Un canal cellulaire attaché patch-clamp enregistrement

Résumé

Décrit ici est un procédé d'obtention de longues étendues de l'enregistrement en cours d'un canal ionique avec la technique de patch-clamp cellule attachée. Cette méthode permet d'observer, en temps réel, le modèle de conformations ouverture-fermeture de canal qui sous-tendent le signal biologique. Ces données renseignent sur les propriétés du canal dans les membranes biologiques intactes.

Résumé

Protéines de canaux ioniques sont des dispositifs universels de communication rapide à travers les membranes biologiques. La signature temporelle du flux ionique qu'ils génèrent dépend des propriétés intrinsèques de chaque protéine de canal ainsi que le mécanisme par lequel il est généré et contrôlé et représente un domaine important de la recherche actuelle. D'informations sur la dynamique de fonctionnement des protéines de canal ionique peut être obtenue par l'observation de longues étendues de courant produites par une seule molécule. Décrit ici est un protocole permettant d'obtenir un canal de patch-clamp enregistrements actuels attachés cellulaires pour un canal ionique ligand fermée, le récepteur de NMDA, exprimé de manière hétérologue dans des cellules HEK293 ou nativement dans les neurones corticaux. Également des instructions sur la façon d'adapter la méthode à d'autres canaux ioniques d'intérêt en présentant l'exemple du canal PIEZO1 mécano-sensible. Cette méthode peut fournir des données concernant les propriétés de conductance de la chaîne et la séquence temporelle de l'OPEconformations n-fermées qui constituent le mécanisme d'activation de la chaîne, aidant ainsi à comprendre leurs fonctions en matière de santé et de la maladie.

Introduction

Communication rapide à travers les membranes biologiques repose presque exclusivement sur les oligomères pores formant les protéines membranaires, communément appelées canaux. Ces protéines sont très différentes dans les signaux d'activation, les mécanismes de déclenchement et les propriétés de conductance. protéines de la Manche dont les pores sont sélectifs pour les ions sont classés comme des canaux ioniques; leur activation produit des courants ioniques à travers la membrane, et leurs réponses peuvent être enregistrées avec une haute résolution en temps réel en utilisant des techniques électrophysiologiques. Les signaux d'activation couvrent un large éventail de produits chimiques et physiques, y compris des gradients de concentration, les forces mécaniques et électriques, et de la température; ainsi, une classification supplémentaire des canaux ioniques dans ligand fermée, mécano, tension fermée, ou types sensibles à la chaleur. Dans cet article, les protocoles sont décrits pour enregistrer l'activité d'un canal à partir d'un canal de ligand fermée, le récepteur de NMDA, et d'un canal mécanosensible, PIEZO1, en utilisant la technique de patch-clamp.0;

Patch-clamp électrophysiologie est le premier et le plus largement utilisé la méthode expérimentale suffisamment sensible pour permettre l'observation de molécules simples ^{1, 2.} En plus de cette sensibilité exquise, il a considérablement élargi les préparations biologiques qui se prêtent à l'enregistrement électrophysiologique et a également permis l'observation des canaux ioniques dans les membranes intactes. Tout d'abord, parce que les deux serrage de tension et l'enregistrement de courant sont réalisées avec la même électrode, il peut être utilisé pour enregistrer des signaux à travers les petites membranes des cellules ou des patchs. La technique a révélé que les canaux ioniques sont pas limités à membranes excitables des muscles de la grenouille, electroplaques d'anguilles, ou axones géants de calmar ^{3, 4,} mais plutôt qu'ils représentent appareils omniprésents de mécanismes de signalisation transmembranaires et sont intrinsèques à tous les types de membranes cellulaires des uni-ou organismes multicellulaires, et aussi à des membranes intracellulaires. Importerantly, la capacité d'enregistrer des courants transmembranaires en attachant simplement une pipette en verre à une cellule intacte l'occasion sans précédent pour enregistrer l'activité de canaux ioniques dans leurs membranes natives sans perturbation. Ainsi, l'attaché technique de patch-clamp cellule, qui est décrite dans ce protocole, permet le suivi de l'activité des canaux ioniques en continu pendant des dizaines de minutes ou plus dans leur environnement naturel.

Sous fluctuations thermiques normales, toutes les protéines, y compris les protéines de canaux ioniques, subissent des changements structuraux sur une échelle de temps grande, avec les réarrangements les plus rapides et les plus fréquemment représentés le plus probable par les mouvements de la chaîne latérale et beaucoup plus lentes modifications et moins fréquentes représentés par le repositionnement de l'ensemble de des domaines ou des sous-unités, ou dans certains cas par des modifications post-traductionnelles ou des interactions protéine-protéine ^{5, 6.} Observant de longues périodes d'activité générés par une molécule peut aider à comprendre la fonctiondynamique internationales des canaux ioniques dans les membranes intactes physiologiques et fournit des informations précieuses sur le mécanisme de fonctionnement de la molécule observée.

Contrairement à la compréhension croissante de la diversité des canaux ioniques dans des types de cellules et les stades de développement, les connaissances sur la composition moléculaire des canaux ioniques dans les membranes natives est encore limitée. Tous les canaux ioniques sont des protéines multimériques et la majorité des canaux ioniques natifs assembler à partir de plusieurs types de sous-unités produisant des protéines de grande diversité moléculaire, qui est souvent accompagnée par des propriétés de conductance et de déclenchement divers. Pour cette raison, les canaux ioniques de la composition moléculaire définie sont étudiés lors de l'expression dans des systèmes hétérologues. En particulier, les cellules HEK293, qui sont une lignée clonale de cellules embryonnaires de rein humaines immortalisées ^7, acquis une large acceptation en tant que le système préféré pour l'expression hétérologue des canaux ioniques recombinants. Parmi l'hommeavantages y qui a élevé les cellules HEK293 que le système de choix pour les canaux ioniques électrophysiologie sont la facilité et l'accessibilité de la culture et le maintien de cultures à long terme stables, leur capacité à mener à bien pliage post-traductionnelle, la transformation et le trafic de protéines de mammifères, et dans de nombreux cas , leur faible niveau voire l'absence d'expression endogène pour le canal d'intérêt ^{7, 8.} Exprimant canaux ioniques recombinantes et d'étudier leurs propriétés fonctionnelles dans les cellules HEK293 continue d'être une approche intéressante pour obtenir des informations sur les propriétés de structure-fonction des canaux ioniques ainsi que les propriétés spécifiques des isoformes de canaux ioniques et leurs rôles dans le tissu natif. Les protocoles décrits dans cet article peuvent être appliquées aussi bien aux canaux ioniques recombinants exprimés dans des cellules HEK293 et ​​de canaux ioniques natifs.

En résumé, la technique de patch-clamp, grâce à sa capacité sans précédent pour résoudre le signals d'une molécule demeure, à ce jour, la méthode la plus directe pour observer le comportement des molécules simples. Dans son mode cellule attachée, l'enregistrement de patch-clamp permet longues périodes d'observation qui, après l'avoir fait pour une molécule, peuvent fournir des renseignements de qualité exceptionnelle dans le fonctionnement des canaux ioniques. Ci-dessous est présenté un protocole permettant d'obtenir des enregistrements de courant à haute résolution à partir de patchs attachés de cellules contenant une protéine de canal ionique.

Protocole

1. Culture cellulaire et l'expression des protéines

1. Maintenir des cellules HEK293 (numéro ATCC CRL-1573) entre les passages 22 et 40, qui comprend des passages effectués par l'ATCC, en culture monocouche dans du milieu DMEM supplémenté avec 10% de sérum bovin fœtal (FBS) et 1% de pénicilline / mélange streptomycine à 5% de CO ₂ et 37 ° C. Entre expériences, les cellules de passage dans des flacons T25 à 5-20 dilutions dans un volume final de 10 ml. Remarque: En utilisant des cellules au cours de ces passages garantit la santé des cellules favorable qui permettra la formation de joint optimal et stabilité de patch.
2. Pour la transfection, les cellules HEK293 plaque dans des boîtes de 35 mm à une densité d'environ 10 ⁵ cellules / boîte, ce qui correspond à ~ 0,5-0,6 ml de suspension de cellules par boîte et cultiver des cellules dans 2 ml de milieu pendant 18-24 h.
3. Dans 1,5 ml d'un tube de centrifugation stérile, préparer le mélange de transfection pour les quatre boîtes de 35 mm par l'addition (dans cet ordre): (1) 1 pg de chaque ADNc (GluN1, GluN2A, et GFP); (2) 315 ul d'eau bidistillée (ddH ₂ O); (3) 350 ul de 42 mM de 4 - (2-hydroxyéthyl)-1-piperazineethanesulfonic acide (HEPES), et (4) 35 ul de 2,5 M de _CaCl2 goutte à goutte, qui est utilisé pour former le précipité.
4. tube vortex pendant 5 secondes et ajouter 175 ul de suspension transfection dans chacune des quatre boîtes de 35 mm le jour avant plaqué, qui contient maintenant les cellules à 50-60% de confluence, et incuber les cellules à 37 ° C pendant 2 heures.
5. Aspirer le milieu de transfection, les laver avec du PBS et le remplacer par 2 ml de milieu de croissance supplémenté avec 2 mM de _MgCl2 pour empêcher récepteur NMDA excitotoxicité médiée ^9. Remarque: Les cellules peuvent être utilisées pour des enregistrements électrophysiologiques 24-48 heures après transfection.

2. Préparation de l'électrode

1. Générer deux pipettes d'enregistrement symétriques par traction sur des tubes en verre de borosilicate avec une traction verticale. Sur la base de la taille et de la géométrie de la pointe qui en résulte, en outre pipettes de formeen utilisant une polisseuse. Remarque: La taille de la pointe peut être évaluée visuellement et électriquement. Visuellement, le diamètre extérieur devrait être de l'ordre de 1.4 à 5.6 um. Électriquement, une pointe de taille optimale, quand il est rempli avec une solution extracellulaire, devrait produire des résistances dans la gamme de 12-24 MQ (voir figure 2B).
2. Utilisez une solution de la pipette, qui pour des expériences attaché cellulaires représente le milieu extracellulaire qui produira l'activité du canal maximale et des amplitudes de courant élevées. Remarque: Pour les récepteurs de NMDA, ce qui correspond à une solution contenant des concentrations saturantes d'agonistes (glutamate et la glycine), 1 mM EDTA, qui chélate inhibiteurs bivalents cationiques et les bloqueurs, et a des concentrations physiologiques de sodium (150 mM) en tant que seul ion perméant ( en mM: 1 glutamate, glycine 0,1, NaCl 150, KCl 2,5, EDTA 1, et 10 HEPBS, tamponnée à pH 8,0 avec NaOH 1 N).

3. Cell-joint patch-clamp enregistrement

1. Ouvrir acquisition de données QUB logire (www.qub.buffalo.edu), et sélectionner la fenêtre d'acquisition en vertu de "layout". Ouvrez un nouveau fichier de données QUB (FKD) en cliquant sur «Nouvelles données» dans le menu déroulant intitulé "Fichier" et entrez les paramètres initiaux suivants: taux d'échantillonnage, 40 kHz; Une mise à l'échelle de D /, 3000; canal de sortie, 1; et la taille des données A / D, 2. Réglez la mise à l'échelle d'amplitude de 0,1 V / pA par un clic droit sur le fichier de données, la sélection des propriétés, et en cliquant sur l'onglet «Données». Remarque: Ces paramètres peuvent être affinés pour chaque configuration en utilisant un modèle de cellules en mode cellule attachée. Instruction complémentaires sur l'acquisition de données avec le logiciel Qub et propriétés QDF sont en ligne à www.qub.buffalo.edu.
2. Sélectionner une boîte de 35 mm contenant des canaux ioniques et des cellules exprimant remplacer le milieu de croissance avec 2 ml de PBS contenant du calcium et du magnésium; monter le plat sur la platine du microscope et de se concentrer sur le domaine cellulaire utilisant la microscopie à contraste de phase afin d'évaluer que les cellules sont en bonne santé et bien attachés à l'antenneen mode monocouche (figure 1A). Commutateur de détection de fluorescence pour vérifier que la transfection a été un succès (Figure 1B). Remarque: La gamme des intensités de fluorescence peut être utilisée comme une mesure brute de l'expression des protéines.
3. Pour l'enregistrement d'un seul canal, régler le gain de l'amplificateur de sortie à x10, la configuration de patch à β = 1, le filtre analogique à 10 kHz, le mode de voltage-clamp et de tension appliquée à 100 mV. Avec la commande de maintien de la tension dans la position OFF, sélectionnez le bouton «test d'étanchéité.
4. Basé sur la fluorescence et la santé des cellules, sélectionnez une cellule de patcher. Vérifiez sous contraste de phase que la cellule est bien fixé sur le plat, a une grande partie de la surface de la cellule exposée pour patcher, et semble en bonne santé. Remarque: Maintenir éclairage à contraste de phase pour éviter le blanchiment de la cellule lors de l'approche et de patch-clamp.
5. Remplir une pipette fraîchement poli avec juste assez de solution de sorte qu'il entre en contact avec la electrode et le secouer doucement pour éliminer les bulles d'air qui peuvent être piégés dans la pointe. Fixer la pipette d'enregistrement sur la headstage amplificateur en serrant la vis d'étanchéité du support de pipette et faire en sorte que le fil d'argent est plongé dans la solution de la pipette.
6. L'utilisation d'un petit (5 cc) de seringue en matière plastique, qui est reliée au porte-pipette par un tube, appliquer délicatement une pression positive pour empêcher les impuretés de pénétrer et de boucher l'embout lors de l'approche (Figure 2A).
7. Utilisation du micromanipulateur, diriger la pipette dans le bain et la positionner directement sur ​​la cellule sélectionnée pour patcher (figure 1C), la fermeture du circuit électrique. Prenez note de l'oscilloscope, qui devrait indiquer une forme d'onde rectangulaire correspondant à joint le signal test de l'amplificateur (figure 2B). Remarque: Lors de l'entrée dans le bain, la résistance à la pipette dans la plage optimale est 12-24 MQ. Pour un signal de test de 5 mV, le courant mesuré range correspond à ~ 20-40 pA.
8. Tout en contrôlant visuellement la position de la pipette à travers la résistance de microscope et électriquement pipette sur l'oscilloscope, continuer l'approche par petits incréments jusqu'à ce que la pipette empiète légèrement sur ​​la cellule, et le signal de test diminue légèrement pour indiquer une résistance accrue (figure 2B).
9. Pour former un joint d'étanchéité, ramasser la seringue et appliquer une légère pression négative à travers la tubulure latérale en tirant le piston de la seringue, ce qui tire la membrane cellulaire dans la pointe de la pipette d'enregistrement et initie la formation d'un joint de résistance à la GQ ^10. Prenez note de la forme d'onde du signal essai sur l'oscilloscope, dans lequel la formation de joint est indiqué par son aplatissement complet, avec seulement transitoires capacitifs visibles (figure 2B). Remarque: Si le signal ne s'aplatit pas complètement ou la ligne de base devient bruyant, ce qui indique un joint faible avec courant de fuite importante autour du joint. Cela permettra d'éviter resolving une courants des canaux. Si c'est le cas, retirer la pipette de la cellule et à l'écart de la salle de bain, le retirer de la scène de la tête et le jeter. Répétez le processus avec une pipette fraîchement poli jusqu'à l'obtention d'un joint dans la plage adéquate (≥ 1 GQ).
10. Sur l'amplificateur, passer la commande à bascule externe de «test d'étanchéité 'à' off '; passer la commande de maintien de tension positive (qui a été précédemment définie sur 'off'); et augmenter le gain de x100. Observer l'oscilloscope pour l'activité du canal, qui, s'il est présent, sera affiché comme déviations carrés à la hausse de la valeur de référence préalablement plat (figure 2C).
11. Si l'activité du canal est affiché sur l'oscilloscope, l'acquisition de données dans le fichier numérique précédemment ouvert dans QUB, en appuyant sur le bouton 'play' puis sur le bouton 'record'. Pour arrêter l'acquisition de données, appuyez sur le bouton d'arrêt dans QUB, et enregistrer le fichier à un FKD facilement retrievLieu pouvoir sur le disque dur de l'ordinateur en sélectionnant «Enregistrer les données sous ..." dans le menu déroulant intitulé "Fichier".

4. Données prétraitement et idéalisation

Remarque: Informations importantes peut être extrait à partir d'enregistrements de canal unique par des analyses statistiques qui attribue à chaque point de données pour une classe de conductance approprié (dans le cas le plus simple, fermée ou ouverte). Ce processus est appelé idéalisation de données et une brève description de l'idéalisation de données avec les moyens de k segmentaires (SKM) méthode ¹¹ Qub est décrite ci-dessous.

1. Ouvrez le fichier de données dans QUB, et voir les traces de courant dans l'interface 'Pre' sous "layout". Afficher le fichier enregistré non filtré (retirer le filtre numérique) en décochant la case «Fc».
2. Visuellement analyser le dossier de repérer les irrégularités et les artefacts (figure 4A). Brèves pointes de courant corrects qui occur dans la trace (figure 4A) en sélectionnant une région propre à côté de la même classe de conductance, soulignant cette région, un clic droit et en sélectionnant «tampon d'effacement définir. Zoom sur la pointe jusqu'à ce que des points d'échantillonnage individuelles sont visibles, sélectionnez la région à remplacer et effacer en soulignant que cette région, puis cliquez à droite sur «effacement».
3. Définir la ligne de base zéro de courant pour l'ensemble du dossier en sélectionnant une première partie de l'enregistrement où la base est stable, point culminant, faites un clic droit et sélectionnez "Définir la référence. Vérifiez que la ligne directrice qui apparaît précision représente le niveau de base (violet dans la figure 4B)
4. Identifier les points dans le dossier où la base de données brutes s'écarte visiblement de l'ensemble de base. Corriger en sélectionnant une petite section de la ligne de base dans la région de déviation, cliquez-droit et sélectionnez la commande 'ajouter un nœud de base ».
5. Identifier les régions du til enregistrement contenant excès de bruit ou d'artefacts qui ne peuvent être facilement corrigées (figure 4C). Mettez en surbrillance la région à être jetés, faites un clic droit et sélectionnez «supprimer». Remarque: Dans ce cas, l'information cinétique sera perdu: l'enregistrement traité sera plus courte et les points qui se produisent après le point de jonction sera semblent être continue avec la région pré-bruit.
6. Pour idéaliser enregistrements à l'aide de l'algorithme de SKM ^11, surligner une partie de la trace contenant à la fois ouvert et fermé les événements et entrer dans l'interface 'Mod' sous 'Mise en page. Dans le panneau «modèle», sélectionnez une partie propre de la trace qui est représentatif de la ligne de base dans tout le fichier, cliquez droit sur le carré noir (état fermé) et sélectionnez "saisir". Faites de même pour les ouvertures de canaux en mettant en évidence la conductance ouvert, cliquez droit sur le carré rouge dans le panneau "modèle" et sélectionnez "saisir".
7. Effectuer le idéalisationtion pour l'ensemble du dossier en sélectionnant le bouton «Fichier» sous «Data Source». Faites un clic droit sur l'onglet «idéaliser» sous la section «Modélisation» pour vérifier que les paramètres souhaités pour l'analyse sont corrects, puis cliquez sur «Exécuter». Le résultat de l'idéalisation, et aussi d'histogramme d'amplitude pour l'ensemble du dossier, est recouvert avec les données pour permettre une inspection visuelle de l'idéalisation (figure 5). Remarque: idéalisation inadéquate peut entraîner la génération de «faux événements, 'dans lequel QUB détecte les ouvertures et fermetures qui ne sont pas produits réellement canal. De la résolution d'enregistrement, qui est fixé par le filtre analogique de l'amplificateur et de la fréquence d'échantillonnage, la résolution avec laquelle SKM détecte les événements ouverture et de fermeture peut être contrôlée en réglant un temps mort pour les analyses. Temps morts optimales doivent être choisis par essais et erreurs et dépendent de la fréquence d'échantillonnage, cependant, une bonne règle de base estpour sélectionner un temps mort qui est de 2-3 échantillons ^12.
8. Pour vérifier que l'idéalisation représente avec précision les données brutes, rechercher manuellement la trace idéalisée. Lors de l'identification d'erreurs dans l'idéalisation, mettre en évidence la trace sur le faux événement, faites un clic droit et sélectionnez "S'inscrire IDL. ' Remarque: Pour des options supplémentaires et une explication détaillée des diverses commandes et fonctions QUB, consulter le manuel en ligne QUB (www.qub.buffalo.edu).

Résultats

Recombinant récepteurs NMDA

Récepteurs NMDA se lient et de répondre à l'action concomitante des deux co-agonistes: glutamate et la glycine. Ils assemblent comme hétérotétramères de deux sous-unités glycine GluN1 et sous-unités GluN2 liaison deux glutamate de liaison. Sous-unités GluN2 sont codés par quatre gènes (AD) et de ces formes les plus largement transcrites dans le cerveau sont GluN2A chez les adultes et chez les animaux jeunes GluN2B. En raison de la...

Discussion

Dans le domaine de canal ionique, un domaine important de la recherche est consacrée à la compréhension de la séquence d'événements qui conduit à la voie d'ouverture ou le mécanisme de déclenchement de la voie. Pour la plupart des canaux, ce processus est complexe et implique plusieurs étapes cinétiques qui ne peuvent être déduites à partir d'un signal multicanal macroscopique. En revanche, les expériences peuvent être conçus où l'observation de la séquence des événements ouverts / f...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chemicals	Sigma	Various
Borosillicate Glass	Sutter	BF-150-86-10
Bright field inverted microscope	Olympus	1x51	Nikon also has similar microscopes
Fluroescent box	X-cite	Series 120
Liquid Light Guide	X-cite	OEX-LG15
Micromanipulator	Sutter Instruments	MP-225
Oscilloscope	Tektronix	TDS1001
Amplifier	Molecular Devices	Axon Axopatch 200B
Table	TMC	63561
NIDAQ card	National Instruments	776844-01
Puller	Narishige	PC-10
Polisher	Narishige	Microforge MF-830
Faraday Cage	TMC	8133306
High Speed Pressure Clamp	ALA Scientific Instruments	ALA HSPC
Pressue/Vaccuum Pump	ALA Scientific Instruments	ALA PV-PUMP	For HSPC-1