Un canal celular conectado a Patch-clamp grabación

Resumen

Descrito aquí es un procedimiento para la obtención de largos tramos de grabación actual de un canal de iones con la técnica de patch-clamp de células-adjunto. Este método permite observar, en tiempo real, el modelo de open-close conformaciones de canales que son la base de la señal biológica. Estos datos informan acerca de las propiedades de los canales en las membranas biológicas inalteradas.

Resumen

Proteínas de los canales iónicos son dispositivos universales para la comunicación rápida a través de membranas biológicas. La firma temporal del flujo iónico que generan depende de las propiedades intrínsecas a cada proteína del canal, así como el mecanismo por el cual se genera y se controla y representa un área importante de la investigación actual. Información acerca de la dinámica de funcionamiento de proteínas de los canales de iones se puede conseguir mediante la observación de largos tramos de corriente producida por una única molécula. Descrito aquí es un protocolo para la obtención de patch-clamp grabaciones de corriente de la célula-adjunto de un canal para un canal de iones cerrada ligando, el receptor de NMDA, expresado de forma heteróloga en células HEK293 o de forma nativa en las neuronas corticales. También se proporcionan instrucciones sobre cómo adaptar el método a otros canales iónicos de interés al presentar el ejemplo del canal PIEZO1 mecano-sensible. Este método puede proporcionar datos con respecto a las propiedades de conductancia del canal y la secuencia temporal de Opeconformaciones n cerrados que componen el mecanismo de activación del canal, lo que ayuda a comprender sus funciones en la salud y la enfermedad.

Introducción

Comunicación rápida a través de membranas biológicas depende casi exclusivamente de las proteínas de membrana oligómeros formadores de poros, comúnmente conocidos como canales. Estas proteínas son muy diferentes en las señales de activación, los mecanismos de activación periódica y propiedades de conductividad. Proteínas de los canales cuyos poros son selectivos para iones se clasifican como canales iónicos; su activación produce corrientes iónicas a través de la membrana, y sus respuestas se puede grabar con alta resolución en tiempo real utilizando técnicas electrofisiológicas. Las señales de activación abarcan una amplia gama de insumos químicos y físicos, incluyendo gradientes de concentración, las fuerzas mecánicas y eléctricas y la temperatura; por lo tanto, la clasificación más canales iónicos en ligando cerrada, mechanosensitive, voltaje cerrados o tipos sensibles al calor. En este artículo, se describen protocolos para registrar la actividad de un canal de un canal de ligando cerrada, el receptor de NMDA, y un canal de mechanosensitive, PIEZO1, utilizando la técnica de patch-clamp.0;

Electrofisiología Patch-clamp es el primer y más utilizado método experimental suficientemente sensible para permitir la observación de moléculas individuales ^{1, 2.} Además de esta exquisita sensibilidad, que se ha expandido enormemente las preparaciones biológicas susceptibles de grabación electrofisiológico y también ha permitido la observación de los canales iónicos en membranas intactas. En primer lugar, debido a que ambos de fijación de tensión y de grabación actual se llevan a cabo con el mismo electrodo, que puede ser utilizado para grabar señales a través de células pequeñas o parches de membranas. La técnica reveló que los canales iónicos no se restringen a las membranas excitables de músculos rana, electroplaques anguila, o axones gigantes del calamar ^{3, 4,} sino que representan accesorios ubicuos de los mecanismos de señalización transmembrana y son intrínsecas a todos los tipos de membranas celulares de uni-o los organismos multicelulares, y también a las membranas intracelulares. Importaciónantly, la capacidad para registrar las corrientes transmembrana con sólo conectar una pipeta de vidrio de una célula intacta proporcionó la oportunidad sin precedentes para registrar la actividad de los canales iónicos en las membranas ininterrumpido nativas. Así, el adjunto técnica de patch-clamp de células, que se describe en este protocolo, permite el seguimiento de la actividad de los canales iónicos de forma continua durante decenas de minutos o más en su ambiente nativo.

Bajo las fluctuaciones térmicas normales, todas las proteínas, incluyendo las proteínas de los canales iónicos, sufren cambios estructurales a lo largo de una escala de tiempo amplio, con los reordenamientos más rápidos y más frecuentes representados muy probablemente por los movimientos de las cadenas laterales y los cambios mucho más lentos y menos frecuentes representados por el reposicionamiento de toda dominios o subunidades, o en algunos casos por modificaciones post traduccionales o interacciones proteína-proteína ^{5, 6.} Observando largos periodos en actividades generadas por una molécula puede ayudar a comprender la funcióndinámicas internacionales de los canales iónicos en las membranas intactas fisiológicos y proporciona información valiosa sobre el mecanismo de funcionamiento de la molécula observado.

En contraste con la creciente comprensión de la diversidad de los canales de iones a través de tipos de células y etapas de desarrollo, el conocimiento sobre la composición molecular de los canales iónicos en membranas nativas es aún limitada. Todos los canales de iones son proteínas multiméricas y la mayoría de los canales de iones nativos ensamblan a partir de varios tipos de subunidades que producen proteínas de diversidad molecular amplia, que a menudo se acompaña con diversas propiedades de conductancia y de activación periódica. Por esta razón, los canales iónicos de composición molecular definido se estudiaron después de la expresión en sistemas heterólogos. En particular, las células HEK293, que son una línea clonal de células embrionarias humanas inmortalizadas de riñón ^7, ganado amplia aceptación como el sistema preferido para la expresión heteróloga de los canales iónicos recombinantes. Entre el hombreY ventajas que elevaron las células HEK293 como el sistema de elección para la electrofisiología de canales de iones son la facilidad y asequibilidad de cultivo y mantener los cultivos estables de larga duración, su capacidad para llevar a cabo después de la traducción de plegado, el procesamiento y el tráfico de proteínas de mamíferos, y en muchos casos , su bajo nivel o incluso ausencia de la expresión endógena para el canal de interés ^{7, 8.} Expresando los canales iónicos recombinantes y estudiar sus propiedades funcionales en células HEK293 sigue siendo un enfoque valioso para obtener información sobre las propiedades de estructura-función de los canales iónicos así como las propiedades específicas de las isoformas de los canales iónicos y sus roles en el tejido nativo. Los protocolos que se describen en este artículo se pueden aplicar igualmente a los canales iónicos recombinantes expresadas en células HEK293 y para los canales iónicos nativas.

En resumen, la técnica de patch-clamp, a través de su capacidad sin precedentes para resolver señals de una molécula sigue siendo, hasta la fecha, el método más directo para observar el comportamiento de las moléculas individuales. En su modo celular conectado, la grabación de patch-clamp permite períodos largos de observación que, cuando se hace por una molécula, pueden proporcionar una visión excepcional sobre el funcionamiento de los canales iónicos. A continuación se presenta un protocolo para la obtención de alta resolución grabaciones actuales de parches adjuntos de células que contienen una proteína de canal iónico.

Protocolo

1. Cultivo Celular y Expresión de proteínas

1. Mantener las células HEK293 (número de ATCC CRL-1573) entre los pasajes 22 y 40, que incluye pasajes realizados por la ATCC, en cultivo en monocapa en DMEM suplementado con 10% de suero fetal bovino (FBS) y 1% de penicilina / estreptomicina a la mezcla de 5% de CO ₂ y 37 ° C. Entre los experimentos, las células de paso en matraces T25 a 5-20 diluciones en un volumen final de 10 ml. Nota: El uso de células durante estos pasajes garantiza la salud celular favorable que permita la formación de sellado óptimo y estabilidad parche.
2. Para la transfección, la placa de células HEK293 en placas de 35 mm a una densidad de ~ 10 ⁵ células / placa, que corresponde a ~ 0,5-0,6 ml de suspensión de células por plato y crecer las células en 2 ml de medio de 18-24 h.
3. En un tubo estéril de centrífuga de 1,5 ml, preparar la mezcla de transfección durante cuatro platos de 35 mm mediante la adición de (en este orden): (1) 1 g de cada ADNc (GluN1, GluN2A, y GFP); (2) 315 l deagua doblemente destilada _(ddH2O); (3) 350 l de 42 mM de 4 - (2-hidroxietil)-1-piperazinetanosulfónico ácido (HEPES), y (4) 35 l de _CaCl2 2,5 M gota a gota, que se utiliza para formar el precipitado.
4. Tubo Vortex durante 5 segundos y añadir 175 l de suspensión de la transfección en cada uno de los cuatro platos de 35 mm chapada el día anterior, que ahora contiene células a 50-60% de confluencia, e incubar las células a 37 ° C durante 2 horas.
5. Aspirar el medio de transfección, se lava con PBS y se reemplaza con 2 ml de medio de crecimiento suplementado con 2 mM de MgCl ₂ para evitar que la excitotoxicidad mediada por receptor de NMDA ^9. Nota: Las células se pueden utilizar para registros electrofisiológicos mensaje 24-48 h de la transfección.

2. Preparación del electrodo

1. Generar 2 pipetas de registro simétricas tirando de tubos de vidrio borosilicato con un extractor vertical. Basándose en el tamaño y la geometría de la punta resultante, más pipetas formausando una pulidora. Nota: El tamaño de la punta puede ser evaluado visualmente y eléctricamente. Visualmente, el diámetro exterior debe estar en el rango de 1.4 a 5.6 micras. Eléctricamente, una punta de tamaño óptimo, cuando se llena con solución extracelular, debe producir resistencias en el rango MΩ 12-24 (véase la Figura 2B).
2. Use una solución de la pipeta, lo que para los experimentos con células adjunta representa el medio extracelular que producirá la actividad del canal máximo y altas amplitudes de corriente. Nota: Para los receptores de NMDA, esto corresponde a una solución que contiene concentraciones de saturación de los agonistas (glutamato y glicina), EDTA 1 mM, que quela inhibidores catiónicos divalentes y bloqueadores, y tiene concentraciones fisiológicas de sodio (150 mM) como único ion permeable ( en mM: 1 glutamato, glicina 0,1, NaCl 150, KCl 2,5, EDTA 1, y 10 lambda HepBs, tamponada a pH 8,0 con NaOH 1 N).

3. Patch-clamp grabación celular conectado

1. Abrir softwa adquisición de datos QuBre (www.qub.buffalo.edu), y seleccione la ventana de adquisición en virtud de 'diseño'. Abra un nuevo archivo de datos QuB (QDF) haciendo clic en 'New Data "bajo el menú desplegable titulado' File 'e introduzca los siguientes parámetros iniciales: la tasa de muestreo, 40 kHz; A escala / D, 3000; canal de salida, 1; y el tamaño de los datos A / D, 2. Ajuste la escala de amplitud de 0,1 V / pA haciendo clic derecho en el archivo de datos, la selección de propiedades, y hacer clic en la pestaña 'datos'. Nota: Estos parámetros pueden ser refinados para cada configuración usando un modelo de células en el modo de célula-adjunto. Instrucción adicional sobre la adquisición de datos con el software QuB y propiedades QDF están en línea en www.qub.buffalo.edu.
2. Seleccionar un plato de 35 mm que contiene células que expresan canal iónico y reemplazar el medio de cultivo con 2 ml de PBS que contiene calcio y magnesio; montar el plato en la platina del microscopio y se centran en el campo celular mediante microscopía de contraste de fases para evaluar que las células están sanas y bien unidos al platoen la moda monocapa (Figura 1A). Cambiar a la detección de fluorescencia para verificar que la transfección ha sido satisfactoria (Figura 1B). Nota: El rango de intensidades de fluorescencia se puede utilizar como una medida cruda de la expresión de la proteína.
3. Para la grabación de un solo canal, ajuste la salida de ganancia del amplificador para x10, la configuración de parche para β = 1, filtro analógico de 10 kHz, el modo de fijación de voltaje y el voltaje aplicado a 100 mV. Con la orden de retención de voltaje en la posición OFF, seleccione el botón de 'prueba del sello'.
4. Basado en la fluorescencia y la salud de las células, elija una célula para reparar. Compruebe bajo contraste de fase que la célula es bien unidas a la placa, tiene una gran parte de la superficie de la célula expuesta para parches, y de lo contrario se ve saludable. Nota: Mantenga la iluminación de contraste de fase para evitar el blanqueo de la célula durante la aproximación y patch-sujeción.
5. Llenar una pipeta recién pulida con suficiente solución para que haga contacto con la electrodelectrónico y agite suavemente para eliminar las burbujas de aire que puedan estar atrapadas en la punta. Asegure la pipeta de la grabación en el headstage amplificador apretando el tornillo de sellado del soporte de pipetas y asegurarse de que el alambre de plata se encuentra inmersa en la solución de la pipeta.
6. El uso de un pequeño (5 cc) de la jeringa de plástico, que está conectado a la titular de la pipeta por tubo, se aplica una suave presión positiva para evitar que entren impurezas en y la obstrucción de la punta durante la aproximación (Figura 2A).
7. Usando el micromanipulador, dirija la pipeta en el baño y colocar directamente sobre la celda seleccionada para parchar (Figura 1C), cerrando el circuito eléctrico. Tome nota del osciloscopio, que debe indicar una forma de onda rectangular correspondiente al sello de la señal de prueba del amplificador (Figura 2B). Nota: Al entrar en el baño, la resistencia de la pipeta dentro del rango óptimo es 12-24 MΩ. Para una señal de prueba 5 mV, la corriente medida range corresponde a ~ 20-40 pA.
8. Durante la supervisión de la posición de la pipeta visualmente a través de la resistencia microscopio y pipeta eléctricamente en el osciloscopio, continuar la aproximación en pequeños incrementos hasta que la pipeta suavemente incide sobre la célula, y la señal de prueba disminuye ligeramente para indicar aumento de la resistencia (Figura 2B).
9. Para formar un cierre hermético, recoger la jeringa y aplicar una ligera presión negativa a través del tubo lateral tirando del émbolo de la jeringa, que tira de la membrana celular en la punta de la pipeta de grabación e inicia la formación de un sello resistencia GΩ ^10. Tome nota de la forma de onda de la señal de prueba en el osciloscopio, en el que la formación del sello se indica por su aplanamiento completo, con sólo transitorios capacitivos visibles (Figura 2B). Nota: Si la señal no se aplane completamente la línea de base o hace ruido, esto indica un sellado débil con fuga de corriente sustancial alrededor del sello. Esto evitará que Resolving uno corrientes de los canales. Si este es el caso, retirar la pipeta de la célula y fuera de la bañera, retírelo de la etapa de la cabeza y lo descarta. Repita el proceso con una pipeta recién pulida hasta obtener un sello en el rango adecuado (≥ 1 GΩ).
10. En el amplificador, cambiar la palanca de mando externa de 'prueba de sellado' en 'off'; cambiar el orden de tensión que sostiene a positivo (lo que se ha establecido previamente en 'off'); y aumentar la ganancia de x100. Observar el osciloscopio para la actividad del canal, que, si está presente, se muestra como desviaciones al alza cuadrados desde la línea de base previamente plana (Figura 2C).
11. Si se muestra la actividad del canal en el osciloscopio, adquirir datos en el archivo digital abierto previamente en QuB, pulsando el botón "play" seguido del botón "record". Para detener la adquisición de datos, pulse el botón de parada en QuB, y guarde el archivo QDF a una facilidad retrievubicación capaces en el disco duro del ordenador seleccionando "Guardar datos como ..." en el menú desplegable titulado 'Archivo'.

4. Datos de preprocesamiento y la idealización

Nota: Información adicional se puede extraer de las grabaciones de canales individuales mediante análisis estadísticos que asigna a cada punto de datos a una clase de la conductancia apropiado (en el caso más simple, cerrado o abierto). Este proceso se conoce como idealización de datos y una breve descripción de la idealización de datos con los medios k segmentarias (SKM) Método ¹¹ en QuB se describe a continuación.

1. Abra el archivo de datos en QuB, y ver las huellas actuales de la interfaz 'Pre' bajo 'layout'. Visualice el archivo grabado sin filtrar (eliminar filtro digital) desmarcando la casilla 'Fc.
2. Escanear visualmente el registro para detectar las irregularidades y los artefactos (Figura 4A). Picos de corriente breves correctos que ocur dentro de la traza (Figura 4) mediante la selección de una región limpia adyacente de la misma clase de la conductancia, destacando esta región, haciendo clic derecho y seleccionando 'búfer de borrado ajustado. Zoom sobre la espiga hasta que los puntos de muestreo individuales son visibles, seleccione la región que sustituir y borrar resaltando sólo esta región y haga clic en "borrar".
3. Definir la línea de base cero de corriente para el registro completo seleccionando una primera parte del registro donde la línea de base es estable, lo más destacado, haga clic derecho y seleccione 'línea de base set'. Verifique que la guía que aparece con precisión representa el nivel básico (púrpura en la Figura 4B)
4. Identificar puntos en el disco donde la línea de base de datos en bruto se desvía visiblemente desde la línea de base establecida. Corrija esto seleccionando una pequeña sección de la línea de base en la región de desviarse, haga clic derecho y seleccione el comando 'agregar un nodo de referencia ».
5. Identificar las regiones del tque la grabación que contiene el exceso de ruido o los artefactos que no se pueden corregir fácilmente (Figura 4C). Resaltar la región para ser desechados, haga clic y seleccione 'Eliminar'. Nota: En este caso la información cinética se pierde: el registro procesado será más corto y los puntos que se producen después de que el punto de empalme parecerá ser continuo con la región pre-ruido.
6. Para idealizar registros utilizando el algoritmo de SKM ^11, resalte una parte de la traza que contiene tanto abierto como cerrado acontecimientos y entrar en la interfaz 'Mod' bajo 'Layout'. En el panel "modelo", resalta una parte limpia de la traza que es representativa de la línea de base en todo el archivo, haga clic en el cuadrado negro (estado cerrado) y seleccione "agarrar". Haga lo mismo para las aberturas de los canales, poniendo de relieve la conductancia abierto, haga clic derecho en el cuadrado rojo en el panel de "modelo" y seleccione "agarrar".
7. Realice la idealizaciónción para el registro completo seleccionando el botón 'File' en 'Origen de datos.' Haga clic en la pestaña "idealizar" debajo de la sección 'Modeling' para verificar que los parámetros deseados para el análisis son correctos y, a continuación, haga clic en "Ejecutar". El resultado de la idealización, junto con el histograma de amplitud para el archivo completo, se superpone con los datos para permitir la inspección visual de la idealización (Figura 5). Nota: idealización inadecuada puede conducir a la generación de los "eventos falsos, 'en el que QuB detecta aperturas y cierres de canales que no ocurren en realidad. Dentro de la resolución de grabación, que se establece por el filtro analógico del amplificador y la frecuencia de muestreo, la resolución con la que SKM detecta eventos abiertos y cerrados se puede controlar mediante el establecimiento de un tiempo muerto para los análisis. Tiempos muertos óptimos deben ser seleccionados por ensayo y error y dependerán de la frecuencia de muestreo, sin embargo, una buena regla general espara seleccionar un tiempo muerto que es de 2-3 muestras ^12.
8. Para comprobar que la idealización representa con precisión los datos en bruto, escanear manualmente la traza idealizada. Tras la identificación de errores en la idealización, resalte la traza sobre el evento falso, haga clic derecho y seleccionar "Unirse Idl. ' Nota: Para obtener opciones adicionales y una explicación detallada de los distintos comandos y funciones en QuB, consulte el Manual QuB línea (www.qub.buffalo.edu).

Resultados

Recombinante receptores NMDA

Los receptores NMDA se unen y responden a la acción simultánea de dos co-agonistas: glutamato y glicina. Se reúnen como heterotetrámeros de dos subunidades de unión a glicina GluN1 y dos glutamato vinculante subunidades GluN2. GluN2 subunidades están codificadas por cuatro genes (AD) y de éstos las formas más ampliamente transcritas en el cerebro son GluN2A en adultos y GluN2B en animales jóvenes. Debido a la diversidad de los subtipos d...

Discusión

En el campo de los canales iónicos, un área importante de la investigación se dedica a la comprensión de la secuencia de acontecimientos que conduce al canal de apertura o mecanismo de compuerta del canal. Para la mayoría de los canales, este proceso es complejo e implica varios pasos cinéticos que no se puede deducir a partir de una señal multicanal macroscópica. Por el contrario, los experimentos pueden ser diseñados, donde la observación de la secuencia de los eventos de apertura / cierre en el registro de ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chemicals	Sigma	Various
Borosillicate Glass	Sutter	BF-150-86-10
Bright field inverted microscope	Olympus	1x51	Nikon also has similar microscopes
Fluroescent box	X-cite	Series 120
Liquid Light Guide	X-cite	OEX-LG15
Micromanipulator	Sutter Instruments	MP-225
Oscilloscope	Tektronix	TDS1001
Amplifier	Molecular Devices	Axon Axopatch 200B
Table	TMC	63561
NIDAQ card	National Instruments	776844-01
Puller	Narishige	PC-10
Polisher	Narishige	Microforge MF-830
Faraday Cage	TMC	8133306
High Speed Pressure Clamp	ALA Scientific Instruments	ALA HSPC
Pressue/Vaccuum Pump	ALA Scientific Instruments	ALA PV-PUMP	For HSPC-1