Construção e Caracterização de um biorreator Fold Novel Vocal

Resumo

A novel vocal fold bioreactor capable of delivering physiologically relevant, vibratory stimulation to cultured cells is constructed and characterized. This dynamic culture device, when combined with a fibrous poly(ε-caprolactone) scaffold, creates a vocal fold-mimetic environment that modulates the behaviors of mesenchymal stem cells.

Resumo

In vitro engineering of mechanically active tissues requires the presentation of physiologically relevant mechanical conditions to cultured cells. To emulate the dynamic environment of vocal folds, a novel vocal fold bioreactor capable of producing vibratory stimulations at fundamental phonation frequencies is constructed and characterized. The device is composed of a function generator, a power amplifier, a speaker selector and parallel vibration chambers. Individual vibration chambers are created by sandwiching a custom-made silicone membrane between a pair of acrylic blocks. The silicone membrane not only serves as the bottom of the chamber but also provides a mechanism for securing the cell-laden scaffold. Vibration signals, generated by a speaker mounted underneath the bottom acrylic block, are transmitted to the membrane aerodynamically by the oscillating air. Eight identical vibration modules, fixed on two stationary metal bars, are housed in an anti-humidity chamber for long-term operation in a cell culture incubator. The vibration characteristics of the vocal fold bioreactor are analyzed non-destructively using a Laser Doppler Vibrometer (LDV). The utility of the dynamic culture device is demonstrated by culturing cellular constructs in the presence of 200-Hz sinusoidal vibrations with a mid-membrane displacement of 40 µm. Mesenchymal stem cells cultured in the bioreactor respond to the vibratory signals by altering the synthesis and degradation of vocal fold-relevant, extracellular matrix components. The novel bioreactor system presented herein offers an excellent in vitro platform for studying vibration-induced mechanotransduction and for the engineering of functional vocal fold tissues.

Introdução

A prega vocal humana, composta por uma camada epitelial, a lâmina própria (LP) eo músculo vocal, é um tecido macio especializado que converte o fluxo de ar dos pulmões para ondas acústicas para a produção de som. ¹ As pregas vocais oscilam regularmente durante a fonação normal, exibindo as estirpes de até 30% em frequências fundamentais que variam 100-300 Hz. ² Adulto vocal dobra LP é uma estrutura composta por um gradiente superficial (SLP), de um intermediário (PLI) e um (DLP) camada profunda. Outros grupos de classificação do epitélio eo SLP como a camada mucosa, e combina o ILP e DLP no ligamento vocal. ³ A camada SLP contém principalmente uma matriz amorfa com fibras colágenas pouco dispersos, enquanto que o ligamento é enriquecido com colágeno maduro e fibras de elastina para fornecer a força suficiente. ⁴ A estrutura e mecânica de pregas vocais nascidos variar significativamente de suas contrapartes adultas. Embora mecanismos que regulam o desenvolvimento das pregas vocais e maturação ainda não são totalmente compreendidos, a evidência experimental apontou para os papéis que definem a tensão mecânica derivada de vocalização.

Várias condições médicas, incluindo abuso vocal, infecções, irritantes químicos e procedimentos cirúrgicos, pode danificar a prega vocal. Patologias vocais afeta cerca de 3-9% da população dos EUA. Os métodos atuais de tratamento para patologias vocais são limitados ⁵ e uma abordagem de engenharia de tecidos à base de células-tronco surgiu como uma estratégia promissora para restaurar a função da prega vocal. Células-tronco mesenquimais (MSCs) são uma alternativa adequada para as primárias de fibroblastos de pregas vocais para engenharia de tecidos das pregas vocais. ^6-9 especificação destino de células-tronco e desenvolvimento do tecido subseqüente são mediados pelo nicho específico em que residem, de que o estado mecânico é um fator vital. ¹⁰ forças mecânicas são reguladores essenciais do tecido morfogênese umnd homeostase, especialmente para tecidos que são rotineiramente submetidos a uma carga. ¹¹ Do ponto de vista da engenharia de tecidos, tem sido demonstrado que a exposição a estímulos mecânicos fisiologicamente relevantes promove a diferenciação das células-tronco e específico do tecido remodelação da matriz ^12-15.

Bioreactores de cultura de tecidos são concebidos para simular o ambiente fisiológico pretendido para a célula ou tecido de crescimento in vitro. Para a engenharia de tecidos das pregas vocais, é especialmente crítico para recriar o ambiente mecânico das pregas vocais phonating. Um biorreator ideal prega vocal deve entregar efetivamente sinais vibratórios para células de cultura, permitindo o controle fácil sobre frequência, amplitude e duração das vibrações. Titze e colegas de trabalho elaborou um biorreator prega vocal (T1 biorreator) ¹⁶ que combina alongamento estático com alta freqüência (20-200 Hz) oscilações de estimular a produção de proteínas da matriz celular. Using deste biorreactor, Webb e colaboradores ¹⁷ estudaram os efeitos de 10-dias, as vibrações de 100 Hz em fibroblastos dérmicos cultivadas num ácido hialurónico (HA), à base de hidrogel. As construções submetidas a vibração exibiu uma expressão elevada de HA-sintase-2 (HAS2), decorina, fibromodulim e metaloproteinase de matriz-1 (MMP1), relativa aos controlos estáticos. Os efeitos estimulantes foram encontrados para ser dependente do tempo. Mais recentemente, o nosso grupo ^{de 18} reuniu um biorreator prega vocal (J1 biorreator) usando um amplificador de potência, um gerador de funções, um alto-falante fechado e uma membrana de silicone em circunferência ancoradas que transfere o ar oscilante para as células unidas. Fibroblastos de prepúcio neonatal cultivadas no biorreactor J1 foram sujeitos a 1 h de vibração a 60, 110 ou 300 Hz, com uma tensão no plano de até 0,05%. Os resultados qPCR sugeriu que a expressão de alguns genes de ECM foi moderadamente alterada em resposta às frequências vibratórias variadase amplitudes.

Estes projetos de biorreatores, enquanto intrigante, tem várias limitações. Por exemplo, o sistema de T1 requer um grande número de ligações e barras de acoplamento mecânico, que limita as frequências máximas atingível. Além disso, as células podem ser submetidas a indesejável agitação e fluido perturbação mecânica que complicam a interpretação dos dados. O bioreactor de J1, por outro lado, apresenta relativamente baixa eficiência de conversão de energia e não é fácil de usar. Além disso, a vibração freqüentemente destaca as estruturas celulares em carga da membrana de silicone subjacente. O J2 biorreator prega vocal aqui relatado, projetado com base no mesmo princípio como a versão J1, é otimizado para a consistência e reprodutibilidade. As vibrações que imitam fonação são gerados aerodinamicamente em câmaras de vibração instalados individualmente em poli fibroso MSC-povoada (ε-caprolactona) (PCL) andaimes são effectively garantiu. Laser Doppler Vibrometria (LDV) permite ao usuário verificar o perfil de vibração do conjunto membrana / andaime. Na nossa demonstração, as MSCs são expostos a 200 Hz de vibrações sinusoidais com uma (DE) padrão 1-h-on-1-h-off para um total de 12 hr por dia durante 7 dias. As respostas celulares aos estímulos vibratórios impostas são investigados de forma sistemática. No geral, a prega vocal J2 fornece o maior número de características user-friendly, permitindo estudos de cultura celular dinâmica a ser realizado em uma alta taxa de transferência e moda reprodutível.

Protocolo

1. Assembléia biorreator (Video 1)

1. Fazer um molde de alumínio (matriz circular + pino espaçador) com as dimensões interiores e exteriores pré-determinados (Figura 1).
2. Usando o molde a partir do passo 1.1, o fabrico de uma membrana de silicone (diâmetro: 42 mm, espessura: 1,5 mm, Figura 1) com uma manga entranhado (diâmetro: 12 mm, espessura de ~ 0,25 mm, em forma de pino do espaçador da Figura 1) em o meio usando um kit de elastómero de silicone disponíveis comercialmente.
3. Faça um par de blocos de acrílico (Figura 2 (4, 5)), com uma abertura circular (diâmetro: 24 mm) no meio, gravar o topo (1,8 cm de espessura) e inferior (0,9 cm de espessura) blocos com sulcos e ranhuras correspondentes ^10.
4. Sanduíche a membrana de silicone entre os blocos de acrílico emparelhados. Fixe o conjunto com quatro parafusos de canto usando uma chave de fenda de torque micro definido como uma força constante (35 cN · m). Como resultado, uma prova de água, 24 mm de largura e 18 mm de profundidade da câmara de vibração é criada (Figura 2C).
5. Monte um ^"alcance estendido mini-woofer 3 (Figura 2D, 8 Ω/20 W) por baixo da câmara de vibração através de um outro conjunto de parafusos de canto no bloco de acrílico inferior. Neste ponto, um módulo de vibração individual é montado.
6. Replicar sete módulos de vibração adicionais. Apor quatro deles a uma das duas barras de alumínio estacionários (40 cm x 10 cm x 2,5 cm), colocando as bases dos altifalantes em furos circulares espaçados uniformemente (diâmetro: 7 cm, espessura: 2 cm) cortado em barras. Estabilizar cada altifalante inserindo um parafuso através do lado da barra de alumínio em cada furo circular.
7. Individualmente controlar os alto-falantes por um seletor de alto-falante. Ligue colunas individuais para o selector ligando fios para as entradas positivas e negativas para o corpo do alto-falante, em seguida, para as respectivas saídas do selector. O seletor de alto-falante permite que o sinal de tele gerador de funções, depois de passar por um amplificador de potência, para alcançar todos os oito alto-falantes de uma só vez (Figura 2E).
8. Coloque as duas matrizes de câmara, o seletor de alto-falante e componentes eletrônicos associados em um gabinete anti-umidade. Casa todo o conjunto em uma cultura de células incubadora comercial.
9. Alimentar os cabos principais (por meio de um tubo de PVC de qualidade médica) que liga o amplificador de potência e selector de coluna através do conjunto de filtro na parte traseira da incubadora.

2. Fabrication andaime e Caracterização

1. Dissolve-se peletes de PCL em clorofórmio a uma concentração de 15% em peso. Carregar a solução numa seringa de 10 ml tapado com uma extremidades cegas agulha 21 G.
2. Tranque a seringa em uma bomba de seringa programáveis ​​e definir a taxa de fluxo de 1 ml / h.
3. Coloque o coletor de coberta de folha de alumínio através da agulha na horizontal, com uma agulha de distância ponta-de-colecionador de ~ 18 cm.
4. Prenda o alli positivoclipe jacaré para o meio da agulha eo jacaré terreno para o coletor de alumínio, em seguida, definir a voltagem da fonte de alimentação de alta tensão de 15 kV. CUIDADO: alta tensão, manter distância da agulha.
5. Sequencialmente ligar a bomba de seringa e de alimentação; rapidamente limpo / remover a solução de polímero residual em torno da ponta da agulha com uma toalha de papel seco, antes jactos fibra estável e Taylor cone ¹⁹ são formadas.
6. Permitir que as fibras se acumulem no colector de Al com uma espessura de ~ 250-300 mM (~ 7 horas sob as condições de fiação corrente). Armazenar os andaimes resultante num exsicador de vácuo durante 1-2 dias para remover qualquer solvente residual.
7. Imagem os andaimes, sputter revestido com ouro, utilizando um microscópio eletrônico de varredura para mostrar a morfologia da fibra consistente. ¹⁰

3. Assembléia biorreator e Caracterização

1. Faça um disco cilíndrico (diâmetro: 8 mm) com quatro braços (comprimento: 2mm) para fora do tapete PCL tal como fiados (Figura 2A), em primeiro lugar usando um diâmetro de 12 milímetros biopsia de perfuração para cortar o diâmetro exterior do disco. Em seguida, utilizar um segundo, 8 milímetros biópsia para fazer quatro 2 mm de comprimento entalhes espaçados uniformemente em torno da lâmina circular para marcar onde os braços estão a ser cortados. Depois de marcar com o punção 8 mm, de utilizar uma lâmina de bisturi para cortar as extremidades dos braços para fora. Insira o andaime na ranhura da membrana de silicone via os braços estendidos (Video 1). Achate o andaime inserido pressionando suavemente a superfície, usando uma pinça de cabeça chata.
2. Anexar um pequeno pedaço de folha fina Al (8 milímetros x 2 mm, forma ortogonal, Figura 2B) para o cadafalso PCL para auxiliar a reflexão do laser.
3. Fixar a membrana de silicone / PCL andaime montado (conforme descrito no passo 1.4) na câmara de vibração. Adicionar 1,5 ml de água na câmara de modo a hidratar o andaime PCL antes vibração.
4. Usando o gerador de funções, apresentar sinal de vibraçãoals (por exemplo, 200 Hz ondas sinusoidais com uma tensão de pico-a-pico, Vpp, de 0,1 V) para a câmara de acrílico ensanduichada. Use um voltímetro para medir com precisão a tensão em cada entrada de alto-falante. Nota: a leitura Vpp do gerador de função será diferente da eventual tensão fornecida para o alto-falante.
5. Monte o LDV de ponto único e assegurar o sensor laser cabeça de fibra óptica a um tripé cabeça pan-tilt. Ângulo da cabeça do sensor de modo que ele está apontando perpendicular à mesa. Ligue a cabeça do sensor LDV para o módulo de aquisição de dados através de um cabo coaxial, em seguida, o módulo para o laptop via USB.
6. Focar o feixe de laser perpendicular em vários pontos predeterminados na membrana de silicone (Figura 2B e Figura 3).
7. Utilizando o software de aquisição de dados, registar o deslocamento meados de membrana. Clique em "Configurações de Aquisição" no menu "Opções"; em seguida, alterar o modo de medição para "FFT221;. Em seguida, clique no botão "medição contínua" na barra de ferramentas principal, em seguida, clique no pico que se forma na freqüência escolhida (Figura 6D) para gravar o deslocamento.
8. Traça-se a deslocação no meio da membrana normal (w ₀₎ como uma função da posição relativa ao longo do substrato. Construir um mapa de cores em 3D do perfil vibratório superfície usando Origin software de análise de dados de 8,5.

4. Cultura de Células Vibratória

1. MSC derivadas da medula óssea humana de sub-cultura em frascos de cultura de tecido T150 a uma densidade de sementeira inicial de 4.000-5.000 células / ^cm2 em meio de manutenção MSC.
2. Após 7-8 dias de cultura de células (de ~ 85% de confluência), trypsinize as células com um reagente de dissociação de células, tais como Accutase, contagem utilizando um hemocitómetro, centrifugação (440 xg durante 5 min), e re-suspender o sedimento de células em MSC meio de manutenção fresco a uma concentração de 4,5 x 10 ⁶ células / ml.
3. Mergulhe o Scaffo PCLld em 70% de etanol S / N. Depois o solvente é evaporado, expor ambos os lados do andaime a luz germicida UV (254 nm) durante 5-8 min.
4. Embeber o andaime PCL em uma solução de fibronectina de 20 ug / ml a 37 ° C durante 1 hora. Insira o andaime revestido de fibronectina na membrana de silicone. Montar o bioreactor como detalhado no passo 1.
5. Distribuir 40 ul da suspensão celular de forma uniforme sobre o andaime PCL garantido. Permitir que as células se fixem durante 1-1,5 horas antes de se adicionar mais 1,5 ml de meio fresco para a câmara de vibração.
6. Cultura cadafalso PCL MSC-carregado estaticamente por 3 dias e atualizar a mídia após a conclusão da cultura estática.
7. Impor regimes de vibração selecionados para as construções celulares. Observação: Como um exemplo, as células são sujeitas a um 1-h-on-1-h-off (DO) a 200 Hz vibração com aw de ₀ a 40 mM durante 12 horas por dia, durante até 7 dias. As construções submetidas a estímulos vibratórios são designadas como amostras Vib e os blovermelho estaticamente em câmaras de vibração idênticos servir como controles estáticos (Stat).

5. Avaliações biológicas

1. Recolhe 200 ul meios de cultura de células a partir de cada câmara em dias alternados (dias 1, 3, 5, e 7) e juntar as aliquotas da mesma amostra em conjunto (800 mL cada).
2. Quantificar a produção celular de metaloproteinase-1 (MMP1) e HA utilizando um kit ELISA MMP1 Desenvolvimento e um kit de ELISA competitivo ácido hialurônico, respectivamente, seguindo procedimento do fabricante. Enquanto isso, ensaiar a produção de precursor de elastina solúvel seguindo o procedimento de ELISA previamente relatado. ^Oito
3. Após a conclusão do último ciclo de vibração no dia 7, remover rapidamente as construções celulares a partir das câmaras de vibração usando pinças cortantes e brevemente lavá-los com fosfato fria salina tamponada (PBS, 4 ° C).
4. Para a coloração vivo / morto, incuba-se as construções com iodeto de propídio (1:2000 em PBS) eSyto-13 (1:1000 em PBS), simultaneamente, durante 5 min à TA. Imagem as construções marcadas com um microscópio confocal multiphoton.
5. Separadamente, snap-congelar as construções celulares PBS-enxaguados em gelo seco e extrair o ARN celular total, seguindo um protocolo previamente relatado para a análise genética. ⁹
6. Verificar a quantidade e qualidade do ARN extraído utilizando um espectrofotómetro de UV-Vis. As amostras de ARN com A260/A280 e razões A260/A230 de 1,8-2,2 são utilizados para subsequente análise qPCR.
7. Reverso transcrever RNA (500 ng / amostra) em cDNA usando um kit de transcrição reversa disponível comercialmente.
8. Realizar a reacção de PCR em um sistema de detecção de sequência em tempo real usando um PCR master mix disponível comercialmente seguindo o procedimento previamente detalhado. ^Oito
9. Analisar os resultados qPCR utilizando software de análise de dados de qPCR comercial. Para garantir a confiabilidade da análise de dados, vários genes de referência (YWHAZ, TBP, PPIA) são empregados como intcontrolos Ernal, e a variância da eficiência de iniciadores específicos é levada em conta. ^oito

Resultados

Os andaimes PCL fabricados por electrospinning conter poros intersticiais porte micro e fibras entrelaçadas de forma aleatória, com um diâmetro médio de 4,7 mM (Figura 4A). Numa ampliação maior, ranhuras em nanoescala e poros são visíveis nas fibras individuais (Figura 4B). Revestimento dos andaimes com fibronectina melhora hidrofilicidade e facilita a adesão celular inicial / espalhando no cadafalso PCL (observação não publicada).

Formas de onda...

Discussão

Engenharia de sucesso dos tecidos das pregas vocais funcionais in vitro requer a recriação de um microambiente-como prega vocal para mediar os comportamentos de células multipotentes. É geralmente aceite que o tecido ou órgão estruturas refletem as funções que são necessários para realizar. ²² para os tecidos das pregas vocais, as vibrações de alta frequência que ocorrem durante a fonação são propostas a ser importante para a maturação do tecido. Em nosso estudo, andaimes PCL são u...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
silicone elastomer kit	Dow Corning	Sylgard 184	cure the membrane at 100 C for 2 hr
PCL	Sigma Aldrich	440744-500G	Mn ~ 80 kDa, dissolve overnight
chloroform	Sigma Aldrich	C7559-5VL
human bone marrow-derived MSCs	Lonza	PT-2501	received with passage 2
MSC maintenance media	Lonza	PT-3001	10% FBS in basal media supplemented with L-glutamine, gentamicin and amphotericin
Accutase cell dissociation reagent	Life Technologies	A11105-01
ethanol	Sigma Aldrich	E7023-500ML
fibronectin	Sigma Aldrich	F2006-1MG
MMP1 DuoSet ELISA kit	R&D systems	DY901
HA ELISA kit	Echelon Biosciences	K-1200
PBS	Life Technologies	14190-136
propidium iodide	Life Technologies	P1304MP
Syto-13	Life Technologies	S7575
QuantiTect reverse transcription kit	Qiagen	205311
SYBR Green PCR master mix	Life Technologies	4309155
replacement speaker	DAYTON audio (via Parts Express)	DS90-8	paper cone, full range (80-13000 Hz), 85dB
Ergo Micro torque screwdriver	Mountz	# 020377	torque range: 20-120 cN.m
stereo speaker selector	RadioShack	40-244	maximum power handling 50 W
function generator	Agilent	33220A	frequency range 1 µHz- 20 MHz
power amplifier	PYLE audio	PylePro PT2400	frequency response: 10 Hz-50 kHz, two speaker channels
cell culture incubator	Thermo Fisher	Steri-Cult 3307
syringe pump	New Era Pump Systems	NE-300
High voltage power supply	Spellman	CZE 1000R	output voltage: 0-30 kV
scanning electron microscope	JEOL-USA	JSM-7400F
desk gold sputter coater	Denton Vacuum	DSK00V-0013
Doppler laser vibrometer	Polytec	PDV-100	non-contact velocity measurement (0-22 kHz)
PCR sequence detection system	Applied Biosystems	ABI7300
multiphoton confocal microscope	Zeiss	Zeiss 510Meta NLO
UV-VIS Spectrophotometer	NanoDrop Products via Thermo Scientific	ND-2000
VibSoft Data Acquisition Software	Polytec		acquisition bandwidth up to 40 MHz
Origin 8.5 data analysis software	OriginLab
qbasePlus qPCR data analysis software	Biogazelle	V2.3
aluminium alloy	McMaster-Carr	Alloy 6061
acrylic blocks	McMaster-Carr
polycarbonate anti-humidity chamber	McMaster-Carr		Impact-Resistant Polycarbonate
screws	McMaster-Carr
electronic cable/wire
medical grade PVC tubing	US Plastic Corp.	Tygon S-50-HL	clear, biocompatible
10 mL syringe	Becton Dickinson	309604
21 G blunt ended needle	Small Parts	NE-213PL-25	1-1/2" length
Alligator clip adapters	RadioShack	270-354	fully insulated
8 mm biopsy punch	Sklar Surgical Instruments	96-1152	sterile, disposable
12 mm biopsy punch	Acuderm (via Fisher Scientific)	NC9998681
tissue culture flasks	Corning		cell culture treated