Um canal de gravação de patch-clamp anexado-Cell

Resumo

Descrito aqui é um procedimento para a obtenção de longos trechos de gravação atual de um canal iônico com a técnica de patch-clamp anexado à célula. Este método permite observar, em tempo real, o padrão de open-close conformações dos canais que estão na base do sinal biológico. Estes dados informar sobre as propriedades dos canais nas membranas biológicas não perturbadas.

Resumo

Proteínas de canais iônicos são dispositivos universais para comunicação rápida através das membranas biológicas. A assinatura temporal do fluxo iónico geram depende das propriedades intrínsecas de cada proteína de canal, bem como o mecanismo pelo qual é gerada e controlada e representa uma importante área de pesquisa actual. Informações sobre a dinâmica de funcionamento de proteínas de canais iónicos pode ser obtida observando longas extensões de corrente produzidos por uma única molécula. Descrito aqui é um protocolo para a obtenção de ligado de células de patch-clamp gravações actuais um canal para um canal de iões fechado ligando, o receptor de NMDA, expresso de forma heteróloga em células HEK293 ou nativamente em neurónios corticais. Também são fornecidos instruções sobre como adaptar o método para outros canais de íons de interesse, apresentando o exemplo do canal Piezo1 sensível ao mecano. Este método pode fornecer dados sobre as propriedades de condutância do canal ea seqüência temporal de opeconformações n fechados que compõem mecanismo de ativação do canal, ajudando a compreender as suas funções na saúde e na doença.

Introdução

Comunicação rápida através das membranas biológicas depende quase que exclusivamente em proteínas de membrana oligoméricas poros formando, comumente referido como canais. Estas proteínas são muito diferentes em sinais de ativação, mecanismos de propagação e as propriedades de condutância. Proteínas canal cujo poros são seletivos para os íons são classificados como canais iônicos; sua ativação produz correntes iônicas através da membrana, e suas respostas podem ser gravados com alta resolução em tempo real, usando técnicas eletrofisiológicas. Os sinais de ativação abrangem uma ampla gama de insumos químicos e físicos, incluindo gradientes de concentração, forças mecânicas e elétricas, e temperatura; Assim, a classificação mais canais iônicos em ligante fechado, mechanosensitive, tensão fechado, ou tipos sensíveis ao calor. Neste artigo, os protocolos estão descritos para registar a actividade de um canal de um canal fechado ligando, o receptor de NMDA, e um canal mechanosensitive, Piezo1, usando a técnica de patch-clamp.0;

Patch-clamp electrofisiologia é a primeira e mais largamente utilizado o método experimental suficientemente sensível para permitir a observação de moléculas individuais ^{1, 2.} Além dessa sensibilidade apurada, ele expandiu enormemente as preparações biológicas passíveis de registros eletrofisiológicos e também permitiu a observação de canais iônicos em membranas intactas. Em primeiro lugar, porque, tanto de fixação de tensão e corrente de gravação são realizadas com o mesmo eléctrodo, que pode ser utilizado para gravar sinais através de pequenas células ou membranas de remendos. A técnica revelou que canais iônicos não se restringem a membranas excitáveis ​​dos músculos do sapo, electroplaques enguia, ou axônios gigantes de lula ^{3, 4,} mas sim que eles representam luminárias onipresentes de transmembrana mecanismos de sinalização e são intrínsecos a todos os tipos de membranas celulares de uni ou organismos multicelulares, e também às membranas intracelulares. Importaçãoantly, a capacidade de gravar correntes transmembrana, basta anexar uma pipeta de vidro de uma célula intacta desde que a oportunidade sem precedentes para gravar a atividade de canais iônicos em suas membranas ininterrupto nativas. Assim, a célula ligada técnica de patch-clamp, que é descrito neste protocolo, permite monitorar a atividade dos canais iônicos continuamente por dezenas de minutos ou mais em seu ambiente nativo.

Sob flutuações térmicas normais, todas as proteínas, incluindo proteínas de canais iônicos, são submetidos a mudanças estruturais mais de uma escala de tempo largo, com os rearranjos mais rápidas e mais freqüentes representados provavelmente por movimentos de cadeia lateral e muito mais lentas mudanças, menos freqüentes representados pelo reposicionamento de toda domínios ou sub-unidades, ou em alguns casos por modificações pós translacionais ou interações proteína-proteína ^{5, 6.} Observando longos períodos de atividade geradas por uma molécula pode ajudar a compreender a funçãodinâmicas tradicionais de canais de íons nas membranas fisiológicas intactas e fornece informações valiosas sobre o mecanismo operacional da molécula observado.

Em contraste com a crescente compreensão da diversidade de canais iônicos em todo os tipos de células e estágios de desenvolvimento, o conhecimento sobre a composição molecular de canais iônicos em membranas nativas ainda é limitada. Todos os canais iônicos são proteínas multiméricas ea maioria dos canais iônicos nativas montar a partir de vários tipos de subunidades que produzem proteínas da diversidade molecular de largura, que é muitas vezes acompanhada com diversas condutância e gating propriedades. Por esta razão, os canais de iões da composição molecular definida são estudados por expressão em sistemas heterólogos. Em particular, as células HEK293, que são uma linha clonal de células embrionárias de rim humanas imortalizadas ^7, ganhou aceitação generalizada como o sistema preferido para a expressão heteróloga de canais de iões recombinantes. Entre o homemvantagens y que elevaram células HEK293 como o sistema de escolha para canal iônico eletrofisiologia são a facilidade e acessibilidade de cultivo e manutenção de culturas estáveis ​​de longa duração, a sua capacidade de realizar pós-translacional dobrar, processamento e tráfico de proteínas de mamíferos, e em muitos casos , o seu nível baixo ou até mesmo ausência de expressão endógena para o canal de interesse ^{7, 8.} Expressando os canais de iões recombinantes e estudar as suas propriedades funcionais em células HEK293 que continua a ser uma ferramenta valiosa para obter informações sobre as propriedades de estrutura-função de canais iónicos, assim como das propriedades específicas das isoformas dos canais de iões e os seus papéis no tecido nativo. Os protocolos descritos neste artigo pode ser aplicado igualmente bem para os canais de iões recombinantes expressos em células HEK293 e a canais de iões nativos.

Em resumo, a técnica de patch-clamp, através da sua capacidade sem precedentes para resolver sinals de uma molécula permanece, até hoje, o método mais direto para observar o comportamento de moléculas individuais. Em seu modo conectado à célula, gravação de patch-clamp permite longos períodos de observação que, quando feito por uma molécula, pode proporcionar uma visão excepcional sobre o funcionamento de canais iônicos. Abaixo é apresentado um protocolo para a obtenção de alta resolução a partir de gravações atuais celulares manchas anexo contendo uma proteína de canal iônico.

Protocolo

1. Cultura de células e Protein Expression

1. Manter células HEK293 (ATCC número CRL-1573) entre as passagens 22 e 40, que inclui passagens realizadas pela ATCC, em cultura em monocamada em meio DMEM suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS) e 1% de penicilina / estreptomicina a mistura de 5% de CO ₂ e 37 ° C. Entre as experiências, as células de passagem em frascos T25 em 5-20 diluições em um volume final de 10 ml. Nota: A utilização de células durante essas passagens garante a saúde das células favorável que permitirá a formação de selo ideal e estabilidade patch.
2. Para a transfecção, as células HEK293 prato em pratos de 35 mm a uma densidade de ~ 10 ⁵ células / prato, o que corresponde a ~ 0,5-0,6 ml de suspensão de células por prato e crescer células em 2 ml de meio por 18-24 horas.
3. Numa esterilizado de 1,5 mL do tubo de centrífuga, preparar a mistura de transfecção para quatro placas de 35 mm por adição (por esta ordem): (1) 1 ug de cada ADNc (GluN1, GluN2A, e GFP); (2) 315 ul deágua bidestilada (DDH ₂ O); (3) 350 ul de 42 mM de 4 - (2-hidroxietil)-1-piperazinoetanossulfónico ácido (HEPES), e (4) 35 ul de 2,5 M de _CaCl2 gota a gota, a qual é usada para formar o precipitado.
4. Tubo de vórtice durante 5 segundos e adicionar 175 ul de suspensão de transfecção de cada uma das quatro placas 35 milímetros plaqueadas no dia anterior, que agora contêm células de 50-60% de confluência, e incuba-se as células a 37 ° C durante 2 horas.
5. Aspirar fora o meio de transfecção, lavou-se com PBS e substituir com 2 ml de meio de crescimento suplementado com 2 mM de _MgCl2 para impedir o receptor de NMDA excitotoxicidade mediada ^9. Nota: As células podem ser utilizadas para registos electrofisiolicos 24-48 horas após a transfecção.

2. Eléctrodo Preparação

1. Gerar duas pipetas de gravação simétricas puxando tubos de vidro de borosilicato com um puxador vertical. Com base no tamanho e geometria da ponta resultante, mais pipetas formausando um polidor. Nota: O tamanho da ponta pode ser avaliado visualmente e eletricamente. Visualmente, o diâmetro exterior deve estar no intervalo de 1,4-5,6 mM. Electricamente, uma ponta de tamanho ideal, quando preenchidos com a solução extracelular, deve produzir resistências na gama mohms 12-24 (ver Figura 2B).
2. Use uma solução de pipeta, que para experimentos com células anexado representa o meio extracelular que irá produzir a atividade do canal máxima e altas amplitudes atuais. Nota: Para os receptores de NMDA, o que corresponde a uma solução contendo as concentrações saturantes de agonistas (glutamato e glicina), 1 mM de EDTA, que quela os inibidores bivalente catiónicos e bloqueadores, e tem concentrações fisiológicas de sódio (150 mM) como o único ião permeante ( em mM: glutamato 1, 0,1 glicina, NaCl 150, KCl 2,5, EDTA a 1, e 10 HEPBS, tamponada a pH 8,0 com NaOH 1 N).

3. Gravação patch-clamp anexado-Cell

1. Abrir softwa aquisição de dados QUBre (www.qub.buffalo.edu), e selecione a janela de aquisição em 'esquema'. Abra um novo arquivo de dados QUB (QDF), clicando em "New Data" sob o menu drop-down intitulado 'File' e digite os seguintes parâmetros iniciais: taxa de amostragem, 40 kHz; A escamação / D, 3000; canal de saída, 1; e tamanho de dados A / D, 2. Ajuste a escala de amplitude de 0,1 V / Pa, clicando com o botão direito no arquivo de dados, selecionando propriedades e clicando na guia 'dados'. Nota: Estes parâmetros podem ser refinados para cada configuração usando uma célula modelo no modo conectado à célula. Instrução adicional sobre a aquisição de dados com software QUB e propriedades QDF estão online no www.qub.buffalo.edu.
2. Seleccione um prato de 35 mm contendo canais de iões de células que expressam e substituir o meio de crescimento com 2 ml de PBS contendo cálcio e magnésio; montar o prato para o palco microscópio e foco no campo celular por microscopia de contraste de fase para avaliar que as células são saudáveis ​​e bem ligado ao pratoem monocamada de moda (Figura 1A). Mudar para detecção de fluorescência para verificar que a transfecção foi bem sucedida (Figura 1B). Nota: A escala de intensidade de fluorescência pode ser utilizado como uma medida da expressão da proteína em bruto.
3. Para a gravação de um único canal, ajuste o ganho do amplificador de saída para x10, configuração patch para β = 1, filtro analógico de 10 kHz, o modo de tensão-clamp e aplicada tensão para 100 mV. Com o comando de tensão de retenção na posição OFF, selecione o botão "teste de vedação.
4. Com base na fluorescência e saúde celular, escolher uma célula para corrigir. Verifique sob contraste de fase que a célula é bem ligado ao prato, tem uma grande porção da superfície da célula exposta para remendar, e caso contrário, parece saudável. Nota: Manter a iluminação de contraste de fase, para evitar o branqueamento do celular durante a abordagem e patch-fixação.
5. Preencha uma pipeta recém polida com apenas uma solução suficiente para que ele faz contato com a electrode e agitar suavemente para retirar as bolhas de ar que possam estar presas na ponta. Fixe a pipeta de gravação para o headstage amplificador, apertando o parafuso de vedação do titular da pipeta e certificando-se de que o fio de prata está imerso na solução de pipeta.
6. Usando um pequeno (5 cc) de seringa de plástico, o qual está ligado ao suporte da pipeta por tubagem, aplicar suavemente a pressão positiva para prevenir a entrada de impurezas e entupimento da ponta, durante a abordagem (Figura 2A).
7. Usando o micromanipulador, direcionar a pipeta para o banho e posicioná-lo diretamente sobre a célula selecionada para remendar (Figura 1C), fechando o circuito elétrico. Tome nota do osciloscópio, que deve indicar uma forma de onda retangular correspondente ao sinal de teste de vedação do amplificador (Figura 2B). Nota: Após a entrada para o banho, a resistência pipeta dentro da faixa ideal é de 12-24 mohms. Para um sinal de teste de 5 mV, a corrente medida range corresponde a ~ 20-40 pA.
8. Enquanto monitoriza a posição da pipeta visualmente através de um microscópio e pipeta resistência eléctrica no osciloscópio, continuar a abordagem em pequenos incrementos até que a pipeta colide suavemente sobre a célula, e o sinal de teste diminui ligeiramente para indicar o aumento da resistência (Figura 2B).
9. Para formar uma vedação, escolhe-se a seringa e aplicar uma ligeira pressão negativa através do tubo lateral, puxando o êmbolo da seringa, o que puxa a membrana celular para dentro da ponta da pipeta de gravação e inicia a formação de um selo de resistência GÊ ^10. Tome nota da forma de onda do sinal de teste no osciloscópio, em que a formação de selo é indicado por seu achatamento completo, com apenas transitórios capacitivos visíveis (Figura 2B). Nota: Se o sinal não achatar ou completamente a linha de base torna-se barulhento, isso indica um selo fraco com vazamento de corrente substancial em torno do selo. Isso vai evitar que resolving uma correntes de canal. Se este for o caso, retirar a pipeta a partir da célula e para fora do banho, removê-lo a partir da fase de cabeça e descartá-lo. Repita o processo com uma pipeta de recém polida até a obtenção de um selo na faixa adequada (≥ 1 GÊ).
10. No amplificador, mude o comando externo de alternância de 'test selo' para 'off'; mudar o comando de tensão segurando para positivo (que foi previamente definido como 'off'); e aumentar o ganho de x100. Observe o osciloscópio para a atividade do canal, que, se presente, será mostrado como desvios quadrados para cima da linha de base anteriormente plana (Figura 2C).
11. Se a atividade do canal é exibido no osciloscópio, adquirir dados no arquivo digital anteriormente aberto QUB, pressionando o botão 'play', seguido do botão "gravar". Para interromper a aquisição de dados, pressione o botão Parar no QUB, e salve o arquivo com um QDF facilmente retrievlocalização capaz no disco rígido do computador selecionando "Salvar dados como ..." no menu drop-down intitulado 'File'.

4. Dados pré-processamento e Idealização

Nota: Informações importantes podem ser extraídos a partir de gravações de canal único por análises estatísticas, que atribui a cada ponto de dados a uma classe condutância apropriado (no caso mais simples, fechadas ou abertas). Este processo é referido como idealização de dados e uma breve descrição da idealização de dados com os meios de k segmentares (SKM) método ¹¹ em qub se descritos abaixo.

1. Abra o arquivo de dados em QUB, e ver os traços atuais na interface 'pré' em 'esquema'. Mostrar o arquivo gravado não filtrada (remover filtro digital), desmarcando a caixa "Fc.
2. Visualmente a varredura do registro para detectar irregularidades e artefatos (Figura 4A). Breves picos de corrente correto que ocur dentro do traço (Figura 4A), selecionando uma região limpa ao lado da mesma classe condutância, com destaque para a região, clicar botão direito e selecionando "tampão erase definido. ' Zoom sobre o pico até pontos de amostragem individuais são visíveis, selecione a região a ser substituído e apagar destacando apenas nesta região e, em seguida, clique com o botão direito "apagar".
3. Definir a linha de base atual de zero para todo o registro selecionando uma parte inicial do registro, onde a linha de base é estável, destaque, clique com o botão direito e selecione "linha de base definida. Verifique se a diretriz que aparece com precisão representa o nível basal (roxo na Figura 4B)
4. Identificar pontos no registro onde a linha de base de dados brutos desvia visivelmente a partir da linha de base set. Corrija isso selecionando uma pequena seção da linha de base na região desviar, clique com o botão direito e selecione a opção 'adicionar um nó de base "de comando.
5. Identificar regiões de tele gravação contendo excesso de ruído ou artefatos que não pode ser facilmente corrigido (Figura 4C). Destaque a região a ser descartado, clique com o botão direito e selecione "excluir". Nota: Neste caso, a informação cinética será perdido: a Importação será menor e os pontos que ocorrem após o ponto de emenda aparecerá para ser contínuo com a região do pré-ruído.
6. Para idealizar registros usando o algoritmo SKM ^11, destacar uma parte do rastreamento contendo tanto aberta e eventos fechados e entrar na interface de "Mod" em "Layout. ' No painel "modelo", destacar uma parte limpa do traço que é representante da linha de base em todo o arquivo, clique com o botão direito no quadrado preto (estado fechado) e selecione "agarrar". Faça o mesmo para as aberturas de canal, destacando a condutância aberto, clique o botão direito no quadrado vermelho no painel "modelo" e selecione "agarrar".
7. Realize a idealizaçãoção para todo o registro, selecionando o botão "Arquivo" em "fonte de dados". Clique com o botão direito do mouse na guia "idealizar" debaixo da seção 'Modelagem' para verificar se os parâmetros desejados para análise estão corretos e, em seguida, clique em "Executar". O resultado da idealização, juntamente com o histograma de amplitude para o arquivo inteiro, é sobreposto com os dados para permitir a inspeção visual da idealização (Figura 5). Nota: idealização inadequada pode levar à geração de "eventos falsos, 'em que QUB detecta aberturas e fechamentos de canais que realmente não ocorrer. Dentro da resolução de gravação, o qual é definido pelo filtro analógico do amplificador e da taxa de amostragem, a resolução com as quais SKM detecta eventos de abertura e fecho podem ser controlados pela fixação de um tempo morto para as análises. Tempos mortos ideais devem ser selecionados por tentativa e erro e dependerá de taxa de amostragem, no entanto, uma boa regra de ouro épara selecionar um tempo morto que é de 2-3 amostras de ^12.
8. Para verificar se a idealização representa com precisão os dados brutos, procurar manualmente o traço idealizado. Após a identificação de erros na idealização, realce o traço sobre o falso evento, clique direito e selecione "Join Idl. Nota: Para as opções adicionais e uma explicação detalhada de vários comandos e funções em QUB, consulte o manual on-line QUB (www.qub.buffalo.edu).

Resultados

Recombinante receptores NMDA

Receptores NMDA ligar e responder à ação concomitante de dois co-agonistas: glutamato e glicina. Eles montam como heterotetrâmeros de duas subunidades glicina GluN1 e duas subunidades GluN2 ligação do glutamato de ligação. GluN2 subunidades são codificadas por quatro genes (AD) e de estas formas mais amplamente transcritos no cérebro são GluN2A no adulto e GluN2B em animais jovens. Devido à diversidade de subtipos de receptores de NMD...

Discussão

No campo canal iônico, uma importante área de pesquisa é dedicado à compreensão da seqüência de eventos que leva ao canal de abertura ou mecanismo de propagação do canal. Para a maioria dos canais, este processo é complexo e envolve várias etapas cinéticas, que não pode ser deduzida a partir de um sinal multicanal macroscópica. Em contraste, os experimentos podem ser projetados em observar a seqüência de eventos aberto / fechado no registro de canal único pode produzir informações mais detalhadas sobr...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chemicals	Sigma	Various
Borosillicate Glass	Sutter	BF-150-86-10
Bright field inverted microscope	Olympus	1x51	Nikon also has similar microscopes
Fluroescent box	X-cite	Series 120
Liquid Light Guide	X-cite	OEX-LG15
Micromanipulator	Sutter Instruments	MP-225
Oscilloscope	Tektronix	TDS1001
Amplifier	Molecular Devices	Axon Axopatch 200B
Table	TMC	63561
NIDAQ card	National Instruments	776844-01
Puller	Narishige	PC-10
Polisher	Narishige	Microforge MF-830
Faraday Cage	TMC	8133306
High Speed Pressure Clamp	ALA Scientific Instruments	ALA HSPC
Pressue/Vaccuum Pump	ALA Scientific Instruments	ALA PV-PUMP	For HSPC-1