Un canale Cell-allegato patch-clamp registrazione

Riepilogo

Qui viene descritta una procedura per ottenere lunghi tratti di registrazione corrente da un canale ionico con la tecnica patch-clamp cell-attached. Questo metodo permette di osservare, in tempo reale, il modello di apertura-chiusura conformazioni di canale che stanno alla base del segnale biologico. Questi dati informano sulle proprietà dei canali nelle membrane biologiche inalterate.

Abstract

Proteine ​​canale Ion sono dispositivi universali per la comunicazione veloce attraverso le membrane biologiche. La firma temporale del flusso di ioni generano dipende dalle proprietà intrinseche di ciascuna proteina canale così come il meccanismo attraverso il quale è generato e controllato e rappresenta un'importante area di ricerca corrente. Informazioni sulle dinamiche operative delle proteine ​​del canale ionico può essere ottenuta osservando lunghi tratti di corrente prodotte da una singola molecola. Qui descritto è un protocollo per ottenere patch-clamp registrazioni di corrente di un canale Cell-attached per una gated canale ionico ligando, il recettore NMDA, espresso eterologamente in cellule HEK293 o nativo in neuroni corticali. Sono fornite anche le istruzioni su come adattare il metodo per gli altri canali ionici di interesse presentando l'esempio del canale PIEZO1 meccano-sensibili. Questo metodo può fornire dati riguardanti le proprietà conduttanza del canale e la sequenza temporale di opeconformazioni n chiusi che compongono il meccanismo di attivazione del canale, contribuendo così a capire le loro funzioni in materia di salute e di malattia.

Introduzione

Comunicazione veloce attraverso le membrane biologiche si basa quasi esclusivamente su oligomeriche formanti pori proteine ​​di membrana, comunemente indicato come canali. Queste proteine ​​sono molto diverse in segnali di attivazione, meccanismi di gating, e le proprietà di conduttanza. Proteine ​​canale cui pori sono selettivi per ioni sono classificati come canali ionici; la loro attivazione produce correnti ioniche attraverso la membrana, e le risposte possono essere registrati con alta risoluzione in tempo reale utilizzando tecniche elettrofisiologiche. I segnali di attivazione abbracciano una vasta gamma di input chimici e fisici, tra cui gradienti di concentrazione, forze meccaniche ed elettriche, e la temperatura; in tal modo, un ulteriore classificazione canali ionici in ligando recintato, meccanosensibili, tensione recintato, o tipi sensibili al calore. In questo articolo, i protocolli sono descritti per registrare l'attività di un canale da un canale ligando gated, il recettore NMDA, e un canale meccanosensibili, PIEZO1, utilizzando la tecnica del patch-clamp.0;

Patch-clamp elettrofisiologia è il primo e più diffuso metodo sperimentale sufficientemente sensibile per consentire l'osservazione di singole molecole ^{1, 2.} In aggiunta a questa sensibilità squisita, ha potenziato notevolmente i preparati biologici suscettibili di registrazione elettrofisiologica e inoltre ha permesso l'osservazione dei canali ionici in membrane intatte. In primo luogo, perché entrambi serraggio tensione e corrente di registrazione sono realizzate con lo stesso elettrodo, può essere utilizzato per registrare segnali attraverso piccole cellule o membrane patch. La tecnica ha rivelato che i canali ionici non sono limitati alle membrane eccitabili dei muscoli della rana, electroplaques anguilla, o assoni giganti di calamaro ^{3, 4,} ma piuttosto che essi rappresentano infissi onnipresenti di meccanismi di segnalazione transmembrana e sono intrinseci a tutti i tipi di membrane cellulari di uni-o organismi multicellulari, e anche alle membrane intracellulari. Importantly, la capacità di registrare le correnti transmembrana semplicemente collegando una pipetta di vetro di una cellula intatta fornito l'opportunità senza precedenti per registrare l'attività di canali ionici nelle loro membrane undisrupted nativi. Così, l'allegata patch-clamp cella, che è descritto in questo protocollo, consente il monitoraggio dell'attività di canali ionici ininterrottamente per decine di minuti o più nel loro ambiente nativo.

In normali fluttuazioni termiche, tutte le proteine, tra cui proteine ​​del canale ionico, subiscono cambiamenti strutturali su vasta scala di tempo, con i riarrangiamenti più veloci e più frequenti rappresentato probabilmente dai movimenti della catena laterale e molto più lento, meno frequenti cambiamenti rappresentate dal riposizionamento dell'intero domini o subunità, o in alcuni casi di modificazioni post traduzionali o interazioni proteina-proteina ^{5, 6.} Osservando lunghi periodi di attività generate da una molecola può aiutare a comprendere la funzionedinamica zionali di canali ionici in membrane fisiologiche intatte e fornisce preziose informazioni circa il meccanismo di funzionamento della molecola osservata.

In contrasto con la crescente comprensione della diversità dei canali ionici attraverso tipi di cellule e fasi di sviluppo, le conoscenze sulla composizione molecolare dei canali ionici in membrane native è ancora limitata. Tutti i canali ionici sono proteine ​​multimeriche e la maggior parte dei canali ionici nativi assemblare da diversi tipi di subunità che producono proteine ​​di diversità molecolare ampia, che è spesso accompagnata con conduttanza e gating diverse proprietà. Per questo motivo, canali ionici di composizione molecolare definita sono studiati su espressione in sistemi eterologhi. In particolare, cellule HEK293, che sono una linea clonale delle cellule renali embrionali umane immortalizzate ^7, ampiamente accettato come il sistema preferito per l'espressione eterologa di canali ionici ricombinanti. Tra l'uomovantaggi y che le elevate cellule HEK293 come il sistema ideale per elettrofisiologia canale ionico sono la facilità e la convenienza di coltura e il mantenimento delle culture stabili di lunga durata, la loro capacità di svolgere post-traslazionale piegatura, l'elaborazione e il traffico di proteine ​​di mammiferi, e in molti casi , il livello basso o addirittura assenza di espressione endogena per il canale di interesse ^{7, 8.} Esprimendo canali ionici ricombinanti e studiare le loro proprietà funzionali in cellule HEK293 continua ad essere un valido approccio per ottenere informazioni sulle proprietà struttura-funzione dei canali ionici e le proprietà specifiche delle isoforme del canale ionico e il loro ruolo nel tessuto nativo. I protocolli descritti in questo articolo possono essere applicati ugualmente bene a canali ionici ricombinanti espressi in cellule HEK293 e canali ionici nativi.

In sintesi, la tecnica del patch-clamp, attraverso la sua capacità senza precedenti di risolvere segnales da una molecola rimane, ad oggi, il metodo più diretto per osservare il comportamento delle singole molecole. Nella sua modalità cella-attached, la registrazione patch-clamp consente lunghi periodi di osservazione che, se fatto per una molecola, può fornire indicazioni eccezionale sul funzionamento dei canali ionici. Qui di seguito viene presentato un protocollo per l'ottenimento di registrazioni correnti ad alta risoluzione da cellulari patch allegati contenenti una proteina del canale ionico.

Protocollo

1. Coltura cellulare e proteine ​​Expression

1. Mantenere cellule HEK293 (numero ATCC CRL-1573) tra i passaggi 22 e 40, che comprende i passaggi eseguiti da ATCC, in coltura monostrato in DMEM supplementato con 10% siero fetale bovino (FBS) e 1% di penicillina / streptomicina miscela al 5% di CO ₂ e 37 ° C. Tra gli esperimenti, le cellule di passaggio in fiasche T25 5-20 diluizioni in un volume finale di 10 ml. Nota: Utilizzando cellule durante questi passaggi garantisce la salute delle cellule favorevole che consentirà per la formazione tenuta ottimale e la stabilità patch.
2. Per la trasfezione, le cellule HEK293 in piastra da 35 mm ad una densità di ~ 10 ⁵ cellule / piastra, che corrisponde a ~ 0,5-0,6 ml di sospensione cellulare per ogni piatto e crescere le cellule in 2 ml di mezzo per 18-24 ore.
3. In una sterile 1,5 ml tubo da centrifuga, preparare la miscela di trasfezione per quattro piatti il ​​35 mm per l'aggiunta (in questo ordine): (1) 1 mg di ciascun cDNA (GluN1, GluN2A, e GFP); (2) 315 ml diacqua bidistillata (DDH ₂ O); (3) 350 ml di 42 mM 4 - (2-idrossietil)-1-piperazineethanesulfonic acido (HEPES), e (4) 35 ml di 2,5 M CaCl ₂ goccia a goccia, che viene utilizzato per formare il precipitato.
4. Tubo Vortex per 5 sec e aggiungere 175 ml di sospensione trasfezione in ciascuno dei quattro piatti 35 millimetri piastrate il giorno prima, che ora contiene globuli a 50-60% di confluenza, le cellule e incubare a 37 ° C per 2 h.
5. Aspirare il mezzo off trasfezione, lavare con PBS e sostituire con 2 ml di terreno di coltura addizionato con 2 mM MgCl ₂ per prevenire recettore NMDA mediata eccitotossicità ^9. Nota: Le celle possono essere utilizzati per le registrazioni elettrofisiologiche 24-48 ore dopo la trasfezione.

2. Elettrodo Preparazione

1. Generare due pipette di registrazione simmetriche tirando tubi in vetro borosilicato con un estrattore verticale. In base alle dimensioni e geometria della punta risultante, altre pipette formacon una lucidatrice. Nota: Il formato di punta può essere valutata visivamente ed elettricamente. Visivamente, il diametro esterno dovrebbe essere nel range 1,4-5,6 micron. Elettricamente, una punta massima dimensione, quando riempita con una soluzione extracellulare, dovrebbe produrre resistenze nel range 12-24 mW (vedi Figura 2B).
2. Utilizzare una soluzione di pipetta, che per esperimenti sulle cellule divisoria rappresenta il mezzo extracellulare che produrrà canale attività massima e ampiezze elevate correnti. Nota: per i recettori NMDA, questo corrisponde ad una soluzione contenente saturazione concentrazioni di agonisti (glutammato e glicina), 1 mM EDTA, che chela inibitori bivalenti cationici e bloccanti, ed ha concentrazioni fisiologiche di sodio (150 mm) come unico ione permeante ( in mM: 1 glutammato, glicina 0,1, NaCl 150, KCl 2,5, EDTA 1, e 10 HEPBS, tamponata a pH 8,0 con NaOH 1 N).

3. Cell-allegato patch-clamp registrazione

1. Aperto acquisizione dati QUB Softwari (www.qub.buffalo.edu), e selezionare la finestra di acquisizione sotto 'layout'. Aprire un nuovo file di dati QUB (QDF) cliccando su 'New Data' sotto il menu a tendina intitolato 'File' e inserire i seguenti parametri iniziali: frequenza di campionamento, 40 kHz; A scala D /, 3000; canale di uscita, 1; e la dimensione dei dati A / D, 2. Regolare la scala di ampiezza di 0,1 V / pA facendo clic destro sul file di dati, selezionare Proprietà e fare clic sulla scheda "dati". Nota: Questi parametri possono essere affinate per ogni impostazione utilizzando un modello cellulare in modalità cella-attached. Istruzione supplementare su acquisizione dati con software QUB e le proprietà QDF sono online in www.qub.buffalo.edu.
2. Selezionare un piatto 35 millimetri contenente canale ionico cellule esprimenti e sostituire terreno di coltura con 2 ml di PBS contenente calcio e magnesio; montare il piatto sul palco microscopio e concentrarsi sul campo di cellulare utilizzando la microscopia a contrasto di fase per valutare che le cellule sono sani e ben attaccate al piattoin modo monostrato (Figura 1A). Passare alla rivelazione della fluorescenza per verificare che la trasfezione era successo (Figura 1B). Nota: L'intervallo di intensità di fluorescenza può essere utilizzato come misura grezza di espressione della proteina.
3. Per la registrazione canale singolo, impostare il guadagno dell'amplificatore di uscita per x10, configurazione patch per β = 1, filtro analogico a 10 kHz, la modalità di tensione-clamp e applicata tensione a +100 mV. Con il comando dell'azienda di tensione in posizione OFF, selezionare il pulsante 'prova di tenuta'.
4. Sulla base di fluorescenza e la salute delle cellule, scegliere una cella di patch. Verificare in contrasto di fase che la cella è ben attaccato al piatto, ha una grande porzione della superficie cellulare esposta per la permutazione, e altrimenti sembra sano. Nota: Mantenere l'illuminazione a contrasto di fase per evitare di sbiancamento cella durante l'avvicinamento e patch-bloccaggio.
5. Riempire una pipetta appena lucidato con appena soluzione sufficiente in modo che rende il contatto con il elettrodoe e agitare delicatamente per rimuovere le bolle d'aria intrappolate nella punta. Fissare la pipetta di registrazione sul headstage amplificatore serrando la vite di tenuta del supporto pipetta e fare in modo che il filo di argento viene immerso nella soluzione pipetta.
6. Usando un piccolo (5 cc) siringa di plastica, che è collegato al supporto pipetta dalla tubazione, applicare delicatamente pressione positiva per evitare l'ingresso delle impurità e intasamento della punta durante l'avvicinamento (Figura 2A).
7. Utilizzando il micromanipolatore, dirigere la pipetta nel bagno e posizionare direttamente sopra la cella selezionata per la permutazione (Figura 1C), chiudendo il circuito elettrico. Prendere nota dell'oscilloscopio, che dovrebbe indicare una forma d'onda rettangolare corrispondente al segnale di prova di tenuta dell'amplificatore (Figura 2B). Nota: Al momento dell'entrata in vasca, la resistenza pipetta nel range ottimale è 12-24 mW. Per un segnale di prova 5 mV, il r corrente misurataange corrisponde a ~ 20-40 pA.
8. Durante il monitoraggio posizione pipetta visivamente attraverso la resistenza microscopio e pipetta elettricamente sull'oscilloscopio, continuare l'avvicinamento in piccoli incrementi finché la pipetta incide delicatamente sulla cella, e il segnale di test diminuisce leggermente a indicare una maggiore resistenza (Figura 2B).
9. Per formare un sigillo, prendere la siringa ed applicare una leggera pressione negativa attraverso il tubo laterale tirando lo stantuffo della siringa, che tira la membrana cellulare nella punta della pipetta registrazione e avvia la formazione di un sigillo GΩ resistenza ^10. Prendere nota della forma d'onda del segnale di prova sull'oscilloscopio, in cui la formazione sigillo è indicato dal suo appiattimento completo, con solo transienti capacitivi visibili (Figura 2B). Nota: Se il segnale non appiattire completamente o la linea di base diventa rumoroso, questo indica un sigillo debole con sostanziale perdita di corrente intorno alla tenuta. Questo consentirà di evitare resolving uno correnti canale. Se questo è il caso, ritirare la pipetta dalla cella e lontano dal bagno, rimuoverlo dalla fase testa e scartarla. Ripetere il processo con una pipetta appena lucidato fino ad ottenere un sigillo nella gamma adeguata (≥ 1 GΩ).
10. L'amplificatore, spegnere l'interruttore di comando esterno da 'prova di tenuta' a 'off'; attivare il comando di tensione che tiene a positivo (che è stato fissato in precedenza a 'off'); e aumentare il guadagno per x100. Osservare l'oscilloscopio per l'attività di canale, che, se presente, verrà visualizzata come deviazioni verso l'alto quadrati dalla linea di base precedentemente piatta (Figura 2C).
11. Se l'attività del canale viene visualizzato sul oscilloscopio, acquisire i dati in file digitale aperto in precedenza QUB, premendo il tasto 'play' seguito dal tasto 'record'. Per interrompere l'acquisizione dei dati, premere il pulsante stop in QUB, e salvare il file QDF ad un facile reperimentoposizione grado sul disco rigido del computer selezionando 'Salva dati con nome ...' nel menu a tendina intitolato 'File'.

4. Dati pre-elaborazione e idealizzazione

Nota: Le informazioni importanti possono essere estratte dalle registrazioni di singolo canale da analisi statistiche che assegna ogni punto dati per una classe di conduttanza appropriata (nel caso più semplice, chiuso o aperto). Questo processo è indicato come idealizzazione dati e una breve descrizione di idealizzazione dati con i mezzi k segmentale (SKM) metodo ¹¹ in QUB è descritta di seguito.

1. Aprire il file di dati in QUB, e visualizzare le tracce attuali nell'interfaccia 'Pre' sotto 'layout'. Visualizzare il file registrato non filtrato (rimuovere il filtro digitale) deselezionando la casella 'Fc.'
2. Visivamente la scansione del registro per individuare le irregolarità e artefatti (Figura 4A). Correggere brevi picchi di corrente che occur all'interno della traccia (Figura 4A) selezionando una regione pulita adiacente della stessa classe conduttanza, mettendo in evidenza questa regione, tasto destro del mouse e selezionando 'buffer di cancellazione impostata.' Zoom sul picco fino a singoli punti di campionamento sono visibili, selezionare la regione da sostituire e cancellare evidenziando solo questa regione e quindi fare clic destro 'cancellazione'.
3. Definire la linea di base corrente zero per l'intero record selezionando una porzione iniziale del record in cui la linea di base è stabile, evidenziare, fare clic destro e selezionare 'basale set'. Verificare che la linea guida che appare esattamente rappresenta il livello di base (viola in Figura 4B)
4. Identificare punti nel record in cui la linea di base dati grezzi si discosta visibilmente dalla linea di fondo set. Correggere questo selezionando una piccola sezione della linea di base nella regione deviando destro del mouse e selezionare il comando 'aggiungere un nodo di base'.
5. Identificare le regioni di tegli registrazione contenente eccesso di rumore o artefatti che non possono essere facilmente corretti (Figura 4C). Evidenziare la regione da scartare, fare clic destro e selezionare 'cancella'. Nota: In questo caso sarà persa informazioni cinetica: il record elaborato sarà più breve ei punti che si verificano dopo il punto di giunzione sembrerà essere continuo con la regione pre-rumore.
6. Per idealizzare i record utilizzando l'algoritmo SKM ^11, evidenziare una porzione della traccia contenente sia aperto ed eventi chiusi e inserire l'interfaccia 'Mod' sotto 'Layout'. Nel pannello "modello", evidenziare una parte pulita del tracciato rappresentativo della linea di base in tutto il file, fare clic con il quadrato nero (stato chiuso) e selezionare "afferrare". Fare lo stesso per le aperture dei canali, mettendo in evidenza la conduttanza aperto, fare clic destro sul quadrato rosso nel pannello "modello" e selezionare "afferrare".
7. Eseguire la idealizazione per l'intero record selezionando il pulsante 'File' sotto 'Origine dati.' Fare clic destro sulla scheda 'idealizzare' sotto la sezione 'Modeling' per verificare che i parametri desiderati per l'analisi siano corrette, quindi fare clic su 'Esegui'. Il risultato della idealizzazione, insieme con istogramma ampiezza per l'intero file, viene sovrapposto con i dati per consentire l'ispezione visiva del idealizzazione (Figura 5). Nota: idealizzazione inadeguato può portare alla generazione di "eventi falsi,« in cui QUB rileva aperture dei canali e chiusure che in realtà non si verificano. Entro la risoluzione di registrazione, che è impostato dal filtro analogico dell'amplificatore e la frequenza di campionamento, la risoluzione con cui SKM rileva gli eventi di apertura e chiusura può essere controllata impostando un tempo morto per le analisi. Tempi morti ottimali devono essere selezionati per tentativi ed errori e dipenderà dalla frequenza di campionamento, tuttavia, una buona regola èper selezionare un tempo morto che è 2-3 campioni ^12.
8. Per verificare che l'idealizzazione rappresenta con precisione i dati grezzi, la scansione manualmente la traccia idealizzato. Dopo l'identificazione di errori nella idealizzazione, evidenziare la traccia sopra il falso evento, fare clic destro e selezionare 'Join Idl.' Nota: per ulteriori opzioni e una spiegazione dettagliata dei vari comandi e funzioni in QUB, consultare il QUB Manuale on-line (www.qub.buffalo.edu).

Risultati

Ricombinante NMDA recettori

Recettori NMDA legano e rispondere all'azione concomitante di due co-agonisti: glutammato e glicina. Si assemblano come heterotetramers di due glicina vincolanti subunità GluN1 e vincolante subunità GluN2 due glutammato. Subunità GluN2 sono codificate da quattro geni (AD) e di questi le forme più ampiamente trascritti nel cervello sono GluN2A in adulti e GluN2B negli animali giovani. A causa della diversità dei sottotipi del recettore NMD...

Discussione

Nel campo canale ionico, un area di ricerca è dedicata alla comprensione della sequenza di eventi che conduce al canale meccanismo di apertura o gating del canale. Per la maggior parte dei canali, questo processo è complesso e prevede diversi passaggi cinetici che non possono essere dedotti da un segnale multicanale macroscopico. Al contrario, gli esperimenti possono essere progettati in cui osservando la sequenza di eventi aperti / chiusi in record di singolo canale può produrre informazioni più dettagliate su gati...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chemicals	Sigma	Various
Borosillicate Glass	Sutter	BF-150-86-10
Bright field inverted microscope	Olympus	1x51	Nikon also has similar microscopes
Fluroescent box	X-cite	Series 120
Liquid Light Guide	X-cite	OEX-LG15
Micromanipulator	Sutter Instruments	MP-225
Oscilloscope	Tektronix	TDS1001
Amplifier	Molecular Devices	Axon Axopatch 200B
Table	TMC	63561
NIDAQ card	National Instruments	776844-01
Puller	Narishige	PC-10
Polisher	Narishige	Microforge MF-830
Faraday Cage	TMC	8133306
High Speed Pressure Clamp	ALA Scientific Instruments	ALA HSPC
Pressue/Vaccuum Pump	ALA Scientific Instruments	ALA PV-PUMP	For HSPC-1