассеченных семяпочек.
8. Накрыть мм покровным 20 х 20, не говоря полимеризации при комнатной температуре, 45-60 мин.
9. Удалить покровное лезвием бритвы. На этой стадии образцы можно хранить в течение ночи при 4 ° С в баночку, содержащую Коплин PBS.

3. Обработка ткани

ПРИМЕЧАНИЕ: Все шаги, кроме 3.2.1, 3.2.3, 3.3.2 и 3.4.3 осуществляются в Коплин банки с 80 мл раствора при химической капот при комнатной температуре. Слайды передаются с плоским наконечником щипцов.

1. Ткань разъяснения ификсация:
   1. Инкубировать 5 мин в метаноле.
   2. Инкубировать 5 мин в этаноле.
   3. Инкубировать 30 мин в смеси этанол: ксилол (1:1).
   4. Инкубировать 5 мин в этаноле.
   5. Инкубировать 5 мин в метаноле.
   6. Инкубировать 15 мин в метаноле и PBT (1:1), дополненной 2,5% формальдегида.
   7. Промойте 2 х 10 мин в PBT. На данном этапе, слайды могут храниться в течение ночи при 4 ° С.
2. Клеточная стенка пищеварения:
   1. Оттепель аликвоту клеточной стенки пищеварения смеси на льду.
   2. Возьмите слайд из фляги Коплин, слейте избыток жидкости, поместив его вертикально на бумажное полотенце.
   3. Добавить 100 мкл клеточной стенки пищеварения смеси над акриламида площадку и накройте мм покровным 23 х 46. Повторите эти действия для других слайдов. Инкубировать в течение 2 ч при 37 ° С во влажной камере (описанного в материалах).
   4. Вымойте слайды 2 х 5 мин в PBT.
3. РНКазы А лечение:
   1. Возьмите слайд из фляги Коплин, процедить тыс.е избыток жидкости, как раньше.
   2. Инкубируют каждый слайд с 100 мкл РНКазы А при 100 мкг / мл в PBS с 1% Твин-20 в течение 1 часа при 37 ° С во влажной камере.
   3. Вымойте слайды для 2 х 5 мин в PBT.
4. После фиксации и пермеабилизации:
   1. После исправить в течение 20 мин в свежеприготовленный PBT-F.
   2. Промыть слайды в течение 10 мин в PBT.
   3. Проницаемыми в течение 2 ч в PBS с 2% Tween-20 при 4 ° С.
   4. Промыть слайды для 2 х 5 мин в PBT.

4. Иммуноокрашивание

Примечание: На этом этапе, оптимальная концентрация первичного антитела должна быть проверена с использованием различных разведений (1:200, 1:500, 1:1000) антител.

1. Инкубируют каждый слайд с 100 мкл первичного антитела разбавленных в PBS с 0,2% твина-20 в течение 12-24 ч при 4 ° С.
2. Промыть слайдов в течение 2-4 PBT ч при комнатной температуре при осторожном встряхивании.
3. Применить1:200 вторичное антитело в PBS + 0,2% Tween-20 в течение 24 ч при 4 ° С.
4. Промыть слайдов в PBT в течение 1 часа при комнатной температуре при легком встряхивании.
5. Контрастирующая с 10 мкг / мл пропидийиодидом в PBS в течение 15 мин, затем смыть 15 мин в PBS при осторожном встряхивании при комнатной температуре.
6. Крепление в анти-замиранием жидкого mountant с добавлением 10 мкг / мл пропидийиодидом. Пусть монтажа средних затвердеть в течение 1 часа до приобретения изображения, CLSM.

5. Количественный изображений

1. Приобретение изображения:
   1. Получение изображений с высоким разрешением с помощью КЛСМ, в идеале, используя режим сканирования резонанса, который позволяет лучшее сохранение флуоресцентных сигналов над длительной обработки изображений ^23, и 63X глицерина погружение линзы.
   2. Проверьте параметры измерения, такие как интенсивность лазерного, усиления обскуры, размер воксела и коэффициентом увеличения в начале эксперимента, чтобы определить стандартную процедуру приобретения строго следовать во всемвсе горки для последовательных количественных измерений.
   3. Проверьте отсутствие перекрестных помех между флуорохромами. Если присутствует, установить последовательное сканирование. Получение изображений передачи отдельно, а не одновременно.
   4. Выполните серийный, трехмерное сканирование изображения с максимально возможным разрешением в х и у размеров и с 2x передискретизации в измерении г (правило Найквиста).
2. Обработка изображений:
   1. Реконструировать серийные изображения в трех измерениях, используя коммерческую или открытое программное обеспечение.
   2. Определить контурные поверхности вокруг каждого ядра (или ячейки), представляющие интерес в 3D.
   3. Количественно флуоресценции в каждом канале в виде суммы интенсивностей пикселей в каждом объекте.
   4. Экспортировать данные в Excel для статистического анализа. Нормализовать антител сигналы против окрашивания сигналов например ДНК.

Результаты

Мы предоставляем надежную протокол для подготовки масштабной и переработки Arabidopsis яйцеклеток, пригодных для цитологического окрашивания в целом монтажа. Благодаря вложению, семяпочки сохранить 3-мерную структуру (рис. 3). Кроме того, обработка ткани в том числе оптическог...

Обсуждение

В цветущих растений, женская репродуктивная линия окружена несколькими слоями клеток, включая нуцеллуса и яйцеклетка покровы, таким образом отдавая цитологический окрашивание в целом монтажа технически сложной задачей. Здесь мы представляем эффективную протокол, позволяющий подгот...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Solutions
BVO Fixation Buffer (based on32)			2 mM EGTA, pH 7.5, 1% (v/v) formaldehyde, 10% DMSO, 1x PBS, 0.1% Tween-20
PBT			1x PBS, 0.1% Tween-20
PBT-F			1x PBT, 2.5% (v/v) formaldehyde
30% acrylamide:bisacrylamide			3 g acrylamide, 0.33 g bisacrylamide, 1x PBS (prepare 10 ml, store at 4 °C)
200 ml 5% acrylamide mix in PBS			34 ml 30% acrylamide:bisacrylamide, 166 ml 1x PBS (make fresh from 30% stock)
20% ammoniumpersulfte			0.2 g ammoniumpersulfte, 1 ml sterile water (prepare aliquots with 1 ml and store at -20 °C)
20% sodium sulfite			0.2 g sodium sulfite, 1 ml sterile water (prepare aliquots with 1 ml and store at -20 °C)
Cell wall enzyme mix			0.5% (w/v) cellulase, 1% (w/v) driselase, 0.5% (w/v) pectolyase
Reagents and Materials
Formaldehyde	Sigma-Aldrich	F1635
DMSO	Sigma	D5879
Tris	Amaresco	0497
Ethanol	Schaurlau	ET00102500
Methanol	Schaurlau	ME03062500
Xylene	ROTH	4436.1
Cellulase	Sigma	1794
Driselase	Sigma	D8037
pectolyase	Sigma	P5936
Tween-20	Merck	8.22184.0500
EGTA	Sigma	E-4378
acrylamide	Sigma	A-3553
bisacrylamide	Sigma	M2022	toxic
ammoniumpersulfate	Sigma	A9164
Sodium sulfite	Fluka	71988
Anti-trimethyl-Histone H3 (Lys4)	Upstate	07-473
Anti- monomethyl-Histone H3 (Lys27)	Upstate	07-448
Alexa Fluor 488~goat ~anti ~rabbit (H+L)	Molecular Probe	A11008
ProlongGold	Invitrogen	P36934
Propidium iodide	Sigma	P4170	toxic
DAPI	Sigma	D9542	toxic
RNAse A	Roche	10109169001
Coplin jar	Huber & CO	10.055
Forceps	DUMONT BIOLOGY
Shaker	Heidolph	543-12310-00-0
Moist chamber			A plastic box with damp paper towel inside, a plastic support is put into the box for supporting the slides and keep slides from the water.
Superfrost Plus slide	Thermo Fisher	J1800AMNZ	Menzel-Gläser
FISH Tag DNA KIt	Invitrogen	F32947
GFP booster	Chromotek