新規声帯バイオリアクターの構築とキャラクタリゼーション

要約

A novel vocal fold bioreactor capable of delivering physiologically relevant, vibratory stimulation to cultured cells is constructed and characterized. This dynamic culture device, when combined with a fibrous poly(ε-caprolactone) scaffold, creates a vocal fold-mimetic environment that modulates the behaviors of mesenchymal stem cells.

要約

In vitro engineering of mechanically active tissues requires the presentation of physiologically relevant mechanical conditions to cultured cells. To emulate the dynamic environment of vocal folds, a novel vocal fold bioreactor capable of producing vibratory stimulations at fundamental phonation frequencies is constructed and characterized. The device is composed of a function generator, a power amplifier, a speaker selector and parallel vibration chambers. Individual vibration chambers are created by sandwiching a custom-made silicone membrane between a pair of acrylic blocks. The silicone membrane not only serves as the bottom of the chamber but also provides a mechanism for securing the cell-laden scaffold. Vibration signals, generated by a speaker mounted underneath the bottom acrylic block, are transmitted to the membrane aerodynamically by the oscillating air. Eight identical vibration modules, fixed on two stationary metal bars, are housed in an anti-humidity chamber for long-term operation in a cell culture incubator. The vibration characteristics of the vocal fold bioreactor are analyzed non-destructively using a Laser Doppler Vibrometer (LDV). The utility of the dynamic culture device is demonstrated by culturing cellular constructs in the presence of 200-Hz sinusoidal vibrations with a mid-membrane displacement of 40 µm. Mesenchymal stem cells cultured in the bioreactor respond to the vibratory signals by altering the synthesis and degradation of vocal fold-relevant, extracellular matrix components. The novel bioreactor system presented herein offers an excellent in vitro platform for studying vibration-induced mechanotransduction and for the engineering of functional vocal fold tissues.

概要

上皮層、固有層（LP）と声帯の筋肉から構成される人間の声帯は、健全な生産のための音波への肺からの空気の流れを変換する専門的なソフトな組織である^。1声帯が通常の発声時に定期的に振動し、 100〜300 Hzの範囲の基本周波数で最大30％の株を示す^。2アダルト声帯のLPは、表面的な（SLP）で構成される傾斜構造、中間（ILP）と深い（DLP）の層である。さらに分類群上皮と粘膜層として、SLP、およびボーカル靭帯へのILPとDLPを兼ね備えています^。3靭帯が成熟したコラーゲンとエラスチン繊維で強化されている間、SLP層は、まばらに分散された膠原繊維と主にアモルファスマトリックスが含まれています十分な強度を提供する^。4新生児声帯の構造や力学は、その成熟した対応とは大きく異なります。もののメカニズム声帯の開発と成熟を調節するのは、まだ完全には理解されていない、実験的証拠は、発声由来の機械的ストレスの決定的な役割を指摘しています。

音声乱用、感染症、化学的刺激物および外科的手技を含むいくつかの医学的条件は、声帯を損傷する可能性があります。声帯障害は米国の人口の推定3から9パーセントに影響を与える。声帯障害のための現在の治療法は^、5を限定され、幹細胞を用いた組織工学アプローチは、声帯機能を回復するための有望な戦略として浮上している。間葉系幹細胞（MSC）は、声帯組織工学のための主要な声帯の線維芽細胞に適切な代替物である^。6-9幹細胞の運命の仕様およびその後の組織の発達、機械的条件があるから彼らが存在する特定のニッチによって媒介される重要な要因^。10機械的な力は、組織形態形成Aの本質的な調節因子であるndは、特に日常的に負荷にさらされる組織に対するホメオスタシス、 ^図11の組織工学の観点から、それが生理学的に関連する機械的刺激への曝露は、細胞分化および組織特異的基質リモデリングを促進する幹ことが実証された^。12-15

組織培養バイオリアクターは、インビトロ細胞又は組織成長のための所望の生理学的環境をシミュレートするように設計されている。声帯組織工学のためには、phonating声帯の機械的な環境を再現するために特に重要です。理想的な声帯バイオリアクターは、効果的に周波数、振幅、振動の持続時間にわたって容易な制御を可能にする、培養細胞への振動の手がかりを提供する必要があります。ティッツェらはマトリックスタンパク質の細胞産生を刺激するために、高周波（20〜200 Hz）の振動で静的ストレッチを組み合わせた声帯バイオリアクター（T1バイオリアクター ^）16を考案した。資料を使gこのバイオリアクター、ウェッブや同僚^17は、ヒアルロン酸（HA）ベースのハイドロゲル中で培養皮膚線維芽細胞上で10日、100 Hzの振動の影響を研究した。振動を受けるの構築物は、スタティックコントロールと比較して、HA合成酵素2（HAS2）、デコリン、フィブロモおよびマトリックスメタロ-1（MMP1）の発現の上昇を示した。刺激作用は時間依存であることが見出された。さらに最近では、我々のグループ^18は、パワーアンプ、関数発生器、同封スピーカと付着した細胞に振動空気圧を転送円周方向に固定されたシリコーン膜を使用して声帯バイオリアクター（J1バイオリアクター ） を組み立てた。 J1バイオリアクターで培養新生児包皮線維芽細胞は、最大0.05％の面内歪みと、60、110又は300ヘルツの振動の1時間に供した。定量PCRの結果は、いくつかのECM遺伝子の発現が適度に変化させ、振動周波数に応答して変更されたことを示唆しと振幅。

これらのバイオリアクターの設計は、興味をそそるが、いくつかの制限を有する。たとえば、T1はシステムが達成可能な最大周波数を制限すること、機械的な連結用のコネクタやバーが多数を必要とします。さらに、細胞は、データ解釈を複雑に望ましくない機械的攪拌および流体の摂動を受けてもよい。 J1バイオリアクターは、一方では、比較的低いエネルギー変換効率を示し、かつユーザーフレンドリーではない。また、振動が頻繁に基本的なシリコーン膜から細胞を含んだ構造体を取り外す。 J1のバージョンと同じ原理に基づいて設計された、ここで報告されたJ2声帯バイオリアクターは、一貫性と再現性のために最適化されています。発声模倣振動が、MSC-人口繊維状のポリ（ε-カプロラクトン）（PCL）足場がeffectivあり、個々に取り付けた振動室内に空気力学的に生成されますイーリー確保。レーザドップラ振動計（LDV）は、ユーザーが膜/足場アセンブリの振動プロファイルを確認することができます。私たちのデモでは、MSCは7日間、12時間の毎日の合計1-HR対1-HRオフ（OF）のパターンで200 Hzの正弦波振動にさらされている。課された振動の合図に対する細胞応答を系統的に調べている。全体的に、J2声帯は、動的な細胞培養研究は、高いスループットと再現可能な方法で実施することができるように、ほとんどのユーザーフレンドリーな機能を提供します。

プロトコル

1。バイオリアクターアセンブリ（ビデオ1）

1. 予め決定された内側および外側の寸法（ 図1）アルミニウム型（環状ダイス+スペーサピン）を作る。
2. ステップ1.1から金型を用いて、シリコーン膜（直径1.5ミリメートル、 図1：42ミリメートル、厚さ）を作製強固なスリーブ（直径： 図1のスペーサピンによって形作ら12ミリメートル、厚さ〜0.25ミリメートル）での市販のシリコーンエラストマーキットを用いてミドル。
3. 円形の開口部（直径24ミリメートル）でアクリルブロックのペア（ 図2（4、5））を作る途中で、マッチング畝と溝を持つトップ（1.8センチメートル厚）とボトム（0.9センチメートル厚）ブロックを刻む^。10
4. ペアアクリルブロック間のシリコーン膜を挟む。一定の力（35 cNで·メートル）に設定されたマイクロトルクドライバーを使用して4隅のネジでアセンブリを固定します。結果として、水密、24メートルM、幅18ミリメートル、深振動室は、（ 図2C）が作成されます。
5. 底のアクリルブロックの角ネジの別のセットを介して振動室の下に^3「拡張された範囲のミニウーファー（ 図2D、8Ω/20W）をマウントします。この時点で、個々の振動モジュールが組み立てられる。
6. 7追加の振動モジュールを複製。等間隔の円形の穴にスピーカーの拠点を置くことによって、2つの固定アルミニウムバー（40センチメートル×10センチメートル×2.5cm）のの1にそれらの4を固定（直径：10センチ、厚さ​​2センチ）のバーにカット。各円形の穴にアルミ棒の側面からネジを挿入することにより、各スピーカーを安定させる。
7. 個別にスピーカーセレクターでスピーカーを制御します。セレクタの対応する出力にスピーカ本体に正と負の入力にワイヤを取り付けることにより、セレクタに、個々のスピーカーを接続します。スピーカセレクタtはからの信号を可能にする（ 図2E）を一度に8つのすべてのスピーカーに到達するために、電力増幅器を通過した後、彼関数発生器。
8. 防湿筐体に2室列、スピーカーセレクターや関連する電子部品を配置します。市販の細胞培養インキュベーター内で、アセンブリ全体を収容する。
9. インキュベーターの背面にあるフィルタアセンブリを介してパワーアンプやスピーカーセレクターを接続する（医療グレードのPVCチューブを通して）メインケーブルを通します。

2。足場の作製と特性評価

1. 15重量％の濃度でクロロホルム中のPCLペレットを溶解する。 21のG平滑末端針でキャップ10ミリリットル注射器に溶液をロードします。
2. プログラム可能なシリンジポンプにシリンジをロックし、1ミリリットル/時の流量を設定してください。
3. 〜18センチメートルの針先·コレクタの距離で、水平に針から渡ってアルミ箔で覆われたコレクタを配置します。
4. 正Alliはをクランプ針の真ん中、アルミコレクタにグラウンド·ワニ口クリップにワニクリップは、それから15 kVの高電圧電源の電圧を設定してください。注意：高電圧、針からの距離を保つ。
5. 順次シリンジポンプと、電源をオン;すぐにきれい/安定した繊維ジェット乾いたペーパータオルを使用して針の先端を取り囲む残留ポリマー溶液を除去し、テイラーコーン^19が形成されている。
6. 繊維は〜250〜300ミクロン（現在の紡糸条件の下で〜7時間）の厚さにアルミニウム集電体上に蓄積することができます。残留溶媒を除去するために1〜2日間真空乾燥器内の結果として足場を保管してください。
7. 画像足場は、一貫性の繊維形態を示すために走査型電子顕微鏡を用いて、金でスパッタコーティング^。10

3。バイオリアクターアセンブリおよび特性評価

1. 2：4本のアーム（長さ：円筒状のディスク（直径8mm）をパンチ最初のディスクの外径をカットする12ミリメートル、直径生検パンチを使用して、紡糸したままのPCLマット（ 図2A）のうちミリメートル）。そして、均等に腕を切断する場所を獲得するために、円形の刃の周りに等間隔4 2ミリメートル、長ノッチを作るために第二に、8ミリメートル生検パンチを使用しています。 8ミリメートルパンチで得点した後、外側の腕の端をカットするメスの刃を使用しています。延長アームを介してシリコーン膜の溝に足場を挿入します（ビデオ1）。優しくマイナスピンセットを用いて表面を押して、挿入された足場を平らに。
2. レーザー反射を支援するために、PCL足場に薄いAl箔（8ミリメートルX 2ミリメートル、直交形状、 図2B）の小片を取り付けます。
3. 振動チャンバー内に（ステップ1.4で詳述したように）組み立てシリコーン膜/ PCL足場を固定します。振動の前に、PCL足場を水和するために、チャンバー内に1.5ミリリットル水を加える。
4. 関数発生器を用いて、振動記号を紹介挟まれたアクリルチャンバーにALS（0.1 Vのピーク·ツー·ピーク電圧、VPPが例えば、200 Hzの正弦波、）。正確に各スピーカー入力の電圧を測定するために電圧計を使用しています。注：ファンクション·ジェネレータからのVppの読み出しは、スピーカーに送ら最終的な電圧とは異なります。
5. シングルポイントLDVを組み立て、パン·チルトヘッド、三脚への光ファイバレーザセンサヘッドを固定します。角度センサヘッドは、テーブルトップに対して垂直に向くように。同軸ケーブルを介してデータ取得モジュールにLDVセンサヘッドを接続してUSB経由でノートPCへのモジュール。
6. シリコーン膜上の種々の所定の点（ 図2B及び図3）に垂直にレーザ光 ​​を当てる。
7. データ収集ソフトウェアを使用して、中膜の変位を記録する。 「オプション」メニューから「取り込み設定」をクリックします。次いで、FFT」に測定モードを変更する221;。次に、メインツールバーの「連続測定」をクリックして変位を記録するために選択された周波数（ 図6D）にフォームのピークをクリックします。
8. 基板を横切る相対位置の関数として通常の中間膜変位_（0 w）をプロットする。制作8.5データ解析ソフトウェアを用いた表面の振動プロファイルの3Dマップを構築する。

4。振動細胞培養

1. MSC維持培地中/ cm ²で4,000〜5,000細胞の初期播種密度でのT150組織培養フラスコ中で継代培養ヒト骨髄由来MSC。
2. 細胞培養の7-8日後（〜85％コンフルエントになるまで）、例えばをAccutaseなどの細胞解離試薬で細胞をトリプシン処理し、血球計、遠心分離（5分間、440×gで）を用いてカウントし、再懸濁細胞ペレット中4.5×10 ⁶細胞/ mlの濃度で新鮮MSCの維持培地。
3. PCL scaffoを浸す70％エタノールのO / Nでのld溶媒を蒸発させた後、5〜8分間殺菌UV光（254nm）への足場の両面を露出させる。
4. 1時間、37℃で20μg/ mlのフィブロネクチン溶液中でのPCL足場を浸します。シリコーン膜にフィブロネクチン被覆の足場を挿入します。ステップ1で詳述したようバイオリアクターを組み立てる。
5. 均等に保護されたPCL足場上の細胞懸濁液40μLを配布します。細胞は振動室に追加の1.5ミリリットル新鮮な培地を添加する前に、1〜1.5時間、添付することができます。
6. 文化3日間、静的に、MSCを含んだPCL足場と静置培養の完了時にメディアを更新します。
7. 携帯構築物、選択した振動体制を課す。注：例として、細胞は最大7日間、1日12時間〜40μmのAW ₀と200 Hzの振動（OF）1-HR対1-HRオフに供される。振動刺激を受けるの構築物は、バイブサンプルと、それらのcultuとして指定されている同一の振動チャンバー内の静的に赤がスタティックコントロール（STAT）として機能します。

5。生物評価

1. 一日おきに各チャンバから200μlの細胞培養培地を収集し（1日目、3、5、7）（800μlの各々）は一緒になって同じサンプルからのアリコートをプールする。
2. メーカーの手順に従って、それぞれ、MMP1 ELISA開発キットおよびヒアルロン酸競合ELISAキットを使用してマトリックスメタロ-1（MMP1）とHAの細胞産生を定量化する。一方、以前に報告されたELISAの手順に従って、可溶性エラスチン前駆体の産生をアッセイする^。8
3. 7日目の最後​​の振動周期が完了すると、すぐに鋭利なピンセットを用いて振動チャンバからの細胞構築物を除去し、短時間冷リン酸緩衝生理食塩水（PBS、4℃）でそれらをすすぐ。
4. 生/死染色のために、ヨウ化プロピジウム（PBS中1:2,000）を有する構築物をインキュベートし、SYTO-13 RTで5分間、同時に（PBS中1:1000）。画像多光子共焦点顕微鏡を用いて染色し構築します。
5. これとは別に、ドライアイス上で、PBS-すすい携帯構文スナップ凍結し、遺伝子解析のための以前に報告されたプロトコールに従って、全細胞RNAを抽出します^。9
6. 紫外可視分光光度計を用いて抽出したRNAの量と質を確認してください。 1.8〜2.2のA260/A280およびA260/A230比を有するRNA試料をその後のqPCR分析のために使用される。
7. リバース市販の逆転写キットを用いてcDNAにRNA（500 ngの/試料）を転写する。
8. 先に詳述した手順に従って、市販のPCRマスターミックスを用いたリアルタイム配列検出システム上でPCR反応を行う^。8
9. 商用のqPCRデータ解析ソフトウェアを用いて定量PCR結果を分析する。データ分析の信頼性を確保するために、複数の参照遺伝子（YWHAZ、TBP、PPIA）はintとして使用されるernalコントロール、および特異的プライマー効率の分散が考慮される^。8

結果

エレクトロスピニングにより作製したPCL足場は4.7ミクロン（ 図4A）の平均直径がミクロンサイズの間質性毛穴やランダムに絡み合った繊維を含む。高倍率では、ナノスケールの溝や孔は、個々の繊維（ 図4B）上に表示されます。フィブロネクチンと足場のコーティングが親水性を向上させ、PCL足場（未発表の観察）に広がる/初期細胞接着を容易にします。

ディスカッション

in vitroでの機能的な声帯組織の成功エンジニアリングは、多能性細胞の挙動を媒介するために声帯のような微小環境の再作成を必要とします。これは、一般的に組織または器官の構造は、それらが実行するために必要な機能を反映していると認められている。声帯組織の場合^22は 、発声中に発生する高周波振動は、組織の成熟に重要であることが提案されている。声帯バイオ?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Silicone elastomer kit	Dow Corning	Sylgard 184	Cure the membrane at 100 °C for 2 hr
PCL	Sigma Aldrich	440744-500G	Mn ~80 kDa, dissolve O/N
Chloroform	Sigma Aldrich	C7559-5VL
Human bone marrow-derived MSCs	Lonza	PT-2501	Received with passage 2
MSC maintenance media	Lonza	PT-3001	10% FBS in basal media supplemented with L-glutamine, gentamicin and amphotericin
Accutase cell dissociation reagent	Life Technologies	A11105-01
Ethanol	Sigma Aldrich	E7023-500ML
Fibronectin	Sigma Aldrich	F2006-1MG
MMP1 DuoSet ELISA kit	R&D systems	DY901
HA ELISA kit	Echelon Biosciences	K-1200
PBS	Life Technologies	14190-136
Propidium iodide	Life Technologies	P1304MP
Syto-13	Life Technologies	S7575
QuantiTect reverse transcription kit	Qiagen	205311
SYBR Green PCR master mix	Life Technologies	4309155
Replacement speaker	DAYTON audio (via Parts Express)	DS90-8	Paper cone, full range (80-13,000 Hz), 85 dB
Ergo Micro torque screwdriver	Mountz	# 020377	Torque range: 20-120 cN·m
Stereo speaker selector	RadioShack	40-244	Maximum power handling 50 W
Function generator	Agilent	33220A	Frequency range 1 µHz-20 MHz
Power amplifier	PYLE audio	PylePro PT2400	Frequency response: 10 Hz-50 kHz, two speaker channels
Cell culture incubator	Thermo Fisher	Steri-Cult 3307
Syringe pump	New Era Pump Systems	NE-300
High voltage power supply	Spellman	CZE 1000R	Output voltage: 0-30 kV
Scanning electron microscope	JEOL-USA	JSM-7400F
Desk gold sputter coater	Denton Vacuum	DSK00V-0013
Doppler laser vibrometer	Polytec	PDV-100	Non-contact velocity measurement (0-22 kHz)
PCR sequence detection system	Applied Biosystems	ABI7300
Multiphoton confocal microscope	Zeiss	Zeiss 510Meta NLO
UV-VIS Spectrophotometer	NanoDrop Products via Thermo Scientific	ND-2000
VibSoft Data Acquisition Software	Polytec		Acquisition bandwidth up to 40 MHz
Origin 8.5 data analysis software	OriginLab
qbasePlus qPCR data analysis software	Biogazelle	V2.3
Aluminium alloy	McMaster-Carr	Alloy 6061
Acrylic blocks	McMaster-Carr
Polycarbonate anti-humidity chamber	McMaster-Carr		Impact-Resistant Polycarbonate
screws	McMaster-Carr
Electronic cable/wire
Medical grade PVC tubing	US Plastic Corp.	Tygon S-50-HL	Clear, biocompatible
10 ml Syringe	Becton Dickinson	309604
21 G Blunt ended needle	Small Parts	NE-213PL-25	1-1/2" length
Alligator clip adapters	RadioShack	270-354	Fully insulated
8 mm Biopsy punch	Sklar Surgical Instruments	96-1152	Sterile, disposable
12 mm Biopsy punch	Acuderm (via Fisher Scientific)	NC9998681
Tissue culture flasks	Corning		Cell culture treated