Konstruktion und Charakterisierung eines neuartigen Bioreaktor Stimmlippen

Zusammenfassung

A novel vocal fold bioreactor capable of delivering physiologically relevant, vibratory stimulation to cultured cells is constructed and characterized. This dynamic culture device, when combined with a fibrous poly(ε-caprolactone) scaffold, creates a vocal fold-mimetic environment that modulates the behaviors of mesenchymal stem cells.

Zusammenfassung

In vitro engineering of mechanically active tissues requires the presentation of physiologically relevant mechanical conditions to cultured cells. To emulate the dynamic environment of vocal folds, a novel vocal fold bioreactor capable of producing vibratory stimulations at fundamental phonation frequencies is constructed and characterized. The device is composed of a function generator, a power amplifier, a speaker selector and parallel vibration chambers. Individual vibration chambers are created by sandwiching a custom-made silicone membrane between a pair of acrylic blocks. The silicone membrane not only serves as the bottom of the chamber but also provides a mechanism for securing the cell-laden scaffold. Vibration signals, generated by a speaker mounted underneath the bottom acrylic block, are transmitted to the membrane aerodynamically by the oscillating air. Eight identical vibration modules, fixed on two stationary metal bars, are housed in an anti-humidity chamber for long-term operation in a cell culture incubator. The vibration characteristics of the vocal fold bioreactor are analyzed non-destructively using a Laser Doppler Vibrometer (LDV). The utility of the dynamic culture device is demonstrated by culturing cellular constructs in the presence of 200-Hz sinusoidal vibrations with a mid-membrane displacement of 40 µm. Mesenchymal stem cells cultured in the bioreactor respond to the vibratory signals by altering the synthesis and degradation of vocal fold-relevant, extracellular matrix components. The novel bioreactor system presented herein offers an excellent in vitro platform for studying vibration-induced mechanotransduction and for the engineering of functional vocal fold tissues.

Einleitung

Der menschliche Stimmlippen, einer epithelialen Schicht, die Lamina propria (LP) und der M. vocalis, ist eine spezialisierte Weichgewebe die den Luftstrom aus der Lunge in akustische Wellen für die Klangerzeugung umwandelt. ¹ Stimmlippen schwingen regelmäßig während der normalen Stimmbildung, bei Grundfrequenzen im Bereich aufweisen Stämme von bis zu 30% 100-300 Hz. ² Erwachsene Stimmlippen LP ist eine Gradienten-Struktur einer oberflächlichen (SLP) zusammengesetzt ist, ein Zwischenprodukt (ILP) und eine Tiefe (DLP)-Schicht. Weitere Klassifikationsgruppen das Epithel und die SLP als Schleimhaut-Schicht und verbindet die ILP-und DLP in die Stimmbandes. ³ Die SLP Schicht enthält in erster Linie eine amorphe Matrix mit spärlich verteilt kollagenen Fasern, während das Band mit reifen Kollagen und Elastin-Fasern angereichert um eine ausreichende Festigkeit verfügen. ^4. Die Struktur und Mechanik des Neugeborenen Stimmlippen deutlich von ihrer reifen Kollegen. Obwohl Mechanismuss Regelstimmlippen Entwicklung und Reifung sind noch nicht vollständig verstanden, experimentelle Beweise für die Definition von Rollen der Vokalisation abgeleitete mechanische Belastung hingewiesen.

Mehrere medizinische Bedingungen, einschließlich Sprachmissbrauch, Infektionen, chemische Reizstoffe und chirurgische Verfahren, können die Stimmlippe beschädigen. Stimmlippe Störungen betreffen schätzungsweise 3-9% der US-Bevölkerung. Aktuelle Behandlungsmethoden für Erkrankungen der Stimmlippen sind begrenzt, ⁵ und eine Stammzellen-basierten Tissue-Engineering-Ansatz hat sich als vielversprechende Strategie zur Wiederherstellung der Stimmlippenfunktion entstanden. Mesenchymalen Stammzellen (MSC) sind eine geeignete Alternative zu den primären Stimmlippen Stimmlippen Fibroblasten für Tissue Engineering. ^6-9 Stammzell Schicksal Spezifikation und anschließender Gewebeentwicklung werden durch die spezifische Nische sie wohnen, von denen der mechanische Zustand vermittelt ein entscheidender Faktor. ^10. Mechanische Kräfte sind wesentliche Regulatoren der Morphogenese einnd Homöostase, vor allem für Gewebe, die routinemäßig von der Last. ausgesetzt sind ¹¹ Aus einer Perspektive Tissue Engineering hat es sich gezeigt, dass die Exposition gegenüber physiologisch relevanten mechanischen Reize fördert die Stammzelldifferenzierung und gewebespezifischen Matrixumbau. ^12-15

Gewebekulturbioreaktoren sind entworfen, um die gewünschte physiologische Umgebung für Zell-oder Gewebewachstum in vitro zu simulieren. Für Stimmlippen Tissue Engineering, ist es besonders wichtig, die mechanische Umgebung der phonating Stimmlippen neu zu erstellen. Eine ideale Stimmlippen Bioreaktor sollte Vibrations effektiv zu liefern Hinweise zur Kultivierung von Zellen, so dass eine leichte Kontrolle über die Frequenz, Amplitude und Dauer der Erschütterungen. Titze und Mitarbeiter entwickelten eine Stimmlippen Bioreaktor (T1 Bioreaktor) ^16, die statische Strecke mit hoher Frequenz (20-200 Hz) Schwingungen, die zelluläre Produktion von Matrixproteinen stimulieren kombiniert. Das Arbeg dieser Bioreaktor, Webb und Kollegen ¹⁷ suchten die Auswirkungen der 10-Tage, 100-Hz-Schwingungen auf den dermalen Fibroblasten in einer Hyaluronsäure (HA)-basierte Hydrogel kultiviert. Konstrukte Vibrationen ausgesetzt zeigten eine erhöhte Expression von HA-Synthase-2 (HAS2), Decorin, Fibromodulin und Matrix-Metalloproteinase-1 (MMP1), bezogen auf die statische Kontrollen. Die stimulierende Wirkung wurde festgestellt, zeitabhängig sein. Vor kurzem, unsere Gruppe ¹⁸ stellte ein Stimmlippen Bioreaktor (J1 Bioreaktor) mit einem Leistungsverstärker, einen Funktionsgenerator, einen geschlossenen Lautsprecher und eine Umfangs verankert Silikonmembran, die die schwingende Luft auf die beigefügten Zellen überträgt. Neonatale Vorhautfibroblasten in der J1-Bioreaktor kultiviert wurden 1 h Vibration bei 60, 110 oder 300 Hz unterzogen wird, mit einer Dehnung in der Ebene von bis zu 0,05%. Die qPCR Ergebnisse zeigten, dass die Expression einiger Gene ECM mäßig in Abhängigkeit von der unterschiedlichen Schwingungsfrequenzen verändertund Amplituden.

Diese Bioreaktor entwickelt, während faszinierend, haben mehrere Einschränkungen. Zum Beispiel erfordert die T1-System eine große Anzahl von Verbindungsstangen und für mechanische Kopplung, die Begrenzung der Maximalfrequenzen erreichbar. Darüber hinaus können Zellen, um unerwünschte mechanische Bewegung und Flüssigkeits Störung, die die Datenauswertung erschweren unterworfen werden. Die J1-Bioreaktor, auf der anderen Seite, zeigt relativ geringe Wirkungsgrad der Energieumwandlung und ist nicht benutzerfreundlich. Darüber hinaus löst Vibrationen häufig die Zellbeladenen Konstrukte aus der zugrunde liegenden Silikonmembran. Der J2 Stimmlippen Bioreaktor hier berichtet, basierend auf dem gleichen Prinzip wie die J1-Version entworfen, wird die Konsistenz und Reproduzierbarkeit optimiert. Die Stimmbildung ähnlicher Vibrationen sind aerodynamisch in individuell angepassten Vibrationskammern, in denen MSC besiedelten Faser Poly (ε-Caprolacton) (PCL) Gerüste sind effektiver erzeugtEly gesichert. Laservibrometrie (LDV) ermöglicht dem Benutzer, den Vibrationsprofils der Membran / Gerüstanordnung zu überprüfen. In unserer Demonstration werden MSCs 200-Hz-Sinusschwingungen mit einer 1-Stunden-on-1-h-aus (OF) Muster für insgesamt 12 Stunden täglich für 7 Tage ausgesetzt. Zelluläre Antworten auf die verhängte Vibrations Hinweise werden systematisch untersucht. Insgesamt bietet die J2 Stimmlippen die benutzerfreundlichen Funktionen, so dass dynamische Zellkulturstudien, in einem hohen Durchsatz und reproduzierbar durchgeführt werden.

Protokoll

1. Bioreaktor Versammlung (Video 1)

1. Machen Sie eine Aluminiumform (kreisförmige Düse + Abstandsstift) mit vorgegebenen Innen-und Außenmaße (Abbildung 1).
2. Mit der Form aus Schritt 1.1, fabrizieren eine Silikonmembran (Durchmesser: 42 mm, Dicke: 1,5 mm, Abbildung 1) mit einem verschanzten Hülse (Durchmesser: 12 mm, Dicke ~ 0,25 mm, von der Abstandsstift in Abbildung 1 förmig) in die mittlere mit einem handelsüblichen Silikon-Elastomer-Kit.
3. Machen Sie ein Paar Acrylblöcke (Abbildung 2 (4, 5)) mit einer kreisförmigen Öffnung (Durchmesser: 24 mm) in der Mitte, gravieren die Spitze (1,8 cm dick) und unten (0,9 cm dick) Blöcke mit passenden Rippen und Rillen . ^10.
4. Sandwich die Silikonmembran zwischen den gepaarten Acrylblöcke. Sichern Sie die Montage mit vier Schrauben Ecke mit einer Micro-Drehmomentschrauber einer konstanten Kraft (35 cN · m) eingestellt. Als Ergebnis wird eine wasserdichte, 24 mm breit und 18 mm tief Vibrationskammer erzeugt wird (Fig. 2C).
5. Montieren Sie einen 3 ^"erweiterten Bereich Mini-Woofer (2D, 8 Ω/20 W) unter der Vibrationskammer durch einen anderen Satz von Ecke Schrauben auf der Unterseite Acrylblock. An diesem Punkt wird eine einzelne Vibrationsmodul montiert.
6. Replizieren sieben zusätzliche Schwingungsmodule. Anbringen vier davon mit einem von zwei feststehenden Aluminiumstangen (40 cm x 10 cm x 2,5 cm), indem die Lautsprecher Basen in gleichmäßig beabstandeten kreisförmigen Öffnungen (Durchmesser: 7 cm, Dicke: 2 cm) in die Stäbe zu schneiden. Stabilisieren Sie jeden Lautsprecher durch Einsetzen einer Schraube durch die Seite der Aluminiumstange in jeder kreisförmigen Loch.
7. Individuell steuern die Lautsprecher durch einen Lautsprecher Selector. Verbinden einzelnen Lautsprecher an den Selektor durch Anbringen Drähte an die positiven und negativen Eingänge des Lautsprechers Körper dann an die entsprechenden Ausgänge des Wählers. Das Lautsprecherwähler ermöglicht das Signal von ter Funktionsgenerator, nachdem es durch einen Leistungsverstärker, um alle acht Lautsprecher auf einmal (2E) zu erreichen.
8. Platzieren Sie die beiden Kammeranordnungen, die Lautsprecherauswahl und die zugehörige Elektronik in einem Gehäuse zum Schutz gegen Feuchtigkeit. Haus die gesamte Baugruppe in einem kommerziellen Zellkulturbrutschrank.
9. Führen Sie die Hauptkabel (durch eine medizinische Qualität PVC-Schlauch), die den Leistungsverstärker und Lautsprecherwähler durch die Filteranordnung auf der Rückseite des Inkubators.

2. Gerüst Herstellung und Charakterisierung

1. Auflösen PCL-Pellets in Chloroform bei einer Konzentration von 15 Gew.%. Laden Sie die Lösung in eine 10 ml Spritze mit einer 21 G Nadel stumpfen Enden gekappt.
2. Sperren Sie die Spritze auf einem programmierbaren Spritzenpumpe und stellen Sie die Durchflussmenge bei 1 ml / Std.
3. Platzieren der Aluminiumfolie bedeckten Kollektor gegenüber der Nadel horizontal, mit einer Nadelspitze-zu-Kollektor-Strecke von ca. 18 cm.
4. Klemmen Sie die positive alliAlligator-Clip in der Mitte der Nadel und dem Boden Krokodilklemme an die Aluminiumkollektor, dann die Spannung auf der Hochspannungsversorgung mit 15 kV. ACHTUNG: Hochspannung, halten Sie Abstand von der Nadel.
5. Nacheinander auf dem Spritzenpumpe und Stromversorgung drehen; schnell reinigen / entfernen Sie die Restpolymerlösung rund um die Spitze der Nadel mit einem trockenen Papiertuch vor stabile Faserdüsen und Taylor-Konus ¹⁹ gebildet werden.
6. Die Fasern auf der Sammel Al in einer Dicke von ca. 250-300 &mgr; m akkumulieren (~ 7 Stunden unter den derzeitigen Spinnbedingungen). Speichern Sie die resultierende Gerüste im Vakuumtrockenschrank für 1-2 Tage, um restliche Lösungsmittel zu entfernen.
7. Bild die Gerüste, mit Gold beschichtet Sputtern mit einem Raster-Elektronen-Mikroskop, um konsistente Fasermorphologie zeigen. ^10.

3. Bioreaktor Assemblierung und Charakterisierung

1. Lochen Sie ein zylindrische Scheibe (Durchmesser: 8 mm) mit vier Armen (Länge: 2mm) aus der wie gesponnenen PCL Matte (2A), indem zuerst mit einem Durchmesser von 12 mm Stanzbiopsie, um den äußeren Durchmesser der Platte geschnitten. Dann mit einem zweiten, 8 mm Stanzbiopsie zu vier 2 mm langen Kerben gleichmäßig um den Kreismesser Abstand zu punkten, wo die Arme zu schneiden sind zu machen. Nach der Wertung mit der 8 mm-Stanz, verwenden Sie ein Skalpell, um die Kanten der Arme nach außen abgeschnitten. Einfügen des Gerüsts in die Nut der Silikonmembran über den verlängerten Armen (Video 1). Glätten Sie das Gerüst eingefügt durch sanftes Drücken Sie die Oberfläche mit Flachkopf-Pinzette.
2. Bringen Sie ein kleines Stück von dünnen Al-Folie (8 mm x 2 mm, senkrecht Form, 2B) mit dem PCL-Gerüst Laserreflexion unterstützen.
3. Befestigen Sie den zusammengebauten Silikonmembran / PCL Gerüst (wie in Schritt 1.4 beschrieben) in der Vibrationskammer. 1,5 ml Wasser in der Kammer, um die PCL-Gerüst vor Vibrationen Hydrat.
4. Mit dem Funktionsgenerator, einzuführen Vibrations ZeichenALS (z. B. 200 Hz-Sinuswellen mit einer Spitze-zu-Spitze-Spannung Vpp von 0,1 V) an die sandwichartig Acrylkammer. Mit einem Voltmeter die Spannung exakt messen an jedem Lautsprechereingang. Hinweis: die Vpp Auslesen aus dem Funktionsgenerator von der eventuellen Spannungs an den Lautsprecher geliefert abweichen.
5. Montieren Sie den Ein-Punkt-LDV und sichern die Laserlichtsensorkopf auf eine Schwenk-Neige-Kopf Stativ. Angle den Sensorkopf, so dass sie senkrecht auf der Tischplatte zeigt. Schließen Sie das LDV Sensorkopf mit dem Datenerfassungsmodul über Koaxialkabel dann das Modul an den Laptop über USB.
6. Fokussierung des Laserstrahls senkrecht an verschiedenen vorbestimmten Stellen auf der Silikon-Membran (Fig. 2B und Fig. 3).
7. Mit der Software zur Datenerfassung, notieren Sie die Mitte Membranverschiebung. Klicken Sie auf "Übernahme-Einstellungen" aus dem Menü "Optionen"; ändern Sie dann den Messmodus auf "FFT221;. Als nächstes klicken Sie auf die "Dauermessung" in der Hauptsymbolleiste klicken Sie dann auf die Spitze, die bei der gewählten Frequenz (6D) bildet, um eine Verschiebung zu erfassen.
8. Zur Erstellung der normalen Halbmembranverschiebung (w ₀₎ als Funktion der relativen Position gegenüber dem Substrat. Erstellen Sie ein 3D-Farbtabelle der Oberfläche Vibrations Profil mit Origin 8.5 Datenanalyse-Software.

4. Vibrationszellkultur

1. Sub-Kultur menschlichen Knochenmark abgeleiteten MSCs in T150 Zellkulturflaschen mit einer Anfangsaussaatdichte von 4000-5000 Zellen / cm ² in MSC Wartung Medien.
2. Nach 7-8 Tagen Zellkultur (um ~ 85% Konfluenz), trypsinize die Zellen mit einer Zellspalt Reagens wie Accutase zählen mit einer Zählkammer, Zentrifuge (440 × g für 5 min) und Resuspension der Zellpellets in Frisch MSC Erhaltungsmedium bei einer Konzentration von 4,5 x 10 ⁶ Zellen / ml.
3. Tauchen Sie den PCL scaffold in 70% Ethanol O / N. Nachdem das Lösungsmittel verdampft ist, setzen beide Seiten des Gerüsts mit UV-Licht (254 nm) für 5-8 min keimtötende.
4. Einweichen des PCL-Gerüst in einem 20 ug / ml Fibronektin-Lösung bei 37 ° C für 1 Stunde. Legen Sie die Fibronektin-beschichtete Gerüst in die Silikonmembran. Montieren Sie den Bioreaktor wie in Schritt 1 beschrieben.
5. Verteilen 40 ul der Zellsuspension gleichmäßig auf die gesicherte PCL Gerüst. Lassen Sie die Zellen für 1 bis 1,5 Stunden, bevor Sie weitere 1,5 ml frisches Medium mit der Vibrationskammer zu befestigen.
6. Kultur der MSC-beladenen PCL Gerüst statisch für 3 Tage und aktualisieren Sie die Medien nach Abschluss der statischen Kultur.
7. Impose ausgewählten Vibrations Regime auf die Zellkonstrukte. Anmerkung: Als Beispiel werden die Zellen in einen 1-Stunden-on-1-h-aus (OF) Schwingung bei 200 Hz mit einem w von ₀ ~ 40 &mgr; m für 12 Stunden pro Tag für bis zu 7 Tage unterzogen. Konstrukte, um Schwingungsanregungen unterzogen werden, wie Vib Proben und diesen kul bezeichnetrot statisch in identischen Schwingungs Kammern dienen als statische Kontrollen (Stat).

5. Biologische Bewertung

1. Sammeln Sie 200 ul Zellkulturmedien aus jeder Kammer jeden zweiten Tag (Tag 1, 3, 5 und 7) und bündeln die Portionen aus der gleichen Probe zusammen (jeweils 800 ul).
2. Quantifizierung der zellulären Produktion von Matrix-Metalloproteinase-1 (MMP1) und HA mit einem MMP1 ELISA-Entwicklung-Kit und eine Hyaluronsäure kompetitiven ELISA-Kit, jeweils folgende Verfahren der Hersteller. Unterdessen untersuchen die Produktion von löslichem Elastin-Vorläufer nach dem zuvor berichtet ELISA-Verfahren. ⁸
3. Nach Abschluss der letzten Schwingungszyklus am Tag 7, schnell zu entfernen, die zellulären Konstrukte aus den Schwingungs Kammern mit scharfen Pinzette und spülen Sie sie kurz mit kaltem Phosphat-gepufferte Salzlösung (PBS, 4 ° C).
4. Für die Live / Dead-Färbung, brüten die Konstrukte mit Propidiumiodid (1:2000 in PBS) undSyto-13 (1:1000 in PBS) gleichzeitig für 5 min bei RT. Bild die gefärbten Konstrukte mit einem Multiphotonen-konfokalen Mikroskop.
5. Getrennt Snap-Einfrieren der PBS-gespült Zellkonstrukte auf Trockeneis und extrahieren Sie die gesamte zelluläre RNA nach einer zuvor berichtet Protokoll für die Gen-Analyse. ⁹
6. Überprüfen Sie, ob die Quantität und Qualität der extrahierten RNA mit Hilfe eines UV-Vis-Spektrophotometer. RNA-Proben mit A260/A280 und A260/A230 Verhältnisse von 1,8 bis 2,2 sind für die anschließende qPCR-Analyse verwendet.
7. Reverse Transkription der RNA (500 ng / Probe) in cDNA mit einem kommerziell erhältlichen Kit der reversen Transkription.
8. Führen Sie die PCR-Reaktion auf einer Echtzeit-Sequenz-Detektionssystem mit einem handelsüblichen PCR Master Mix nach der vorher beschrieben Verfahren. ⁸
9. Analysieren Sie die qPCR Ergebnisse mit kommerziellen qPCR Datenanalyse-Software. Um die Zuverlässigkeit der Datenanalyse zu gewährleisten, werden mehrere Referenzgene (YWHAZ, TBP, PPIA) als int verwendetern Kontrollen und die Varianz der spezifischen Primer Effizienz berücksichtigt wird. ⁸

Ergebnisse

Die PCL-Scaffolds durch Elektrospinning hergestellt enthalten mikrometergroßen Poren und Zwischen zufällig verstrickt Fasern mit einem durchschnittlichen Durchmesser von 4,7 um (Abbildung 4A). Bei einer höheren Vergrößerung, nanoskalige Rillen und Poren auf einzelnen Fasern (4B) sichtbar. Die Beschichtung der Gerüste mit Fibronektin verbessert Hydrophilie und erleichtert die anfängliche Zelladhäsion / Verteilung auf der PCL-Gerüst (unveröffentlichte Beobachtung).

Diskussion

Erfolgreiche Engineering von funktionellen Stimmlippengewebe in vitro erfordert die Erholung von einem Stimmlippenartigen Mikroumgebung, um die Verhaltensweisen der multipotenten Zellen vermitteln. Es ist allgemein anerkannt, dass Gewebe-oder Organstrukturen spiegeln die Funktionen, die sie benötigt, um durchzuführen. Für ²² Stimmlippengewebe werden die hochfrequenten Schwingungen, die bei der Lautbildung auftreten vorgeschlagen wichtig für die Gewebereifung zu sein. In unserer Studie sind PCL Ge...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
silicone elastomer kit	Dow Corning	Sylgard 184	cure the membrane at 100 C for 2 hr
PCL	Sigma Aldrich	440744-500G	Mn ~ 80 kDa, dissolve overnight
chloroform	Sigma Aldrich	C7559-5VL
human bone marrow-derived MSCs	Lonza	PT-2501	received with passage 2
MSC maintenance media	Lonza	PT-3001	10% FBS in basal media supplemented with L-glutamine, gentamicin and amphotericin
Accutase cell dissociation reagent	Life Technologies	A11105-01
ethanol	Sigma Aldrich	E7023-500ML
fibronectin	Sigma Aldrich	F2006-1MG
MMP1 DuoSet ELISA kit	R&D systems	DY901
HA ELISA kit	Echelon Biosciences	K-1200
PBS	Life Technologies	14190-136
propidium iodide	Life Technologies	P1304MP
Syto-13	Life Technologies	S7575
QuantiTect reverse transcription kit	Qiagen	205311
SYBR Green PCR master mix	Life Technologies	4309155
replacement speaker	DAYTON audio (via Parts Express)	DS90-8	paper cone, full range (80-13000 Hz), 85dB
Ergo Micro torque screwdriver	Mountz	# 020377	torque range: 20-120 cN.m
stereo speaker selector	RadioShack	40-244	maximum power handling 50 W
function generator	Agilent	33220A	frequency range 1 µHz- 20 MHz
power amplifier	PYLE audio	PylePro PT2400	frequency response: 10 Hz-50 kHz, two speaker channels
cell culture incubator	Thermo Fisher	Steri-Cult 3307
syringe pump	New Era Pump Systems	NE-300
High voltage power supply	Spellman	CZE 1000R	output voltage: 0-30 kV
scanning electron microscope	JEOL-USA	JSM-7400F
desk gold sputter coater	Denton Vacuum	DSK00V-0013
Doppler laser vibrometer	Polytec	PDV-100	non-contact velocity measurement (0-22 kHz)
PCR sequence detection system	Applied Biosystems	ABI7300
multiphoton confocal microscope	Zeiss	Zeiss 510Meta NLO
UV-VIS Spectrophotometer	NanoDrop Products via Thermo Scientific	ND-2000
VibSoft Data Acquisition Software	Polytec		acquisition bandwidth up to 40 MHz
Origin 8.5 data analysis software	OriginLab
qbasePlus qPCR data analysis software	Biogazelle	V2.3
aluminium alloy	McMaster-Carr	Alloy 6061
acrylic blocks	McMaster-Carr
polycarbonate anti-humidity chamber	McMaster-Carr		Impact-Resistant Polycarbonate
screws	McMaster-Carr
electronic cable/wire
medical grade PVC tubing	US Plastic Corp.	Tygon S-50-HL	clear, biocompatible
10 mL syringe	Becton Dickinson	309604
21 G blunt ended needle	Small Parts	NE-213PL-25	1-1/2" length
Alligator clip adapters	RadioShack	270-354	fully insulated
8 mm biopsy punch	Sklar Surgical Instruments	96-1152	sterile, disposable
12 mm biopsy punch	Acuderm (via Fisher Scientific)	NC9998681
tissue culture flasks	Corning		cell culture treated