Construcción y caracterización de un Fold biorreactor Novela Vocal

Resumen

A novel vocal fold bioreactor capable of delivering physiologically relevant, vibratory stimulation to cultured cells is constructed and characterized. This dynamic culture device, when combined with a fibrous poly(ε-caprolactone) scaffold, creates a vocal fold-mimetic environment that modulates the behaviors of mesenchymal stem cells.

Resumen

In vitro engineering of mechanically active tissues requires the presentation of physiologically relevant mechanical conditions to cultured cells. To emulate the dynamic environment of vocal folds, a novel vocal fold bioreactor capable of producing vibratory stimulations at fundamental phonation frequencies is constructed and characterized. The device is composed of a function generator, a power amplifier, a speaker selector and parallel vibration chambers. Individual vibration chambers are created by sandwiching a custom-made silicone membrane between a pair of acrylic blocks. The silicone membrane not only serves as the bottom of the chamber but also provides a mechanism for securing the cell-laden scaffold. Vibration signals, generated by a speaker mounted underneath the bottom acrylic block, are transmitted to the membrane aerodynamically by the oscillating air. Eight identical vibration modules, fixed on two stationary metal bars, are housed in an anti-humidity chamber for long-term operation in a cell culture incubator. The vibration characteristics of the vocal fold bioreactor are analyzed non-destructively using a Laser Doppler Vibrometer (LDV). The utility of the dynamic culture device is demonstrated by culturing cellular constructs in the presence of 200-Hz sinusoidal vibrations with a mid-membrane displacement of 40 µm. Mesenchymal stem cells cultured in the bioreactor respond to the vibratory signals by altering the synthesis and degradation of vocal fold-relevant, extracellular matrix components. The novel bioreactor system presented herein offers an excellent in vitro platform for studying vibration-induced mechanotransduction and for the engineering of functional vocal fold tissues.

Introducción

El pliegue vocal humano, compuesto por una capa epitelial, la lámina propia (LP) y el músculo vocal, es un tejido blando especializada que convierte el flujo de aire de los pulmones a las ondas acústicas para la producción de sonido. ¹ Las cuerdas vocales oscilan regularmente durante la fonación normal, exhibiendo cepas de hasta 30% en las frecuencias fundamentales que van desde 100 hasta 300 Hz. ² adultos vocal LP veces es una estructura compuesta de un gradiente superficial (SLP), un compuesto intermedio (ILP) y un (DLP) capa profunda. Otros grupos de clasificación del epitelio y la SLP como la capa mucosa, y combina la ILP y DLP en el ligamento vocal. ³ La capa SLP contiene principalmente una matriz amorfa con fibras colágenas escasamente dispersas, mientras que el ligamento está enriquecida con colágeno maduro y las fibras de elastina para proporcionar suficiente resistencia. ⁴ La estructura y la mecánica de las cuerdas vocales recién nacidos varían significativamente de sus contrapartes maduros. Aunque el mecanismos que regulan el desarrollo de las cuerdas vocales y la maduración aún no se entienden completamente, la evidencia experimental ha señalado a los roles que definen a los esfuerzos mecánicos derivados de la vocalización.

Varias condiciones médicas, incluyendo el abuso de la voz, infecciones, irritantes químicos y procedimientos quirúrgicos, pueden dañar la cuerda vocal. Trastornos de las cuerdas vocales afectan a un estimado de 3.9% de la población de los EE.UU.. Los métodos actuales de tratamiento para los trastornos de las cuerdas vocales se limitan ⁵ y un enfoque de la ingeniería de tejidos a base de células madre se ha convertido en una estrategia prometedora para restaurar la función de las cuerdas vocales. Las células madre mesenquimales (MSC) son una alternativa adecuada a los fibroblastos de las cuerdas vocales principales para la ingeniería de tejidos vocal fold. ^6-9 especificación del destino de células madre y el desarrollo del tejido posterior son mediados por el nicho específico que residen en, de los cuales la condición mecánica es un factor vital. ¹⁰ Las fuerzas mecánicas son reguladores esenciales de tejidos morfogénesis unND homeostasis, sobre todo para los tejidos que están sometidos rutinariamente a la carga. ¹¹ Desde una perspectiva de la ingeniería de tejidos, se ha demostrado que la exposición a estímulos mecánicos fisiológicamente relevantes promueve la diferenciación de células madre y remodelación de la matriz específica de tejido. ^12-15

Biorreactores de cultivo de tejidos están diseñados para simular el entorno fisiológico deseado para la célula o tejido crecimiento in vitro. Para vocal ingeniería tisular veces, es especialmente crítico para recrear el ambiente mecánico de las cuerdas vocales fonación. Un biorreactor de las cuerdas vocales ideal debe cumplir efectivamente las señales vibratorias a células de cultivo, permitiendo el control fácil sobre la frecuencia, amplitud y duración de las vibraciones. Titze y compañeros de trabajo idearon un biorreactor vocal veces (biorreactor T1) ¹⁶ que combina estiramiento estático con alta frecuencia (20-200 Hz) oscilaciones para estimular la producción celular de proteínas de la matriz. Usíng este biorreactor, Webb y colegas ¹⁷ estudiaron los efectos de 10 días-, 100-Hz vibraciones en fibroblastos dérmicos cultivados en un ácido hialurónico (HA) a base de hidrogel. Las construcciones sometidas a vibraciones mostraron una elevada expresión de HA sintasa-2 (HAS2), decorina, fibromodulina y la metaloproteinasa de matriz-1 (MMP-1), relativa a los controles estáticos. Se encontró que los efectos estimulantes de ser dependiente del tiempo. Más recientemente, nuestro grupo de ¹⁸ reunió a un biorreactor de las cuerdas vocales (biorreactor J1) con un amplificador de potencia, un generador de funciones, un altavoz cerrado y una membrana de silicona circunferencialmente ancladas que transfiere el aire oscilante a las células unidas. Fibroblastos de prepucio neonatal cultivados en el biorreactor J1 se sometieron a 1 hora de vibración a 60, 110 o 300 Hz, con una cepa en el plano de hasta 0,05%. Los resultados qPCR sugirieron que la expresión de algunos genes ECM fue alterado moderadamente en respuesta a las múltiples frecuencias vibratoriasy amplitudes.

Estos diseños de biorreactores, mientras intrigante, tienen varias limitaciones. Por ejemplo, el sistema T1 requiere un gran número de conectores y barras de acoplamiento mecánico, la limitación de las frecuencias máximas alcanzables. Por otra parte, las células pueden ser sometidos a agitación y indeseable de fluido perturbación mecánica que complican la interpretación de los datos. El biorreactor J1, por otro lado, exhibe relativamente baja eficiencia de conversión de energía y no es fácil de usar. Además, la vibración con frecuencia separa los constructos de células cargado de la membrana de silicona subyacente. El J2 biorreactor de las cuerdas vocales informado aquí, diseñado basado en el mismo principio que la versión J1, está optimizado para la consistencia y reproducibilidad. Las vibraciones de fonación que imitan se generan aerodinámicamente en cámaras de vibración montados individualmente cuando poli fibrosa poblada-MSC (ε-caprolactona) (PCL) andamios son effectively asegurado. Láser Doppler vibrometría (LDV) permite al usuario verificar el perfil vibratorio del conjunto de membrana / andamio. En nuestra demostración, las MSC se exponen a 200 Hz vibraciones sinusoidales con una (DE) patrón 1-hr-a-1-hr-off para un total de 12 horas al día durante 7 días. Las respuestas celulares a las señales vibratorias impuestas son investigadas sistemáticamente. En general, el pliegue vocal J2 ofrece la mayor cantidad de funciones fáciles de usar, lo que permite estudios de cultivo celular dinámico para llevarse a cabo en un alto rendimiento y la moda reproducible.

Protocolo

1. Asamblea biorreactor (vídeo 1)

1. Hacer un molde de aluminio (matriz circular + pin espaciador) con las dimensiones internas y externas predeterminadas (Figura 1).
2. Usando el molde desde el paso 1.1, fabricar una membrana de silicona (diámetro: 42 mm, espesor: 1,5 mm, Figura 1) con un manguito arraigada (diámetro: 12 mm, espesor ~ 0,25 mm, en forma de por el pasador de espaciador en la Figura 1) en el medio utilizando un kit de elastómero de silicona disponible en el mercado.
3. Hacer un par de bloques de acrílico (Figura 2 (4, 5)) con una abertura circular (diámetro: 24 mm) en el centro, grabar la parte superior (1,8 cm de espesor) e inferior (0,9 cm de espesor) bloques con aristas coincidentes y ranuras . ¹⁰
4. Emparedado de la membrana de silicona entre los bloques de acrílico pareadas. Fije el conjunto con cuatro tornillos de las esquinas con un destornillador de torsión micro ajustado a una fuerza constante (35 cN · m). Como resultado, un estanca al agua, 24 mm de ancho y 18 mm de cámara profunda vibración es creada (Figura 2C).
5. Montar un ^"rango extendido mini-woofer 3 (Figura 2D, 8 Ω/20 W) por debajo de la cámara de la vibración a través de otro conjunto de tornillos de las esquinas en el bloque de acrílico inferior. En este punto, un módulo de vibración individual está montado.
6. Replicar siete módulos de vibraciones adicionales. Coloque cuatro de ellos a uno de dos barras de aluminio fijos (40 cm x 10 cm x 2,5 cm), colocando las bases de altavoz en orificios circulares uniformemente espaciados (diámetro: 7 cm, espesor: 2 cm) cortadas en los bares. Estabilizar cada altavoz mediante la inserción de un tornillo a través del lado de la barra de aluminio en cada agujero circular.
7. Controlar individualmente los altavoces por un selector de altavoces. Conectar altavoces individuales al selector uniendo cables a las entradas positiva y negativa en el cuerpo de altavoz a continuación a las salidas correspondientes en el selector. El selector del altavoz permite que la señal de tque generador de funciones, después de pasar a través de un amplificador de potencia, para alcanzar los ocho altavoces al mismo tiempo (Figura 2E).
8. Coloque las dos matrices de cámara, el selector de altavoces y componentes electrónicos asociados en un recinto anti-humedad. Casa todo el conjunto en una incubadora de cultivo celular comercial.
9. Alimentar a los cables principales (a través de un tubo de PVC de grado médico) que conecta el amplificador de potencia y el selector de altavoz a través del conjunto de filtro en la parte posterior de la incubadora.

2. Fabricación de la estructura y Caracterización

1. Disolver gránulos de PCL en cloroformo a una concentración de 15% en peso. Cargar la solución en una jeringa de 10 ml tapado con una aguja de punta roma 21 G.
2. Bloquee la jeringa en una bomba de inyección programable y ajustar la velocidad de flujo a 1 ml / hr.
3. Coloque el colector de aluminio cubierto de aluminio a través de la aguja en posición horizontal, con una aguja de distancia de punta a colector de ~ 18 cm.
4. Sujete el alli positivoGator clip a la media de la aguja, y la pinza de cocodrilo de tierra al colector de aluminio, a continuación, establecer el voltaje en la fuente de alimentación de alta tensión de 15 kV. PRECAUCIÓN: alta tensión, mantener la distancia de la aguja.
5. Convertir secuencialmente en la bomba de jeringa y la fuente de alimentación; rápidamente limpiar / remover la solución de polímero residual que rodea la punta de la aguja con una toalla de papel seca antes de jets fibra estable y Taylor cono ¹⁹ se forman.
6. Dejar que las fibras se acumulan en el colector de Al con un grosor de ~ 250-300 micras (~ 7 h bajo las condiciones de hilado actuales). Guarde los andamios resultantes en un desecador de vacío durante 1-2 días para eliminar cualquier disolvente residual.
7. Imagen de los andamios, recubrieron por deposición con oro, utilizando un microscopio electrónico de barrido para mostrar la morfología de la fibra consistente. ¹⁰

3. Asamblea biorreactor y Caracterización

1. Haz un disco cilíndrico (diámetro: 8 mm) con cuatro brazos (longitud: 2mm) fuera de la estera como hilado-PCL (Figura 2A) por primera usando un punzón de biopsia de 12 mm de diámetro para cortar el diámetro exterior del disco. A continuación, utilice un segundo, 8 mm punzón de biopsia para hacer cuatro muescas 2 mm de largo espaciados uniformemente alrededor de la hoja circular de anotar dónde están las armas para cortar. Después de anotar con el punzón de 8 mm, utilizar una cuchilla de escalpelo para cortar los bordes de los brazos hacia afuera. Inserte el andamio en la ranura de la membrana de silicona a través de los brazos extendidos (Video 1). Acoplar el andamio insertado presionando suavemente la superficie con unas pinzas de cabeza plana.
2. Coloque un pedazo pequeño de fina lámina de aluminio (8 mm x 2 mm, de forma ortogonal, Figura 2B) al cadalso PCL para ayudar a la reflexión del láser.
3. Asegure la membrana de silicona / PCL andamio montado (como se detalla en el paso 1.4) en la cámara de vibración. Añadir 1,5 ml de agua en la cámara con el fin de hidratar el andamio PCL antes de la vibración.
4. Usando el generador de funciones, introducir señal de vibraciónALS (por ejemplo, 200 Hz ondas sinusoidales con una tensión de pico a pico, Vpp, de 0,1 V) a la cámara de acrílico intercalada. Utilice un voltímetro para medir con precisión el voltaje en cada entrada del altavoz. Nota: la lectura Vpp desde el generador de funciones será diferente de la tensión de la eventual entrega al altavoz.
5. Montar la LDV de un solo punto y asegurar la cabeza del sensor láser de fibra óptica en un trípode cabeza pan-tilt. Ángulo de la cabeza del sensor de manera que está apuntando perpendicular al tablero de la mesa. Conectar el cabezal del sensor LDV al módulo de adquisición de datos a través de cable coaxial entonces el módulo a la computadora portátil a través de USB.
6. Enfocar el haz de láser perpendicularmente a diversos puntos predeterminados en la membrana de silicona (Figura 2B y Figura 3).
7. Utilizando el software de adquisición de datos, registrar el desplazamiento mediados de membrana. Haga clic en "Configuración de adquisición" en el menú "Opciones"; a continuación, cambiar el modo de medición a "FFT221;. A continuación, haga clic en la "medición continua" en la barra de herramientas principal haga clic en el pico que se forma en la frecuencia elegida (Figura 6D) para registrar el desplazamiento.
8. Trazar el desplazamiento mediados de membrana normal (w ₀₎ como una función de la posición relativa a través del sustrato. Construir un mapa de colores 3D del perfil vibratoria superficie usando Origen software de análisis de datos 8.5.

4. Vibratorio Cultivo Celular

1. MSC derivadas de médula ósea humana Sub-cultura en frascos de cultivo de tejidos T150 en una densidad de siembra inicial de 4.000-5.000 células / cm ² en MSC medio de mantenimiento.
2. Después de 7-8 días de cultivo celular (hasta ~ 85% de confluencia), trypsinize las células con un reactivo de disociación celular como accutase, contar utilizando un hemocitómetro, se centrifuga (440 g durante 5 min), y volver a suspender el sedimento celular en fresca MSC medios de mantenimiento a una concentración de 4,5 x 10 ⁶ células / ml.
3. Sumerja el Scaffo PCLld en el 70% de etanol O / N. Después de evaporar el disolvente, exponer ambos lados del andamio para germicida de luz UV (254 nm) para 5-8 min.
4. Remojar el andamio PCL en una solución de fibronectina 20 mg / ml a 37 ° C durante 1 hora. Inserte el andamiaje de fibronectina recubierto en la membrana de silicona. Montar el biorreactor como se detalla en el paso 1.
5. Distribuir 40 l de la suspensión celular de manera uniforme en el cadalso PCL garantizado. Permitir que las células se unan durante 1-1,5 h antes de la adición de un adicional de 1,5 ml de medio fresco a la cámara de vibración.
6. Cultura al cadalso PCL-MSC cargado estáticamente durante 3 días y actualizar los medios de comunicación al término de la cultura estática.
7. Imponer regímenes de vibración seleccionados para los constructos celulares. Nota: A modo de ejemplo, las células se someten a una 1-hr-a-1-hr-desactivación (OF) de vibración a 200 Hz con aw ₀ de ~ 40 m durante 12 horas al día durante un máximo de 7 días. Las construcciones sometidas a estímulos vibratorios se designan como muestras Vib y esas culturojo estáticamente en cámaras de vibraciones idénticas servir como controles estáticos (Stat).

5. Evaluaciones biológicas

1. Recoger 200 l de medios de cultivo celular a partir de cada cámara de cada dos días (días 1, 3, 5, y 7) y agrupar las partes alícuotas de la misma muestra juntos (800 l cada uno).
2. Cuantificar la producción celular de la matriz metaloproteinasa-1 (MMP1) y HA mediante un kit de ELISA MMP1 Desarrollo y un kit de ELISA competitiva ácido hialurónico, respectivamente, siguiendo el procedimiento de los fabricantes. Mientras tanto, el ensayo de la producción de precursor de la elastina soluble en siguiendo el procedimiento de ELISA se informó anteriormente. ⁸
3. Al finalizar el último ciclo de la vibración en el día 7, eliminar rápidamente los constructos celulares de las cámaras de vibración utilizando pinzas afiladas y enjuagarlos con frío tampón fosfato salino (PBS, 4 ° C) brevemente.
4. Para la tinción vivo / muerto, incubar las construcciones con yoduro de propidio (1:2.000 en PBS) ySyto-13 (1:1.000 en PBS) simultáneamente durante 5 min a TA. Imagen de las construcciones teñidos con un microscopio confocal multifotónica.
5. Por separado, complemento congelar los constructos celulares se enjuagaron con PBS en hielo seco y se extrae el ARN celular total después de un protocolo se informó anteriormente para el análisis de genes. ⁹
6. Verificar, la cantidad y la calidad del ARN extraído usando un espectrofotómetro UV-Vis. Las muestras de ARN con A260/A280 y A260/A230 proporciones de 1.8 a 2.2 se utilizan para el análisis de qPCR posterior.
7. Transcribir inversamente el ARN (500 ng / muestra) en ADNc usando un kit de transcripción inversa disponibles comercialmente.
8. Realizar la reacción de PCR en un sistema de detección de secuencias en tiempo real usando una mezcla maestra de PCR disponible comercialmente siguiendo el procedimiento detallado anteriormente. ⁸
9. Analizar los resultados qPCR utilizando software comercial para el análisis de datos qPCR. Para garantizar la fiabilidad de los análisis de datos, múltiples genes de referencia (YWHAZ, PDD, PPIA) se emplean como intcontroles ernal, y la varianza de las eficiencias de cebadores específicos se tiene en cuenta. ⁸

Resultados

Los andamios PCL fabricadas por electrospinning contienen poros intersticiales clasificadas micrón y fibras enredadas al azar con un diámetro medio de 4,7 micras (Figura 4). A un aumento superior, ranuras nanoescala y poros son visibles en fibras individuales (Figura 4B). El recubrimiento de los andamios con fibronectina mejora hidrofilicidad y facilita la adhesión celular inicial / difusión en el cadalso PCL (observación no publicada).

Formas de onda s...

Discusión

Ingeniería con éxito de los tejidos de las cuerdas vocales funcionales in vitro requiere la recreación de un microambiente veces como vocal para mediar en el comportamiento de las células multipotentes. En general se acepta que las estructuras de tejidos u órganos reflejan las funciones que se requieren para llevar a cabo. ²² Para los tejidos de las cuerdas vocales, se proponen las vibraciones de alta frecuencia que se producen durante la fonación a ser importante para la maduración de los tej...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
silicone elastomer kit	Dow Corning	Sylgard 184	cure the membrane at 100 C for 2 hr
PCL	Sigma Aldrich	440744-500G	Mn ~ 80 kDa, dissolve overnight
chloroform	Sigma Aldrich	C7559-5VL
human bone marrow-derived MSCs	Lonza	PT-2501	received with passage 2
MSC maintenance media	Lonza	PT-3001	10% FBS in basal media supplemented with L-glutamine, gentamicin and amphotericin
Accutase cell dissociation reagent	Life Technologies	A11105-01
ethanol	Sigma Aldrich	E7023-500ML
fibronectin	Sigma Aldrich	F2006-1MG
MMP1 DuoSet ELISA kit	R&D systems	DY901
HA ELISA kit	Echelon Biosciences	K-1200
PBS	Life Technologies	14190-136
propidium iodide	Life Technologies	P1304MP
Syto-13	Life Technologies	S7575
QuantiTect reverse transcription kit	Qiagen	205311
SYBR Green PCR master mix	Life Technologies	4309155
replacement speaker	DAYTON audio (via Parts Express)	DS90-8	paper cone, full range (80-13000 Hz), 85dB
Ergo Micro torque screwdriver	Mountz	# 020377	torque range: 20-120 cN.m
stereo speaker selector	RadioShack	40-244	maximum power handling 50 W
function generator	Agilent	33220A	frequency range 1 µHz- 20 MHz
power amplifier	PYLE audio	PylePro PT2400	frequency response: 10 Hz-50 kHz, two speaker channels
cell culture incubator	Thermo Fisher	Steri-Cult 3307
syringe pump	New Era Pump Systems	NE-300
High voltage power supply	Spellman	CZE 1000R	output voltage: 0-30 kV
scanning electron microscope	JEOL-USA	JSM-7400F
desk gold sputter coater	Denton Vacuum	DSK00V-0013
Doppler laser vibrometer	Polytec	PDV-100	non-contact velocity measurement (0-22 kHz)
PCR sequence detection system	Applied Biosystems	ABI7300
multiphoton confocal microscope	Zeiss	Zeiss 510Meta NLO
UV-VIS Spectrophotometer	NanoDrop Products via Thermo Scientific	ND-2000
VibSoft Data Acquisition Software	Polytec		acquisition bandwidth up to 40 MHz
Origin 8.5 data analysis software	OriginLab
qbasePlus qPCR data analysis software	Biogazelle	V2.3
aluminium alloy	McMaster-Carr	Alloy 6061
acrylic blocks	McMaster-Carr
polycarbonate anti-humidity chamber	McMaster-Carr		Impact-Resistant Polycarbonate
screws	McMaster-Carr
electronic cable/wire
medical grade PVC tubing	US Plastic Corp.	Tygon S-50-HL	clear, biocompatible
10 mL syringe	Becton Dickinson	309604
21 G blunt ended needle	Small Parts	NE-213PL-25	1-1/2" length
Alligator clip adapters	RadioShack	270-354	fully insulated
8 mm biopsy punch	Sklar Surgical Instruments	96-1152	sterile, disposable
12 mm biopsy punch	Acuderm (via Fisher Scientific)	NC9998681
tissue culture flasks	Corning		cell culture treated