Один канал сотового прилагается патч-зажим записи

Резюме

Описанный здесь является процедура получения длинные отрезки текущей записи с одного ионного канала с техникой патч-зажим клеток-прилагается. Этот метод позволяет наблюдать в режиме реального времени, картина открытия-закрытия конформации каналов, лежащих в основе биологического сигнала. Эти данные сообщают о свойствах канала в ненарушенных биологических мембран.

Аннотация

Ионный канал белки являются универсальными устройствами для быстрой связи через биологические мембраны. Временной подпись ионного потока они создают зависит от свойств, присущих каждому канального белка, а также механизм, с помощью которой он создан и контролируемым и представляет собой важную область текущих исследований. Информация о оперативных динамики белков ионных каналов могут быть получены путем наблюдения протяженных ток, создаваемый одной молекулы. Описанный здесь это протокол для получения клеток-прилагается патч-зажим текущие записи одного канала для лиганд закрытого ионного канала, рецептора NMDA, выразил гетерологично в НЕК293 или изначально в корковых нейронов. Также предложены инструкции о том, чтобы адаптировать метод к другим ионных каналов, представляющих интерес, представляя пример механо-чувствительных канала PIEZO1. Этот метод может предоставить данные о свойствах проводимости телеканала и временной последовательности ОПЕн-закрытые конформации, которые составляют механизм активации канала, тем самым помогая понять свои функции в норме и патологии.

Введение

Быстрая связь через биологические мембраны опирается почти исключительно на олигомерных пор формирования мембранных белков, как правило, называют каналами. Эти белки отличаются друг от друга в сигналах активации, механизмов вентильных и свойства проводимости. Белки канала, поры селективный к ионам классифицируются как ионных каналов; их активация производит ионные токи через мембрану, и их ответы могут быть записаны с высоким разрешением в реальном времени с использованием электрофизиологические методы. Сигналы активации охватывают широкий спектр химических и физических входов, включая градиентов концентрации, механических и электрических сил и температуры; Таким образом, дальнейшее классификации ионные каналы в лиганда закрытый, механочувствительных, напряжение закрытого или чувствительные тепловые типы. В этой статье, протоколы описаны записывать активность одноканальный от лиганда закрытого канала, рецептора NMDA, и механочувствительных канала, PIEZO1, используя технику патч-зажим.0;

Патч-зажим электрофизиологии является первым и наиболее широко используется экспериментальный метод достаточно чувствительным, чтобы разрешить наблюдение одиночных молекул ^{1, 2.} В дополнение к этому изысканным чувствительности, это значительно расширены биологические препараты поддающиеся электрофизиологического записи, а также позволило наблюдение ионных каналов в интактных мембран. Во-первых, потому что оба зажима напряжения и тока записи осуществляются с тем же электродом, он может быть использован для записи сигналов через мелких клеток или мембран исправлений. Техника показала, что ионные каналы не ограничиваются возбудимых мембран мышц лягушки, угорь electroplaques или кальмаров гигантских аксонов ^{3, 4,} а то, что они представляют вездесущие светильники механизмов сигнализации трансмембранных и пронизывают все сотовые типов мембранных одно-или многоклеточные организмы, а также внутриклеточных мембран. Импортantly, возможность записывать трансмембранных токов, просто подключая стеклянную пипетку, чтобы неповрежденной клетке при условии, что беспрецедентную возможность для записи активности от ионных каналов в их родных бесперебойное мембран. Таким образом, прилагается методика патч-зажим клеток, который описан в этом протоколе, позволяет мониторинг деятельности ионных каналов непрерывно в течение десятков минут или дольше в их родной среде.

При нормальных тепловых флуктуаций, все белки, в том числе белков ионных каналов, пройти структурные изменения в широком масштабе времени, с самых быстрых и частых перестроек, представленных скорее всего движениями боковых цепей и многое медленных, менее частым изменениям, представленных репозиционирования всей домены или подразделения, или в некоторых случаях изменения посттрансляционных или белок-белковых взаимодействий ^{5, 6.} Наблюдая длительные периоды активности, генерируемые одной молекулы может помочь понять функные динамика ионных каналов в неповрежденных физиологических мембран и дает ценную информацию о рабочем механизме молекулы наблюдается.

В отличие от растущего понимания многообразия ионных каналов по всему типов клеток и этапов развития, знаний о молекулярном составе ионных каналов в родных мембран по-прежнему ограничен. Все ионные каналы являются мультимерные белки и большинство родных ионных каналов собрать из нескольких типов субъединиц, производящих белки широкого молекулярного разнообразия, которое часто сопровождается различными проводимости и вентильных свойств. По этой причине, ионные каналы, определенного молекулярного состава изучены при экспрессии в гетерологичных системах. В частности, клетки HEK293, которые клональное линия иммортализованных эмбриональных клеток почки человека ^7, получила широкое признание в качестве предпочтительного системы гетерологичной экспрессии рекомбинантных ионных каналов. Среди человекау преимущества, которые повышенные HEK293 клетки как выбор системы для ионных каналов электрофизиологии являются простота и доступность культивирования и поддержания долгоживущие стабильные культуры, их способность выполнять посттрансляционную складной, обработку и торговлю белков млекопитающих, и во многих случаях , их низкий уровень или даже отсутствие эндогенного выражения для выбранного канала ^{7, 8.} Выражая рекомбинантных ионные каналы и изучения их функциональные свойства в НЕК293 продолжает быть ценным подход для получения информации о структурно-функциональных свойств ионных каналов, а также специфических свойств ионных каналов изоформ и их роли в нативной ткани. Протоколы, описанные в этой статье, могут быть применены в равной степени к рекомбинантным ионных каналов, выраженных в НЕК293 и родных ионных каналов.

Таким образом, методика патч-зажим, через его беспрецедентной производительностью, чтобы решить сигналс от одной молекулы остается, на сегодняшний день, наиболее прямой метод наблюдения за поведением отдельных молекул. В режиме по мобильному подключением, запись патч-зажим позволяет длительные периоды наблюдения, которые, когда сделано для одной молекулы, могут обеспечить исключительное понимание в работе ионных каналов. Ниже представлен протокол для получения текущих записей высокого разрешения от сотовых прикрепленных пластырями, содержащими один белок ионного канала.

протокол

1. Культура клеток и Экспрессия белка

1. Поддержание клеток НЕК293 (номер ATCC CRL-1573) между проходами 22 и 40, который включает в проходы, выполненные АТСС, в монослойной культуре в DMEM, дополненной 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS) и 1% пенициллина / стрептомицина смеси при 5% CO ₂ и 37 ° C. Между экспериментов, проход клеток в колбы Т25 5-20 кратных разведений в конечном объеме 10 мл. Примечание: Используя клетки во время этих отрывков гарантирует благоприятный здоровье клеток, которая позволит для оптимального формирования уплотнения и стабильности патч.
2. Для трансфекции клеток НЕК293 пластины в 35 мм чашках при плотности ~ 10 ⁵ клеток / чашку, что соответствует ~ 0,5-0,6 мл клеточной суспензии на чашку и роста клеток в 2 мл среды в течение 18-24 часов.
3. В стерильной 1,5 мл центрифужную пробирку, подготовить трансфекции смесь в течение четырех 35-мм чашки добавлением (в этом порядке): (1) 1 мкг каждого кДНК (GluN1, GluN2A и GFP); (2) 315 мклдважды дистиллированной воды (DDH ₂ O); (3) 350 мкл 42 мМ 4 - (2-гидроксиэтил)-1-пиперазин-кислоты (HEPES) и (4) 35 мкл 2,5 М CaCl ₂ по каплям, который используется для формирования осадка.
4. Вихревой трубы в течение 5 сек и добавить 175 мкл трансфекции суспензии в каждый из четырех 35-мм чашки покрытием накануне, который теперь содержит клетки на 50-60% слияния, и инкубировать клетки при 37 ° С в течение 2 часов.
5. Аспирируйте от трансфекции среду, промывают PBS и заменить 2 мл ростовой среды, дополненной 2 мМ MgCl _2, чтобы предотвратить рецептора NMDA опосредованной эксайтотоксичности ^9. Примечание: клетки могут быть использованы для Электрофизиологические записи 24-48 ч после трансфекции.

2. Электрод Подготовка

1. Создать 2 симметричные пипетки записи, потянув боросиликатного стеклянных трубок с вертикальной съемника. В зависимости от размера и геометрии полученного наконечника пипетки, еще формыиспользуя полировщик. Примечание: размер чаевых может быть оценена визуально и электрически. Визуально, наружный диаметр должен быть в диапазоне 1.4-5.6 мкм. Электрически, оптимальный размер наконечника, при заполнении внеклеточной решение, должны производить сопротивлений в диапазоне 12-24 МОм (см. рисунок 2В).
2. Используйте пипетки решение, которое для сотовых прилагается экспериментов представляющий внеклеточной среде, который будет производить максимальную активность канала и высокие амплитуд тока. Примечание: рецепторы NMDA, это соответствует раствора, содержащего насыщающих концентраций агонистов (глутамат и глицин), 1 мМ ЭДТА, который хелатов ингибиторы двухвалентных катионных и блокаторы и имеет физиологические концентрации натрия (150 мм) в качестве единственного проникающего иона ( в мм: 1 глутамат, 0,1 глицин, 150 NaCl, 2,5 KCl, 1 ЭДТА и 10 HEPBS, буферный при рН 8,0 с 1 N NaOH).

3. Cell-прилагается патч-зажим записи

1. Открыть Softwa сбора данных QUBповторно (www.qub.buffalo.edu), и выбрать окно сбора под "макет". Откройте новый файл данных QUB (QDF) нажмите на ссылку "Новые данные" под выпадающего меню под названием «Файл» и введите следующие исходные параметры: частота дискретизации, 40 кГц; A / D масштабирование, 3000; выходной канал, 1; и размер данных A / D, 2. Отрегулируйте амплитуду масштабирование до 0,1 В / Па щелкнув правой кнопкой мыши файл данных, выбрать свойства, и нажав на вкладку «Данные». Примечание: Эти параметры могут быть уточнены для каждой установки с использованием модели-ячейку в режиме клеток-прилагается. Дополнительная инструкция по регистрации данных с программным обеспечением QUB и свойств QDF-лайн в www.qub.buffalo.edu.
2. Выберите 35 мм чашку, содержащую ионные каналы клеток, экспрессирующих и заменить питательную среду с 2 мл PBS, содержащего кальций и магний; смонтировать блюдо на столике микроскопа и сосредоточиться на клеточном поле с помощью фазового контраста микроскопии для оценки что клетки здоровы и хорошо прикреплен к блюдув монослой моды (рис. 1А). Перейти к регистрации флуоресценции чтобы убедиться, что трансфекции был успешным (рис. 1В). Примечание: диапазон интенсивностей флуоресценции могут быть использованы в виде неочищенного мере экспрессии белка.
3. Для записи одного канала, установить выходной усиления усилителя к x10, настройки патч для β = 1, аналоговый фильтр до 10 кГц, режим фиксации потенциала и приложенное напряжение для 100 мВ. С помощью команды холдинга напряжения в положение ВЫКЛ, нажмите кнопку "тест печать".
4. На основе флуоресценции и здоровья клеток, выбрать ячейку залатать. Убедитесь в фазового контраста, что клетка правильно приложен к блюду, имеет большую часть поверхности клетки подвергаются для ямочного ремонта, а в противном случае выглядит здоровым. Примечание: Поддержание фазового контраста освещения, чтобы избежать отбеливания ячейку при заходе на посадку и патч-зажим.
5. Заполните недавно полированной пипетки с достаточным количеством раствора так что имеет контакт с электроде и слегка встряхнуть, чтобы выбить пузырьки воздуха, которые могут попасть в чаевых. Закрепите записи пипетки на усилитель headstage, затянув уплотнительную винт держателя пипетки и убедившись, что серебряной проволоки погружается в пипетки раствора.
6. С помощью небольшой (5 см) пластиковый шприц, который соединен с держателем пипетки на трубки, осторожно применять положительное давление для предотвращения попадания загрязнений и засорения наконечника при заходе на посадку (рис. 2а).
7. Использование микроманипулятор, направляют пипетку в ванну и позиционировать его непосредственно на ячейку, выбранной для исправления (рис. 1c), закрывая электрической цепи. Принять к сведению осциллографа, который следует указать прямоугольную форму волны, соответствующую усилителя уплотнения тестового сигнала (рис. 2В). Примечание: После вступления в ванне, сопротивление пипетки в оптимальном диапазоне является 12-24 МОм. Для тестового сигнала 5 мВ, измеренный ток гАнж соответствует ~ 20-40 мкА.
8. В процессе мониторинга положения пипетки визуально через микроскоп и пипетки сопротивления электрически на осциллографе, продолжают подход с небольшим шагом, пока пипетка не падает мягко на клетки, и испытательный сигнал немного уменьшается, чтобы указать, повышенное сопротивление (фиг.2В).
9. Чтобы образовать уплотнение, подобрать шприц и применять небольшое отрицательное давление через боковую трубки, потянув поршень шприца, который тянет клеточную мембрану в наконечнике пипетки записи и инициирует образование сопротивления ГОм уплотнением ^10. Принять к сведению от формы сигнала испытательного на осциллографа, в котором формирование уплотнение, указанном его полного выравнивания, только с емкостными переходных видимых (рис. 2В). Примечание: Если сигнал не сгладить полностью или базовый становится шумным, это указывает на слабую печать с существенной утечки тока вокруг уплотнения. Это предотвратит гesolving один канал токи. Если это так, снять пипетку из клетки и от ванны, удалить его со сцены головы и выбросьте его. Повторите процесс с только что отполирован пипетки до получения печать в адекватном диапазоне (≥ 1 ГОм).
10. На усилителя, переключить внешний команда переключения от "уплотнения теста 'до' Off '; переключения команды напряжения держит на положительный (который был установлен ранее в 'Off'); и увеличить коэффициент усиления для x100. Соблюдайте осциллограф для активности канала, который, если он присутствует, будет отображаться в качестве квадратных вверх отклонений от ранее плоской базовой линии (рис. 2С).
11. Если деятельность канала отображается на экране осциллографа, получать данные в ранее открытого цифрового файла в QUB, нажав на кнопку «Play», а затем кнопку «запись». Чтобы остановить сбор данных, нажмите кнопку остановки в QUB, и сохраните файл QDF чтобы легко retrievсостоянии расположение на жестком диске компьютера, выбрав "Сохранить данные как ..." в выпадающем меню под названием 'Файл'.

4. Предварительная обработка данных и Идеализация

Примечание: Важная информация может быть извлечена из отдельных записей канала на статистическом анализе которая присваивает каждому точку данных к соответствующему классу проводимости (в простейшем случае, закрыта или открыта). Этот процесс называют идеализации данных и кратким описанием идеализации данных с сегментным помощью K (SKM) метод ¹¹ в QUB описывается ниже.

1. Откройте файл данных в QUB и просмотра текущих следы в интерфейсе "Pre" в разделе "макет". Дисплей записанный файл нефильтрованное (удалить цифровой фильтр), сняв флажок "Прогноз".
2. Визуально сканировать запись обнаружить неровности и артефакты (рис. 4а). Правильные краткие всплески тока, что OCCUг в след (рис. 4А), выбрав смежную чистом районе того же класса проводимости, выделяя этот регион, щелкнув правой кнопкой мыши и выбрав "набор буфер стирания. ' Нажмите на шип, пока не могут видеть отдельные точки выборки, выберите регион должны быть заменены и стирать, выделив только этот регион, а затем щелкните правой кнопкой мыши "Erase".
3. Определить текущую базовую нулевой для всей записи, выбрав ранний части записи, где стабильность базовой линии, выделите, щелкните правой кнопкой мыши и выберите "установить базовую линию '. Убедитесь, что руководство, которое появляется точно представляет базовый уровень (фиолетовый на фиг.4В)
4. Определить точки в записи, где сырые исходные данные отклоняется заметно от установленного базового уровня. Исправьте это, выбрав небольшой участок базовой линии в пределах отклоняющимся области щелкните правой кнопкой мыши и выберите команду "Добавить базовый узел".
5. Определить регионы тон запись, содержащий избыточный шум или артефакты, которые не могут быть легко исправлением (фиг.4С). Выделите область, котор нужно сбросить, щелкните правой кнопкой мыши и выберите "Удалить". Примечание: В этом случае кинетическая информация будет потеряна: обрабатывается запись будет короче и точки, возникающие после точки сращивания окажется непрерывной области предварительно шума.
6. Чтобы идеализировать записи с помощью алгоритма SKM ^11, выделить часть трассы, содержащей открытых и закрытых мероприятий и войти в интерфейс "Mod 'под' Макет». В «модельной» панели выделите чистую часть трассы, что является представителем базовой всему файлу, щелкните правой кнопкой мыши черный квадрат (закрытое состояние) и выберите пункт "захват". Сделайте то же самое для отверстий каналов, выделив открытую проводимость, щелкните правой кнопкой мыши красный квадрат в «модельной» панели и выберите пункт "захват".
7. Выполните идеализацияТион для всей записи, выбрав кнопку "Файл" в разделе "Источник данных". Щелкните правой кнопкой мыши на вкладке "идеализировать" под раздел "Моделирование", чтобы убедиться, что желаемые параметры для анализа верны, а затем нажмите кнопку "Выполнить". Результатом идеализации, вместе с амплитудой гистограммы для всего файла, накладывается с данными для обеспечения визуального контроля идеализации (рис. 5). Примечание: Неадекватное идеализация может привести к генерации "ложных событий", в котором QUB обнаруживает канала отверстия и запорные устройства, которые фактически не происходят. В резолюции записи, которая устанавливается аналоговый фильтр усилителя и частоты дискретизации, разрешение, с которым СКМ обнаруживает открытые и закрытые события можно управлять, установив мертвое время для анализа. Оптимальные мертвые раз должен быть выбран путем проб и ошибок и будет зависеть от частоты дискретизации, тем не менее, хорошее правило являетсявыбрать мертвое время, которое 2-3 образцы ^12.
8. Чтобы убедиться, что идеализация точно представляет необработанные данные, вручную сканировать идеализированный след. При обнаружении ошибки в идеализации, выделите след по ложному случае щелкните правой кнопкой мыши и выберите "Регистрация IDL. ' Примечание: Для дополнительных опций и подробного объяснения различных команд и функций в QUB, обратитесь QUB Руководство онлайн (www.qub.buffalo.edu).

Результаты

Рекомбинантный NMDA рецепторы

Рецепторы NMDA связать и отвечать сопутствующей действия двух со-агонистов: глутамата и глицина. Они собрать как heterotetramers двойки связывания глицина GluN1 субъединицы и два связывания глутамата GluN2 субъединиц. GluN2 субъединицы кодируются ...

Обсуждение

В области ионных каналов, важной областью исследований посвящена пониманию последовательность событий, которая приводит к каналу открытие или механизм стробирования канала. Для большинства каналов, этот процесс является сложным и включает в себя несколько кинетических шаги, которые...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chemicals	Sigma	Various
Borosillicate Glass	Sutter	BF-150-86-10
Bright field inverted microscope	Olympus	1x51	Nikon also has similar microscopes
Fluroescent box	X-cite	Series 120
Liquid Light Guide	X-cite	OEX-LG15
Micromanipulator	Sutter Instruments	MP-225
Oscilloscope	Tektronix	TDS1001
Amplifier	Molecular Devices	Axon Axopatch 200B
Table	TMC	63561
NIDAQ card	National Instruments	776844-01
Puller	Narishige	PC-10
Polisher	Narishige	Microforge MF-830
Faraday Cage	TMC	8133306
High Speed Pressure Clamp	ALA Scientific Instruments	ALA HSPC
Pressue/Vaccuum Pump	ALA Scientific Instruments	ALA PV-PUMP	For HSPC-1