Construction et caractérisation d'un pli bioréacteur roman Vocal

Résumé

A novel vocal fold bioreactor capable of delivering physiologically relevant, vibratory stimulation to cultured cells is constructed and characterized. This dynamic culture device, when combined with a fibrous poly(ε-caprolactone) scaffold, creates a vocal fold-mimetic environment that modulates the behaviors of mesenchymal stem cells.

Résumé

In vitro engineering of mechanically active tissues requires the presentation of physiologically relevant mechanical conditions to cultured cells. To emulate the dynamic environment of vocal folds, a novel vocal fold bioreactor capable of producing vibratory stimulations at fundamental phonation frequencies is constructed and characterized. The device is composed of a function generator, a power amplifier, a speaker selector and parallel vibration chambers. Individual vibration chambers are created by sandwiching a custom-made silicone membrane between a pair of acrylic blocks. The silicone membrane not only serves as the bottom of the chamber but also provides a mechanism for securing the cell-laden scaffold. Vibration signals, generated by a speaker mounted underneath the bottom acrylic block, are transmitted to the membrane aerodynamically by the oscillating air. Eight identical vibration modules, fixed on two stationary metal bars, are housed in an anti-humidity chamber for long-term operation in a cell culture incubator. The vibration characteristics of the vocal fold bioreactor are analyzed non-destructively using a Laser Doppler Vibrometer (LDV). The utility of the dynamic culture device is demonstrated by culturing cellular constructs in the presence of 200-Hz sinusoidal vibrations with a mid-membrane displacement of 40 µm. Mesenchymal stem cells cultured in the bioreactor respond to the vibratory signals by altering the synthesis and degradation of vocal fold-relevant, extracellular matrix components. The novel bioreactor system presented herein offers an excellent in vitro platform for studying vibration-induced mechanotransduction and for the engineering of functional vocal fold tissues.

Introduction

Le pli vocal humain, composé d'une couche épithéliale, la lamina propria (LP) et le muscle vocalis, est un tissu mou spécialisé qui convertit le flux d'air dans les poumons en ondes acoustiques pour produire des sons. ¹ Cordes vocales oscillent régulièrement pendant la phonation normale, présentant des souches de jusqu'à 30% à des fréquences fondamentales allant de 100-300 Hz. ² adultes cordes vocales LP est une structure composée d'un gradient superficiel (SLP), un intermédiaire (PLI) et un (DLP) couche profonde. D'autres groupes de classification la épithélium et le SLP que la couche de muqueuse, et combine l'ILP et DLP dans le ligament vocal. ³ La couche de SLP contient essentiellement une matrice amorphe avec des fibres de collagène peu dispersés, alors que le ligament est enrichie en collagène mature et les fibres d'élastine pour offrir une résistance suffisante. ⁴ La structure et la mécanique des cordes vocales nouveau-nés varient considérablement de leurs homologues adultes. Bien que le mécanismes régulant le développement de cordes vocales et de la maturation ne sont pas encore entièrement compris, la preuve expérimentale a souligné les rôles qui définissent des contraintes mécaniques vocalisation dérivés.

Plusieurs conditions médicales, y compris l'abus de la voix, des infections, des produits chimiques irritants et des interventions chirurgicales, peuvent endommager la corde vocale. Troubles des cordes vocales affectent environ 3-9% de la population américaine. Méthodes actuelles de traitement pour les troubles des cordes vocales sont limitées ⁵ et un tissu approche d'ingénierie à base de cellules souches est apparue comme une stratégie prometteuse pour la restauration de la fonction de cordes vocales. cellules souches mésenchymateuses (CSM) sont une alternative appropriée aux primaires fibroblastes des cordes vocales pour voix génie pli de tissu. ^6-9 spécification du destin des cellules souches et le développement du tissu ultérieure sont médiés par le créneau spécifique qu'ils résident dans, dont l'état mécanique est un facteur essentiel. ¹⁰ forces mécaniques sont des régulateurs essentiels du tissu morphogenèse unnd homéostasie, en particulier pour les tissus qui sont couramment soumis à une charge. ¹¹ Du point de vue de l'ingénierie tissulaire, il a été démontré que l'exposition à des stimulations mécaniques physiologiquement pertinentes favorise la différenciation des cellules souches et spécifique d'un tissu remodelage de la matrice ^{12 à 15.}

bioréacteurs de culture de tissus sont conçus pour simuler l'environnement physiologique désirée pour la croissance des cellules ou des tissus in vitro. Pour vocal génie pli de tissu, il est particulièrement important de recréer l'environnement mécanique des cordes vocales phonating. Une corde vocale bioréacteur idéal devrait fournir efficacement des signaux vibratoires de cellules en culture, ce qui permet un contrôle facile sur la fréquence, l'amplitude et la durée des vibrations. Et ses collègues ont conçu titze un pli bioréacteur vocal (T1 bioréacteur) ¹⁶ qui combine étirement statique à haute fréquence (20 à 200 Hz) des oscillations de stimuler la production cellulaire de protéines de la matrice. Using ce bioréacteur, Webb et ses collègues ¹⁷ ont étudié les effets de 10 jours, les vibrations de 100 Hz sur les fibroblastes dermiques cultivées dans un acide hyaluronique (HA) à base d'hydrogel. Les constructions soumises à des vibrations présentaient une expression élevée de HA synthase-2 (HAS2), la décorine, la fibromoduline et la métalloprotéinase matricielle-1 (MMP1), par rapport aux témoins statiques. Les effets stimulants sont révélés être dépendants du temps. Plus récemment, notre groupe ^{de 18} a réuni une fois bioréacteur vocal (J1 bioréacteur) en utilisant un amplificateur de puissance, un générateur de fonctions, un haut-parleur clos et une membrane de silicone circonférence ancrée qui transfère l'air oscillant aux cellules attachées. Des fibroblastes de prépuce néonatal cultivées dans le bioréacteur à J1 ont été soumis à 1 h de vibration à 60, 110 ou 300 Hz, avec une déformation dans le plan d'au plus 0,05%. Les résultats de qPCR ont suggéré que l'expression de certains gènes de la MEC a été légèrement modifiée en réponse à des fréquences vibratoires variéeset amplitudes.

Ces conceptions de bioréacteurs, tandis intrigante, présentent plusieurs limites. Par exemple, le système T1 nécessite un grand nombre de connecteurs et de barres de couplage mécanique, ce qui limite les fréquences maximales réalisables. De plus, les cellules peuvent être soumises à une agitation mécanique indésirable et fluide perturbation qui complique l'interprétation des données. Le bioréacteur à J1, d'autre part, présente une efficacité relativement faible de conversion d'énergie et n'est pas facile à utiliser. En outre, les vibrations se détache souvent les constructions cellulaires chargées de la membrane de silicone sous-jacent. Le J2 cordes vocales bioréacteur rapporté ici, conçu sur la base du même principe que la version J1, est optimisée pour l'uniformité et la reproductibilité. Les vibrations de la phonation imitant sont générés aérodynamique dans des chambres de vibrations équipés individuellement où poly fibreux MSC-peuplé (ε-caprolactone) (PCL) échafaudages sont effectively fixé. Laser Doppler Vibrométrie (LDV) permet à l'utilisateur de vérifier le profil vibratoire de l'ensemble membrane / échafaud. Dans notre démonstration, les CSM sont exposés à 200 Hz vibrations sinusoïdales avec un (DE) modèle 1-hr-sur-1-h-off pour un total de 12 heures par jour pendant 7 jours. Les réponses cellulaires aux signaux vibratoires imposées sont étudiées systématiquement. Dans l'ensemble, la corde vocale J2 fournit la plupart des fonctionnalités conviviales, permettant des études de culture cellulaire dynamique à être menées dans un débit élevé et de façon reproductible.

Protocole

Assemblée bioréacteur 1. (Vidéo 1)

1. Faire un moule en aluminium (de filière circulaire + entretoise broches) avec des dimensions intérieures et extérieures prédéterminées (Figure 1).
2. Utilisation du moule à partir de l'étape 1.1, la fabrication d'une membrane en silicone (diamètre: 42 mm, épaisseur: 1,5 mm, figure 1) avec un manchon retranché (diamètre: 12 mm, épaisseur ~ 0,25 mm, formée par la broche d'écartement sur ​​la figure 1) en le milieu à l'aide d'un kit d'élastomère de silicone disponible dans le commerce.
3. Faites une paire de blocs acryliques (Figure 2 (4, 5)) avec une ouverture circulaire (diamètre: 24 mm) au milieu, graver le haut (1,8 cm d'épaisseur) et bas (0,9 cm d'épaisseur) des blocs avec des crêtes correspondant et rainures ^10.
4. Prendre en sandwich la membrane de silicone entre les blocs acryliques appariés. Fixez l'ensemble avec quatre vis d'angle à l'aide d'un tournevis dynamométrique micro fixé à une force constante (35 cN · m). En conséquence, un étanche à l'eau, 24 mm de large et 18 mm chambre de vibration profonde est créée (figure 2C).
5. Monter une ^"gamme étendue mini-woofer 3 (figure 2D, 8 Ω/20 W) sous la chambre de vibration par un autre jeu de vis de coin sur le bloc acrylique fond. A ce point, un module de vibration individuelle est assemblé.
6. Répliquer sept modules de vibration supplémentaires. Apposer quatre d'entre eux à l'une des deux barres d'aluminium fixes (40 cm x 10 cm x 2,5 cm) en plaçant les bases d'enceintes dans des trous circulaires régulièrement espacées (diamètre: 7 cm, épaisseur: 2 cm) découpées dans les bars. Stabiliser chaque haut-parleur en insérant une vis dans le côté de la barre d'aluminium dans chaque trou circulaire.
7. Contrôler individuellement les haut-parleurs par un sélecteur de haut-parleur. Connectez les enceintes individuelles pour le sélecteur de fixer des fils aux entrées positives et négatives sur le corps du haut-parleur, puis aux sorties correspondantes sur le sélecteur. Le sélecteur de haut-parleur permet au signal de til générateur de fonction, après avoir traversé un amplificateur de puissance, pour atteindre les huit haut-parleurs à la fois (figure 2E).
8. Placez les deux tableaux de la chambre, le sélecteur de haut-parleur et l'électronique associée à un boîtier anti-humidité. Loger la totalité de l'ensemble dans un incubateur de culture cellulaire du commerce.
9. Nourrir les câbles principaux (à travers un tube de PVC de qualité médicale) reliant l'amplificateur de puissance et le sélecteur d'enceinte à travers l'ensemble de filtre à l'arrière de l'incubateur.

2. Fabrication d'échafaudage et caractérisation

1. Dissoudre pastilles PCL dans le chloroforme à une concentration de 15% en poids. Chargez la solution dans une seringue de 10 ml surmonté d'une aiguille émoussée 21 G.
2. Verrouiller la seringue sur une pompe à seringue programmable et régler le débit à 1 ml / h.
3. Placez le collecteur de papier d'aluminium aluminium en face de l'aiguille horizontalement, avec une aiguille distance pointe-à-collecteur de ~ 18 cm.
4. Fixer le alli positifalligator clip pour le milieu de l'aiguille, et la pince crocodile de terre au collecteur d'aluminium, puis réglez la tension de l'alimentation haute tension à 15 kV. ATTENTION: haute tension, maintenir la distance de l'aiguille.
5. Activer de façon séquentielle sur la pompe à seringue et l'alimentation électrique; nettoyer rapidement / retirer de la solution de polymère résiduel entourant la pointe de l'aiguille à l'aide d'une serviette en papier avant jets de fibres stable et Taylor cône ¹⁹ sont formés.
6. Laisser les fibres de s'accumuler sur le collecteur Al jusqu'à une épaisseur de 250 à 300 um ~ (~ 7 h dans les conditions de filage de courant). Stocker les échafaudages obtenus dans un dessiccateur sous vide pendant 1 à 2 jours pour éliminer tout solvant résiduel.
7. Image, les échafaudages, applique par pulvérisation avec de l'or, à l'aide d'un microscope électronique à balayage pour montrer cohérent morphologie de la fibre. ¹⁰

3. Assemblée bioréacteur et caractérisation

1. Percez un disque cylindrique (diamètre: 8 mm) avec quatre bras (longueur: 2mm) sur le tapis PCL à l'état filé (figure 2A) en utilisant d'abord un diamètre de 12 mm poinçon de biopsie pour couper le diamètre extérieur du disque. Ensuite, utilisez une deuxième, 8 mm biopsie punch pour faire quatre 2 mm de long encoches espacées uniformément autour de la lame circulaire de marquer où les armes sont à couper. Après avoir marqué avec le poinçon de 8 mm, utiliser une lame de scalpel pour couper les bords des bras vers l'extérieur. Insérer l'échafaudage dans la rainure de la membrane en silicone par l'intermédiaire des bras étendus (vidéo 1). Aplatir l'échafaud inséré en appuyant doucement sur la surface en utilisant des pinces à tête plate.
2. Attacher un petit morceau de feuille mince d'Al (8 mm x 2 mm, forme orthogonale, figure 2B) à l'échafaud PCL pour aider à la réflexion laser.
3. Bloquer la membrane silicone / PCL échafaudage assemblée (comme indiqué dans l'étape 1.4) dans la chambre de vibration. Ajouter 1,5 ml d'eau dans la chambre pour hydrater l'échafaud PCL avant vibrations.
4. Utilisation du générateur de fonction, introduire le signe de vibrationsal (par exemple, 200 Hz ondes sinusoïdales avec une tension crête-à-crête, Vpp, de 0,1 V) à la chambre acrylique prise en sandwich. Utilisez un voltmètre pour mesurer avec précision la tension à chaque entrée du haut-parleur. Remarque: la lecture Vcc du générateur de fonction sera différente de la tension éventuelle livré à l'orateur.
5. Assemblez le seul point LDV et sécuriser le laser tête de capteur à fibre optique sur un trépied à tête pan-tilt. Angle de la tête de capteur de sorte qu'il est orienté perpendiculairement à la table. Raccorder la tête de capteur de LDV au module d'acquisition de données par l'intermédiaire d'un câble coaxial ensuite le module à l'ordinateur portable via USB.
6. Focaliser le faisceau laser perpendiculairement à différents points prédéterminés sur la membrane en silicone (figure 2B et la figure 3).
7. Utilisation du logiciel d'acquisition de données, enregistrer le déplacement mi-membrane. Cliquez sur "Paramètres d'acquisition" dans le menu "Options"; puis changer le mode de mesure à "FFT221;. Ensuite, cliquez sur le "mesure continue" dans la barre d'outils principale puis cliquez sur le pic qui se forme à la fréquence choisie (Figure 6D) pour enregistrer le déplacement.
8. Tracer le déplacement mi-membrane normal (w ₀₎ en fonction de la position relative entre le substrat. Construire une palette de couleurs 3D du profil vibratoire de surface à l'aide Origine logiciel d'analyse de données 8.5.

4. Vibrante culture cellulaire

1. MSC dérivées de moelle osseuse sous-culture T150 humain dans des flacons de culture de tissu avec une densité d'ensemencement initiale de 4000-5000 cellules / cm ² dans les milieux d'entretien MSC.
2. Après 7-8 jours de culture cellulaire (à ~ 85% de confluence), trypsiniser les cellules avec un réactif de dissociation cellulaire tel que Accutase, compter l'aide d'un hématimètre, centrifugeuse (440 g pendant 5 min), et remettre en suspension le culot cellulaire dans milieu d'entretien frais de MSC à une concentration de 4,5 x 10 ⁶ cellules / ml.
3. Plonger la Scaffo PCLld éthanol à 70% O / N. Après que le solvant est évaporé, exposer les deux côtés de l'échafaudage à la lumière UV germicide (254 nm) pour 5-8 minutes.
4. Faire tremper l'échafaud PCL dans une solution de fibronectine 20 pg / ml à 37 ° C pendant 1 heure. Insérer l'échafaudage de fibronectine dans la membrane en silicone. Assemblez le bioréacteur tel que détaillé à l'étape 1.
5. Distribuer 40 ul de la suspension cellulaire uniformément sur l'échafaud PCL sécurisé. Permettent aux cellules de se fixer pour 1 à 1,5 h avant d'ajouter encore 1,5 ml de milieu frais à la chambre de vibration.
6. Culture de l'échafaud PCL MSC chargé statiquement pendant 3 jours et rafraîchir les médias à la fin de la culture statique.
7. Imposer des régimes de vibration sélectionnés pour les constructions cellulaires. Remarque: Par exemple, les cellules sont soumises à un 1-hr-sur-1-h-off (DE) vibrations à 200 Hz avec aw ₀ de ~ 40 um pendant 12 heures par jour pour un maximum de 7 jours. Constructions soumises à des stimulations vibratoires sont désignés comme échantillons Vib et les culturouge statique dans des chambres de vibrations identiques servent de témoins statiques (STAT).

5. Évaluations biologiques

1. Recueillir 200 ul de milieux de culture cellulaire à partir de chaque chambre tous les deux jours (jours 1, 3, 5 et 7) et en commun des fractions aliquotes d'un même échantillon en même temps (800 ul chacun).
2. Quantifier la production cellulaire de la matrice métalloprotéinase-1 (MMP1) et HA en utilisant un kit ELISA MMP1 développement et un kit ELISA de compétition de l'acide hyaluronique, respectivement, à la suite de la procédure des fabricants. Pendant ce temps, le dosage de la production de précurseur de l'élastine soluble suivant la procédure ELISA précédemment rapporté. ^Huit
3. À la fin du dernier cycle de vibration au jour 7, supprimer rapidement les constructions cellulaires des chambres de vibrations à l'aide de pinces acérées et brièvement les rincer avec de phosphate froid (PBS, 4 ° C).
4. Pour la coloration en direct / mort, incuber les constructions avec l'iodure de propidium (1:2000 dans du PBS) etSyto-13 (1:1000 dans du PBS) en même temps pendant 5 min à température ambiante. Image Les constructions colorées avec un microscope confocal multiphotonique.
5. Séparément, enfichable geler les constructions cellulaires PBS rincés sur glace sèche et d'extraire l'ARN cellulaire total en suivant un protocole indiqué précédemment pour l'analyse génétique. ⁹
6. Vérifiez la quantité et la qualité de l'ARN extrait à l'aide d'un spectrophotomètre UV-Vis. échantillons d'ARN avec des ratios de 1,8-2,2 A260/A280 et A260/A230 sont utilisées pour l'analyse qPCR ultérieure.
7. N º de transcrire l'ARN (500 ng / échantillon) en ADNc en utilisant un kit de transcription inverse disponible dans le commerce.
8. Effectuer la réaction de PCR sur un système de détection de séquence en temps réel en utilisant un mélange maître PCR disponible dans le commerce en suivant la procédure détaillée précédemment. ⁸
9. Analyser les résultats de qPCR en utilisant un logiciel d'analyse de données qPCR commerciale. Pour assurer la fiabilité de l'analyse de données, plusieurs gènes de référence (YWHAZ, BPT, PPIA) sont utilisés comme intcontrôles ernal, et la variance de l'efficacité des amorces spécifiques sont pris en compte. ⁸

Résultats

Les échafaudages PCL fabriqués par électrofilage contiennent des pores interstitiels de taille micronique et des fibres enchevêtrées de manière aléatoire ayant un diamètre moyen de 4,7 pm (Figure 4A). A plus fort grossissement, rainures et pores nanométriques sont visibles sur fibres individuelles (figure 4B). Revêtement des échafaudages avec la fibronectine améliore le caractère hydrophile et facilite l'adhérence cellulaire initiale / épandage sur l'échafaudage ...

Discussion

L'ingénierie des tissus succès des cordes vocales fonctionnels in vitro nécessite la recréation d'un pli comme micro vocal à la médiation des comportements de cellules multipotentes. Il est généralement admis que les structures de tissus ou d'organes reflètent les fonctions qu'ils sont appelés à exécuter. ²² Pour les tissus des cordes vocales, les vibrations de haute fréquence qui se produisent pendant la phonation sont proposées pour être important pour la maturation d...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
silicone elastomer kit	Dow Corning	Sylgard 184	cure the membrane at 100 C for 2 hr
PCL	Sigma Aldrich	440744-500G	Mn ~ 80 kDa, dissolve overnight
chloroform	Sigma Aldrich	C7559-5VL
human bone marrow-derived MSCs	Lonza	PT-2501	received with passage 2
MSC maintenance media	Lonza	PT-3001	10% FBS in basal media supplemented with L-glutamine, gentamicin and amphotericin
Accutase cell dissociation reagent	Life Technologies	A11105-01
ethanol	Sigma Aldrich	E7023-500ML
fibronectin	Sigma Aldrich	F2006-1MG
MMP1 DuoSet ELISA kit	R&D systems	DY901
HA ELISA kit	Echelon Biosciences	K-1200
PBS	Life Technologies	14190-136
propidium iodide	Life Technologies	P1304MP
Syto-13	Life Technologies	S7575
QuantiTect reverse transcription kit	Qiagen	205311
SYBR Green PCR master mix	Life Technologies	4309155
replacement speaker	DAYTON audio (via Parts Express)	DS90-8	paper cone, full range (80-13000 Hz), 85dB
Ergo Micro torque screwdriver	Mountz	# 020377	torque range: 20-120 cN.m
stereo speaker selector	RadioShack	40-244	maximum power handling 50 W
function generator	Agilent	33220A	frequency range 1 µHz- 20 MHz
power amplifier	PYLE audio	PylePro PT2400	frequency response: 10 Hz-50 kHz, two speaker channels
cell culture incubator	Thermo Fisher	Steri-Cult 3307
syringe pump	New Era Pump Systems	NE-300
High voltage power supply	Spellman	CZE 1000R	output voltage: 0-30 kV
scanning electron microscope	JEOL-USA	JSM-7400F
desk gold sputter coater	Denton Vacuum	DSK00V-0013
Doppler laser vibrometer	Polytec	PDV-100	non-contact velocity measurement (0-22 kHz)
PCR sequence detection system	Applied Biosystems	ABI7300
multiphoton confocal microscope	Zeiss	Zeiss 510Meta NLO
UV-VIS Spectrophotometer	NanoDrop Products via Thermo Scientific	ND-2000
VibSoft Data Acquisition Software	Polytec		acquisition bandwidth up to 40 MHz
Origin 8.5 data analysis software	OriginLab
qbasePlus qPCR data analysis software	Biogazelle	V2.3
aluminium alloy	McMaster-Carr	Alloy 6061
acrylic blocks	McMaster-Carr
polycarbonate anti-humidity chamber	McMaster-Carr		Impact-Resistant Polycarbonate
screws	McMaster-Carr
electronic cable/wire
medical grade PVC tubing	US Plastic Corp.	Tygon S-50-HL	clear, biocompatible
10 mL syringe	Becton Dickinson	309604
21 G blunt ended needle	Small Parts	NE-213PL-25	1-1/2" length
Alligator clip adapters	RadioShack	270-354	fully insulated
8 mm biopsy punch	Sklar Surgical Instruments	96-1152	sterile, disposable
12 mm biopsy punch	Acuderm (via Fisher Scientific)	NC9998681
tissue culture flasks	Corning		cell culture treated