Costruzione e caratterizzazione di un Fold bioreattore Novel Vocal

Riepilogo

A novel vocal fold bioreactor capable of delivering physiologically relevant, vibratory stimulation to cultured cells is constructed and characterized. This dynamic culture device, when combined with a fibrous poly(ε-caprolactone) scaffold, creates a vocal fold-mimetic environment that modulates the behaviors of mesenchymal stem cells.

Abstract

In vitro engineering of mechanically active tissues requires the presentation of physiologically relevant mechanical conditions to cultured cells. To emulate the dynamic environment of vocal folds, a novel vocal fold bioreactor capable of producing vibratory stimulations at fundamental phonation frequencies is constructed and characterized. The device is composed of a function generator, a power amplifier, a speaker selector and parallel vibration chambers. Individual vibration chambers are created by sandwiching a custom-made silicone membrane between a pair of acrylic blocks. The silicone membrane not only serves as the bottom of the chamber but also provides a mechanism for securing the cell-laden scaffold. Vibration signals, generated by a speaker mounted underneath the bottom acrylic block, are transmitted to the membrane aerodynamically by the oscillating air. Eight identical vibration modules, fixed on two stationary metal bars, are housed in an anti-humidity chamber for long-term operation in a cell culture incubator. The vibration characteristics of the vocal fold bioreactor are analyzed non-destructively using a Laser Doppler Vibrometer (LDV). The utility of the dynamic culture device is demonstrated by culturing cellular constructs in the presence of 200-Hz sinusoidal vibrations with a mid-membrane displacement of 40 µm. Mesenchymal stem cells cultured in the bioreactor respond to the vibratory signals by altering the synthesis and degradation of vocal fold-relevant, extracellular matrix components. The novel bioreactor system presented herein offers an excellent in vitro platform for studying vibration-induced mechanotransduction and for the engineering of functional vocal fold tissues.

Introduzione

La piega vocale umano, composto da uno strato epiteliale, la lamina propria (LP) e il muscolo vocalis, è un tessuto morbido specializzato che converte il flusso d'aria dai polmoni in onde acustiche per la produzione del suono. ¹ corde vocali oscillano regolarmente durante la fonazione normale, esibendo ceppi fino al 30% a frequenze fondamentali che vanno 100-300 Hz. ² Adult corde vocali LP è una struttura composta da un gradiente superficiale (SLP), intermedio (ILP) e una profondità (DLP) strato. Altri gruppi di classificazione l'epitelio e la SLP come lo strato mucosa, e combina la ILP e DLP nel legamento vocale. ³ Lo strato SLP contiene principalmente una matrice amorfa con fibre di collagene scarsamente disperse, mentre il legamento è arricchita con collagene maturo e fibre di elastina per fornire resistenza sufficiente. ⁴ La struttura e la meccanica di corde vocali neonato variano significativamente dai loro omologhi maturi. Anche se il meccanismos che regolano lo sviluppo delle corde vocali e la maturazione non sono ancora pienamente compresi, evidenze sperimentali ha sottolineato il ruolo di definizione di stress meccanico vocalizzazione-derivati.

Diverse condizioni mediche, tra cui l'abuso vocale, infezioni, sostanze chimiche irritanti e procedure chirurgiche, possono danneggiare la piega vocale. Patologie delle corde vocali colpiscono circa 3-9% della popolazione degli Stati Uniti. Metodi di trattamento correnti per i disturbi delle corde vocali sono limitati ⁵ e un tessuto approccio ingegneristico a base di cellule staminali è emerso come una strategia promettente per il ripristino della funzionalità delle corde vocali. Cellule staminali mesenchimali (MSC) sono una valida alternativa alle corde vocali fibroblasti primari per vocale ingegneria tissutale piega. ^6-9 specifica destino delle cellule staminali e lo sviluppo del tessuto successivo sono mediati dalla specifica nicchia risiedono in, cui la condizione meccanica è un fattore vitale. ^dieci forze meccaniche sono regolatori essenziali di tessuto morfogenesi unnd omeostasi, particolarmente per tessuti che siano periodicamente sottoposti a carico. ¹¹ Da una prospettiva ingegneria dei tessuti, è stato dimostrato che l'esposizione a fisiologicamente rilevanti stimolazioni meccaniche promuove differenziazione delle cellule staminali e tessuto-specifico rimodellamento della matrice. ^12-15

Bioreattori coltura tissutale sono progettati per simulare l'ambiente fisiologico desiderato per cellula o tessuto crescita in vitro. Per vocale ingegneria dei tessuti piega, è particolarmente critico per ricreare l'ambiente meccanico delle phonating corde vocali. Una piega ideale bioreattore vocale dovrebbe effettivamente fornire spunti vibranti di cellule in coltura, permettendo il controllo facile su frequenza, ampiezza e la durata delle vibrazioni. Titze e collaboratori hanno realizzato una piega bioreattore vocale (T1 bioreattore) ¹⁶ che combina tratto statico ad alta frequenza (20-200 Hz) oscillazioni di stimolare la produzione cellulare di proteine ​​della matrice. Using questo bioreattore, Webb e colleghi ¹⁷ hanno studiato gli effetti di 10 giorni, vibrazioni 100 Hz su fibroblasti dermici in coltura in un acido ialuronico (HA) a base di idrogel. Costrutti soggetti a vibrazioni esposte un'elevata espressione di HA sintasi-2 (HAS2), decorin, fibromodulin e matrice metalloproteinasi-1 (MMP1), rispetto ai controlli statici. Gli effetti di stimolazione sono risultate essere dipendente dal tempo. Più di recente, il nostro gruppo ¹⁸ montato una piega bioreattore vocale (J1 bioreattore) utilizzando un amplificatore di potenza, un generatore di funzioni, un altoparlante chiuso e una membrana in silicone circonferenzialmente ancorato che trasferisce l'aria oscillante per le cellule attaccate. Fibroblasti prepuzio neonatali coltivate nel bioreattore J1 stati sottoposti a 1 ora di vibrazione a 60, 110 o 300 Hz, con un ceppo in piano fino al 0,05%. I risultati qPCR suggerito che l'espressione di alcuni geni ECM è stata moderatamente alterata in risposta alle varie frequenze vibratoriee ampiezze.

Questi disegni bioreattori, mentre intrigante, hanno diverse limitazioni. Ad esempio, il sistema T1 richiede un gran numero di connettori e barre per l'accoppiamento meccanico, limitando le frequenze massima raggiungibile. Inoltre, le cellule possono essere sottoposti a indesiderabile agitazione e fluido meccanica perturbazione che complicano l'interpretazione dei dati. Il bioreattore J1, invece, presenta relativamente bassa efficienza di conversione energetica e non è facile da usare. Inoltre, le vibrazioni si stacca spesso i costrutti cellulari carichi dalla membrana di silicone sottostante. Il J2 vocale piega bioreattore riportato qui, sviluppata sulla base dello stesso principio della versione J1, è ottimizzata per consistenza e riproducibilità. Le vibrazioni-fonazione mimando vengono generati aerodinamicamente in camere dotate di vibrazione individuale, laddove poli fibroso MSC-popolato (ε-caprolattone) (PCL) impalcature sono effectively assicurato. Laser Doppler Vibrometry (LDV) consente all'utente di verificare il profilo vibratorio del gruppo membrana / scaffold. Nella nostra dimostrazione, MSC sono esposti a 200 Hz vibrazioni sinusoidali con (OF) modello 1-hr-1-hr-off per un totale di 12 ore al giorno per 7 giorni. Risposte cellulari agli stimoli vibratori imposte sono indagati sistematicamente. Nel complesso, la piega vocale J2 offre le caratteristiche più user-friendly, che permette studi di coltura cellulare dinamica per essere condotti in un elevato throughput e della moda riproducibile.

Protocollo

Bioreattore Assembly 1. (Video 1)

1. Effettuare uno stampo di alluminio (pressofusione circolare + perno distanziale) con pre-determinati dimensioni interne ed esterne (Figura 1).
2. Utilizzando lo stampo dal punto 1.1, fabbricare una membrana di silicone (diametro: 42 mm, spessore: 1,5 mm Figura 1) con un manicotto radicata (diametro: 12 mm, spessore ~ 0,25 millimetri, forma dal perno distanziale in figura 1) mezzo utilizzando un kit disponibile in commercio elastomero siliconico.
3. Effettuare una coppia di blocchi acrilici (Figura 2 (4, 5)) con un foro circolare (diametro: 24 mm) al centro, incidere la parte superiore (spessore 1,8 centimetri) e inferiore (spessore 0,9 centimetri) blocchi con nervature ei solchi corrispondenti . ¹⁰
4. Panino la membrana di silicone tra i blocchi acrilici associati. Fissare il gruppo con quattro viti d'angolo con un cacciavite coppia di micro impostato su una forza costante (35 cN · m). Come risultato, una tenuta d'acqua, 24 mm di larghezza e 18 mm camera di vibrazione profonda viene creato (Figura 2C).
5. Montare un ^"extended range mini-woofer 3 (Figura 2D, 8 Ω/20 W) sotto la camera di vibrazione attraverso un altro set di viti d'angolo sul blocco acrilico fondo. A questo punto, un singolo modulo vibrazione viene assemblato.
6. Replicare sette moduli aggiuntivi vibrazioni. Applicare quattro di loro in uno dei due bar in alluminio fissi (40 cm x 10 cm x 2,5 cm), ponendo le basi degli altoparlanti a fori circolari equidistanti (diametro: 7 cm, spessore: 2 cm) tagliate a barre. Stabilizzare ciascun diffusore inserendo una vite attraverso il lato della barra di alluminio in ogni foro circolare.
7. Controllare singolarmente i diffusori da un selettore speaker. Collegare i singoli diffusori al selettore collegando fili agli ingressi positivo e negativo sul corpo diffusore poi alle uscite corrispondenti sul selettore. Il selettore altoparlante consente al segnale da tegli generatore di funzioni, dopo il passaggio attraverso un amplificatore di potenza, di raggiungere tutti otto altoparlanti contemporaneamente (Figura 2E).
8. Posizionare i due array da camera, il selettore speaker ed elettronica associati in un recinto anti-umidità. Casa l'intero gruppo in uno spot coltura cellulare incubatore.
9. Far passare i cavi principali (attraverso un tubo in PVC di grado medicale) che collega l'amplificatore di potenza e selettore diffusore attraverso il gruppo filtro posteriore del termostato.

2. Fabrication Scaffold e Caratterizzazione

1. Sciogliere pellet PCL in cloroformio ad una concentrazione del 15% in peso. Caricare la soluzione in una siringa da 10 ml con tappo con un ago smussato-ended 21 G.
2. Bloccare la siringa su una pompa a siringa programmabile e impostare la portata a 1 ml / hr.
3. Posizionare il collettore foglio di alluminio coperto di fronte l'ago in senso orizzontale, con un ago punta a collettore distanza di ~ 18 cm.
4. Bloccare il alli positivogator clip per mezzo dell'ago, e il coccodrillo terra al collettore di alluminio, quindi impostare la tensione dell'alimentatore ad alta tensione a 15 kV. ATTENZIONE: alta tensione, mantenere la distanza dal ago.
5. Sequenzialmente accendere la pompa a siringa e alimentazione; rapidamente pulito / rimuovere la soluzione di polimero residuo circonda la punta dell'ago con un tovagliolo di carta asciutto prima getti fibre stabile e Taylor cono ¹⁹ sono formate.
6. Lasciare le fibre di accumulare sul collettore Al ad uno spessore di 250-300 micron ~ (~ 7 ore sotto le condizioni di filatura correnti). Conservare i ponteggi risultanti in un essiccatore a vuoto per 1-2 giorni per rimuovere qualsiasi solvente residuo.
7. Immagine i ponteggi, farfugliare ricoperti di oro, utilizzando un microscopio elettronico a scansione per mostrare fibra morfologia coerente. ¹⁰

3. Assemblea bioreattore e Caratterizzazione

1. Punch un disco cilindrica (diametro 8 mm), con quattro braccia (lunghezza: 2mm) dal tappeto come filato PCL (Figura 2A), utilizzando dapprima a 12 mm di diametro biopsia per tagliare il diametro esterno del disco. Quindi utilizzare un secondo, 8 millimetri biopsia per fare quattro due millimetri lunghi tacche equidistanti attorno alla lama circolare per segnare dove le braccia sono da tagliare. Dopo aver eseguito con il punzone 8 mm utilizzare una lama di bisturi per tagliare i bordi delle braccia verso l'esterno. Inserire il scaffold nella scanalatura della membrana di silicone con le braccia tese (Video 1). Appiattire l'impalcatura inserita premendo delicatamente la superficie con una pinzetta piatta.
2. Collegare un piccolo pezzo di sottile foglio di alluminio (8 mm x 2 mm forma ortogonale, Figura 2B) al patibolo PCL per aiutare la riflessione laser.
3. Fissare il silicone membrana / scaffold PCL assemblato (come specificato nel punto 1.4), nella camera di vibrazione. Aggiungere 1,5 ml di acqua nella camera per idratare il scaffold PCL prima vibrazione.
4. Utilizzando il generatore di funzioni, introdurre segno vibrazioniALS (ad esempio, 200 Hz onde sinusoidali con una tensione picco-picco, Vpp, di 0,1 V) alla camera acrilico sandwich. Utilizzare un voltmetro per misurare con precisione la tensione in ogni ingresso diffusore. Nota: la lettura Vpp dal generatore di funzione diverso dal l'eventuale tensione erogata all'altoparlante.
5. Montare l'unico punto LDV e fissare il sensore laser testa in fibra ottica a un treppiede testa pan-tilt. Angle la testa del sensore in modo che sia rivolta perpendicolare al tavolo. Collegare la testa del sensore LDV al modulo di acquisizione dati via cavo coassiale quindi il modulo al portatile tramite USB.
6. Focalizzare il fascio laser perpendicolarmente in vari punti predeterminati sulla membrana di silicone (Figura 2B e Figura 3).
7. Utilizzando il software di acquisizione dati, registrare lo spostamento intermedio membrana. Fare clic su "Impostazioni di acquisizione" dal menu "Opzioni"; quindi cambiare la modalità di misura a "FFT221;. Quindi, fare clic su "Misura continua" nella barra degli strumenti principale quindi il picco che si forma alla frequenza prescelta (Figura 6D) per registrare lo spostamento.
8. Graficamente lo spostamento intermedio membrana normale (w ₀₎ in funzione della posizione relativa sul substrato. Costruire una mappa di colori 3D del profilo di vibratorio superficie con Origin software di analisi dei dati 8.5.

4. Cell Culture vibrante

1. MSC derivate dal midollo osseo sub-cultura umana nei T150 fiasche di coltura tissutale ad una densità di semina iniziale di 4000-5000 cellule / cm ² in MSC manutenzione media.
2. Dopo 7-8 giorni di coltura cellulare (a ~ 85% di confluenza), trypsinize le cellule con un reagente di dissociazione cellulare come accutase, contare con un emocitometro, centrifuga (440 xg per 5 min), e risospendere il pellet cellulare in mezzi freschi manutenzione MSC ad una concentrazione di 4,5 x 10 ⁶ cellule / ml.
3. Immergere la scaffo PCLld in etanolo al 70% O / N. Dopo che il solvente viene evaporato, esporre entrambi i lati del ponteggio per germicida luce UV (254 nm) per 5-8 min.
4. Bagnare il scaffold PCL in una soluzione fibronectina 20 ug / ml a 37 ° C per 1 ora. Inserire il scaffold fibronectina rivestite nella membrana di silicone. Montare il bioreattore come descritto al punto 1.
5. Distribuire 40 ml di sospensione cellulare uniformemente sulla forca PCL protetto. Permettono alle cellule di attaccarsi per 1-1,5 ore prima di aggiungere un ulteriore 1,5 ml di mezzi freschi alla camera vibrazioni.
6. Cultura patibolo PCL MSC-carico statico per 3 giorni e aggiornare il supporto dopo il completamento della cultura statica.
7. Imporre regimi di vibrazione selezionati i costrutti cellulari. Nota: Per esempio, le cellule vengono sottoposte ad un 1-hr-1-hr-off (OF) vibrazioni a 200 Hz con aw di ₀ ~ 40 pm per 12 ore al giorno per 7 giorni. Costruisce sottoposti a stimoli vibratori sono designati come campioni Vib e quelli culrosso staticamente in camere vibrazioni identiche servono controlli statici (Stat).

5. Valutazioni Biologiche

1. Raccogliere 200 microlitri di cellule di coltura da ciascuna camera ogni altro giorno (giorno 1, 3, 5 e 7) e unire le aliquote dello stesso campione insieme (800 ml ciascuna).
2. Quantificare la produzione cellulare di matrice metalloproteinasi-1 (MMP1) e HA utilizzando un kit ELISA MMP1 Sviluppo e acido ialuronico kit ELISA competitivo, rispettivamente seguente procedura dei costruttori. Nel frattempo, saggiare la produzione di precursore solubile elastina seguendo la procedura ELISA precedentemente riportato. ⁸
3. Al termine dell'ultimo ciclo di vibrazione al giorno 7, rimuovere rapidamente i costrutti cellulari dalle camere vibrazione usando pinzette taglienti e brevemente sciacquare con fosfato freddo salina tamponata (PBS, 4 ° C).
4. Per il live colorazione / morto, incubare i costrutti con ioduro di propidio (1:2.000 in PBS) eSyto-13 (1:1000 in PBS) per 5 minuti a temperatura ambiente. Immagine costrutti colorati con un microscopio confocale multiphoton.
5. Separatamente, snap-congelare i costrutti cellulari PBS-sciacquati in ghiaccio secco ed estrarre l'RNA cellulare totale seguendo un protocollo riportato in precedenza per l'analisi del gene. ⁹
6. Verificare la quantità e la qualità del RNA estratto utilizzando un UV-Vis. Campioni di RNA con A260/A280 e A260/A230 rapporti di 1,8-2,2 sono utilizzati per la successiva analisi qPCR.
7. Reverse trascrivere RNA (500 ng / campione) in cDNA usando un kit disponibile in commercio trascrizione inversa.
8. Eseguire la reazione di PCR su un sistema di rilevamento di sequenze in tempo reale usando una miscela master PCR disponibile in commercio seguendo la procedura precedentemente descritto. ⁸
9. Analizzare i risultati qPCR utilizzando software commerciale di analisi dei dati qPCR. Per garantire l'affidabilità delle analisi dei dati, più geni di riferimento (YWHAZ, TBP, PPIA) sono impiegati come intcontrolli ernal, e la varianza dei rendimenti specifici di primer viene presa in considerazione. ⁸

Risultati

Le impalcature PCL fabbricati da elettrofilatura contengono pori interstiziali dimensioni micron e fibre aggrovigliate in modo casuale, con un diametro medio di 4,7 micron (Figura 4A). Con un ingrandimento maggiore, scanalature e nanoscala pori sono visibili su singole fibre (Figura 4B). Rivestimento dei ponteggi con fibronectina migliora idrofilia e facilita l'adesione iniziale delle cellule / diffusione sul patibolo PCL (osservazione inedito).

Forme d&...

Discussione

Ingegneria di successo di tessuti funzionali delle corde vocali in vitro richiede la ricreazione di una piega simile microambiente vocale per mediare i comportamenti di cellule multipotenti. E 'generalmente accettato che le strutture dei tessuti o organi riflettono le funzioni che sono chiamati a svolgere. ²² Per i tessuti delle corde vocali, le vibrazioni ad alta frequenza che si verificano durante la fonazione sono proposti per essere importante per la maturazione del tessuto. Nel nostro studio...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
silicone elastomer kit	Dow Corning	Sylgard 184	cure the membrane at 100 C for 2 hr
PCL	Sigma Aldrich	440744-500G	Mn ~ 80 kDa, dissolve overnight
chloroform	Sigma Aldrich	C7559-5VL
human bone marrow-derived MSCs	Lonza	PT-2501	received with passage 2
MSC maintenance media	Lonza	PT-3001	10% FBS in basal media supplemented with L-glutamine, gentamicin and amphotericin
Accutase cell dissociation reagent	Life Technologies	A11105-01
ethanol	Sigma Aldrich	E7023-500ML
fibronectin	Sigma Aldrich	F2006-1MG
MMP1 DuoSet ELISA kit	R&D systems	DY901
HA ELISA kit	Echelon Biosciences	K-1200
PBS	Life Technologies	14190-136
propidium iodide	Life Technologies	P1304MP
Syto-13	Life Technologies	S7575
QuantiTect reverse transcription kit	Qiagen	205311
SYBR Green PCR master mix	Life Technologies	4309155
replacement speaker	DAYTON audio (via Parts Express)	DS90-8	paper cone, full range (80-13000 Hz), 85dB
Ergo Micro torque screwdriver	Mountz	# 020377	torque range: 20-120 cN.m
stereo speaker selector	RadioShack	40-244	maximum power handling 50 W
function generator	Agilent	33220A	frequency range 1 µHz- 20 MHz
power amplifier	PYLE audio	PylePro PT2400	frequency response: 10 Hz-50 kHz, two speaker channels
cell culture incubator	Thermo Fisher	Steri-Cult 3307
syringe pump	New Era Pump Systems	NE-300
High voltage power supply	Spellman	CZE 1000R	output voltage: 0-30 kV
scanning electron microscope	JEOL-USA	JSM-7400F
desk gold sputter coater	Denton Vacuum	DSK00V-0013
Doppler laser vibrometer	Polytec	PDV-100	non-contact velocity measurement (0-22 kHz)
PCR sequence detection system	Applied Biosystems	ABI7300
multiphoton confocal microscope	Zeiss	Zeiss 510Meta NLO
UV-VIS Spectrophotometer	NanoDrop Products via Thermo Scientific	ND-2000
VibSoft Data Acquisition Software	Polytec		acquisition bandwidth up to 40 MHz
Origin 8.5 data analysis software	OriginLab
qbasePlus qPCR data analysis software	Biogazelle	V2.3
aluminium alloy	McMaster-Carr	Alloy 6061
acrylic blocks	McMaster-Carr
polycarbonate anti-humidity chamber	McMaster-Carr		Impact-Resistant Polycarbonate
screws	McMaster-Carr
electronic cable/wire
medical grade PVC tubing	US Plastic Corp.	Tygon S-50-HL	clear, biocompatible
10 mL syringe	Becton Dickinson	309604
21 G blunt ended needle	Small Parts	NE-213PL-25	1-1/2" length
Alligator clip adapters	RadioShack	270-354	fully insulated
8 mm biopsy punch	Sklar Surgical Instruments	96-1152	sterile, disposable
12 mm biopsy punch	Acuderm (via Fisher Scientific)	NC9998681
tissue culture flasks	Corning		cell culture treated