1 채널의 세포 부착 된 패치 클램프 녹음

요약

여기에 설명하는 세포 부착 된 패치 클램프 기술로 하나의 이온 채널에서 현재 기록의 장기 복역을 얻기위한 절차입니다. 이 방법은 실시간으로 관찰을 허용, 생물학적 신호를 기초 개폐 채널 입체 형태의 패턴. 이 데이터는 그대로 생체막의 채널 특성에 대해 알려 드리겠습니다.

초록

이온 채널 단백질은 생물의 세포막에 걸쳐 빠른 통신을위한 보편적 인 장치입니다. 그들이 생성하는 이온 플럭스의 시간 서명은 각 채널 단백질뿐 아니라 생성하고 제어하는​​ 메커니즘에 대한 고유 특성에 따라 현재 연구의 중요한 영역을 나타냅니다. 이온 채널 단백질의 동역학 연산에 대한 정보는 단일 분자에 의해 생성 된 전류의 긴 뻗기를 관찰함으로써 수득 될 수있다. 리간드 게이트 이온 채널, NMDA 수용체에 대한 하나의 채널 세포 부착 된 패치 클램프 현재 녹음을 얻기위한 프로토콜이 여기에 설명, 대뇌 피질의 신경 세포 HEK293 세포 또는 기본적으로 발현 된. 또한 메카에 민감한 채널 PIEZO1의 예를 제시하여 관심의 다른 이온 채널에 방법을 적용하는 방법에 대한 지침을 제공합니다. 이 방법은 채널의 전도도 특성 및 OPE의 시간적 순서에 관한 데이터를 제공 할 수 있습니다따라서 건강과 질병에서의 기능을 이해하는 데 도움이 채널의 활성화 메커니즘을 구성하는 N-폐쇄 입체 형태.

서문

생체막 걸쳐 패스트 통신은 일반적으로 채널로 지칭 올리고머 기공 형성하는 막 단백질에 거의 전적으로 의존한다. 이 단백질은 활성화 신호 게이팅 메커니즘 및 전도성 속성에서 크게 다르다. 그 구멍 이온에 선택적인 채널 단백질은 이온 채널로 분류됩니다; 그들의 활성화를 막을 가로 질러 이온 전류를 생성하고, 그 응답은 전기 생리 기법을 사용하여 실시간으로 높은 해상도로 기록 될 수있다. 활성화 신호는 농도 기울기, 기계적 및 전기적 힘 및 온도를 포함하여 화학적 및 물리적 입력의 광범위한 어레이에 걸쳐; 따라서, 추가 리간드에 이온 채널을 분류하면, 게이트 mechanosensitive, 전압 게이트, 또는 열에 민감한 타입. 이 글에서, 프로토콜은 패치 클램프 기술을 사용하여, 리간드 게이트 채널, NMDA 수용체 및 mechanosensitive 채널, PIEZO1에서 1 채널 활동을 기록 할 수 있도록 서술되어있다.0;

패치 클램프 전기 생리학 단일 분자 ^{1, 2의} 관찰을 허용하도록 충분히 민감한 첫 번째이자 가장 널리 사용되는 실험 방법이다. 이 절묘한 감도 이외에, 그것은 크게 전기 생리 기록 의무 생물학적 제제를 확장하고 또한 양막에있는 이온 채널의 관찰을 허용했다. 클램핑 전압 및 전류의 기록이 모두 동일 전극으로 수행되기 때문에 먼저, 그것은 작은 세포 또는 세포막 패치 걸쳐 신호를 기록하는데 사용될 수있다. 이 기술은 이온 채널이 개구리의 근육, 장어 electroplaques, 또는 오징어 거대한 축삭 ^{3, 4,} 오히려 그들이 횡단 신호 전달 메커니즘의 유비쿼터스기구를 대표하고 단방향 또는 모든 세포막 유형에 본질적인 것으로의 흥분 막에 제한되지 않는 것으로 나타났다 다세포 생물, 또한 세포 세포막에. 수입antly, 단순히 그대로 셀에 유리 피펫을 부착하여 횡단 전류를 기록 할 수있는 기능은 기본 파쇄되지 않은 세포막에있는 이온 채널에서 활동을 기록 할 수있는 전례없는 기회를 제공했다. 따라서,이 프로토콜에서 설명하는 세포 부착 패치 - 클램프 기술은, 최소한 수십 또는 네이티브 환경 이상 연속 이온 채널의 활성을 모니터링 허용한다.

보통 열 변동에 따라, 이온 채널 단백질을 포함한 모든 단백질은, 사이드 체인의 움직임과 전체의 재배치로 표현 훨씬 느린, 덜 자주 변경에 의한 가능성이 가장 높은 표현하는 가장 빠르고 가장 빈번하게 재 배열로, 다양한 시간 규모에 구조적인 변화를 겪을 도메인이나 서브 유닛, 또는 포스트 번역 상 수정 또는 단백질 - 단백질 상호 작용 ^{(5, 6)에} 의해 일부의 경우. 하나의 분자에 의해 생성 된 활동의 긴 기간을 준수하면 기능을 이해하는 데 도움이 될 수 있습니다tional의 본래 생리 세포막에있는 이온 채널의 역학은 관찰 된 분자의 작동 메커니즘에 대한 중요한 정보를 제공합니다.

세포 유형 및 발달 단계에 걸쳐 이온 채널, 네이티브 세포막 이온 채널의 분자 조성에 대한 지식의 다양성 증가 이해와 대조적으로 여전히 제한된다. 모든 이온 채널은 다중 체 단백질 및 네이티브 이온 채널의 대부분은 종종 다양한 컨덕턴스 및 게이팅 특성이 수반되는 다양한 분자 다양성의 단백질을 생산하는 여러 종류의 서브 유닛에서 조립한다. 이 때문에, 정의 분자 조성물의 이온 채널은 이종 시스템에서 발현에 다룬다. 특히, 불멸의 인간 배아 신장 세포 ^(7)의 클론 라인입니다 HEK293 세포는 재조합 이온 채널의 이종 식에 대한 선호 시스템으로 광범위한 수용을 얻었다. 남자 중이온 채널 전기 생리학에 대한 선택 시스템으로 HEK293 세포를 상승 Y 장점은 간편하고 배양 능력이며, 수명이 긴 안정 문화를 유지, 번역 후 폴딩, 가공, 포유 동물 단백질의 거래를 수행 할 수있는 능력, 그리고 많은 경우에 그들의 낮은 수준 또는 그 ^{7, 8} 채널의 내인성 표현의도 부재. 재조합 이온 채널을 표현하고 HEK293 세포에서의 기능적 특성을 연구하는 구조 기능의 이온 채널의 특성뿐만 아니라 이온 채널 이소 및 기본 조직에서 자신의 역할의 특정 속성에 대한 정보를 얻을 수있는 유용한 방법이 될 것을 계속한다. 이 문서에서 설명하는 프로토콜은 HEK293 세포에서 발현 된 재조합 이온 채널 및 네이티브 이온 채널에 동일하게 잘 적용될 수있다.

요약하면, 전례없는 능력을 통해 패치 클램프 기술은 신호를 해결하기 위해한 분자에서의 날짜에, 단일 분자의 거동을 관찰하기위한 가장 직접적인 방법 남아있다. 그 셀에 연결된 모드에서 패치 클램프 기록을 한 분자에 대해 수행 될 때, 이온 채널의 동작에 뛰어난 통찰력을 제공 할 수있는, 긴 관측주기를 허용한다. 아래는 하나의 이온 채널 단백질을 함유하는 세포 부착 패치로부터 고해상도 현재 녹화를 얻기위한 프로토콜을 제시한다.

프로토콜

1. 세포 배양 및 단백질 발현

1. HEK293 세포를 10 % 태아 소 혈청 (FBS)이 보충 된 DMEM에서 단층 배양에서, ATCC에 의해 수행 통로를 포함 통로 (22)와 (40) 사이 (ATCC 번호 CRL-1573) 및 5 % CO _2에서 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신 혼합물을 유지 37 ° C. 실험 사이에, 10 ㎖의 최종 부피의 5 ~ 20 배 희석에서 T25 플라스크에 통과 세포. 참고 :이 구절 동안 세포를 사용하여 최적의 인감 형성 및 패치 안정성을 위해 수 유리한 세포의 건강을 보장합니다.
2. 형질의 경우, 접시 당 세포 현탁액에 ~ 0.5 ~ 0.6 ㎖에 해당 ~ 10 ⁵ 세포 / 요리의 밀도, 직경 35 ㎜ 요리 HEK293 세포를 플레이트와 18 ~ 24 시간 동안 2 ㎖ 배지에서 세포를 성장.
3. 멸균 된 1.5 ㎖의 원심 분리 관에서, (이 순서대로)를 추가하여 네 개의 35mm 요리의 형질 전환 혼합물을 제조 : 각각의 cDNA (GluN1, GluN2A 및 GFP)의 (1) 1 μg을; (2) 315 μL의증류수 (DDH ₂ O); (2 - 히드 록시 에틸) -1 - 피페 라진 에탄 술폰산 (HEPES), 침전물을 형성하기 위해 사용된다 현명한 2.5 M _염화칼슘 드롭, (4) 35 μL - (3) 350 42 mM의 4 μL.
4. 소용돌이 5 초 동안 튜브 4 개의 35mm 요리의 각 형질 현탁액 175 μl를 추가 현재 50 ~ 60 %의 합류에 세포를 포함하고 2 시간 동안 37 ° C에서 세포를 품어 전날, 도금했다.
5. 형질 매체 대기음은 PBS로 세척 및 NMDA 수용체가 흥분 독성 ⁹ 매개 방지하기 위해 2 mM의 _MgCl2를 보충 성장 배지 2 ㎖로 대체합니다. 주 : 세포는 전기 생리 레코딩 24-48 시간 포스트 형질 감염을 위해 사용될 수있다.

2. 전극의 제조

1. 수직 풀러와 붕규산 유리 튜브를 잡아 당겨 2 대칭 기록 피펫을 생성합니다. 얻어진 팁의 크기와 형상, 상기 형상 피펫에 근거폴리 셔를 사용하여. 참고 : 팁 크기 외형과 전기적으로 평가 될 수있다. 시각적 외경 1.4-5.6 μm의 범위에 있어야한다. 전기, 최적의 크기 팁, 세포 외 용액으로 가득 할 때, (그림 2B 참조) 12 ~ 24 MΩ 범위에서 저항을 생산한다.
2. 세포 부착 실험을 위해 최대 채널 활동과 높은 전류 진폭을 생성합니다 세포 외 환경을 나타내는 피펫 솔루션을 사용합니다. 참고 : NMDA 수용체의 경우, 이는 효능 (글루타민산, 글리신), 가의 양이온 억제제 및 차단제를 킬레이트 1 mM의 EDTA의 포화 농도를 함유하는 용액에 대응하고, 구두창 투과 이온 (나트륨의 생리적 농도 (150 mm)를 가지고 mm 단위 : 1 글루타민산, 글리신 0.1, 150의 NaCl, 2.5 KCl을, 1 N NaOH로 pH를 8.0에서 버퍼 1 EDTA, 10 HEPBS).

3. 세포 부착 된 패치 클램프 녹음

1. 오픈 QUB 데이터 취득 softwa 사용(www.qub.buffalo.edu)을 다시, 그리고 '레이아웃'에서 획득 창을 선택합니다. 라는 제목의 드롭 다운 메뉴에서 '파일'에서 '새 데이터'를 클릭하여 새 QUB 데이터 파일 (QDF)를 열고 다음과 같은 초기 매개 변수 입력 : 샘플링 속도, 40 kHz의를; A / D 스케일링, 3000; 출력 채널, 1; 및 A / D 데이터 크기, 2., 데이터 파일을 마우스 오른쪽 단추로 클릭하고 속성을 선택하고 '데이터'탭을 클릭하여 0.1 V / 펜실바니아에 진폭 배율을 조정합니다. 참고 : 이러한 매개 변수는 세포 부착 된 모드에서 모델 셀을 사용하여 각 설정에 정제 할 수있다. QUB 소프트웨어와 QDF 특성을 가진 데이터 수집에 대한 추가 명령은 www.qub.buffalo.edu에서 온라인입니다.
2. 발현 세포 이온 채널을 함유 35mm 접시를 선택하고, 칼슘 및 마그네슘을 함유하는 2 ㎖의 PBS와 함께 성장 배지를 교체; 현미경 무대에 접시를 탑재하고 세포가 건강하고 잘 접시에 부착 된 것을 평가하기 위해 위상차 현미경을 사용하여 세포 분야에 초점을단일 층 패션 (그림 1A)에서. 형질 전환 (그림 1B) 성공했는지 확인하기 위해 형광 검출로 전환합니다. 참고 : 형광 농도의 범위가 단백질 발현의 조질 척도로서 사용될 수있다.
3. 단일 채널 녹음의 경우, 10 배에 앰프의 출력 게인 = 1 β에 패치 구성, 10 kHz의 아날로그 필터,-클램프 전압 모드를 설정 +100 MV에 전압을인가. OFF 위치에서의 전압 유지 명령으로, '씰 테스트'버튼을 선택합니다.
4. 형광 및 셀 상태에 기초하여, 패치 할 셀을 선택한다. 셀이 아니라 접시에 부착되는 위상차에 따라 검증, 패치 노출 세포 표면의 넓은 부분을 가지고 있으며, 그렇지 않으면 건강한 보인다. 참고 : 접근과 패치 클램핑 동안 셀을 표백 피하기 위해 위상 콘트라스트 조명을 유지한다.
5. 그것은 electrod에 닿을 수 있도록 충분히 솔루션을 갓 광택 피펫을 기입전자 가볍게 흔들어 팁에 갇혀 될 수 있습니다 공기 방울을 제거 할 수 있습니다. 피펫 홀더의 밀봉 나사를 체결하고 실버 와이어는 피펫 용액에 침지되어 있는지 확인하여 증폭기 headstage에 기록 피펫을 고정합니다.
6. 튜브로 피펫 홀더에 연결되는 작은 (5 CC) 플라스틱 주사기를 사용하여 부드럽게 (도 2A)를 입력하고 접근하는 동안 팁 막힘 불순물을 방지하기 위해 양압을 적용한다.
7. 미세 조작기를 사용하여 욕조에 피펫을 지시하고 전기 회로를 폐쇄 (그림 1C)을 패치에 대해 선택한 셀 위에 직접 위치. 앰프의 인감 테스트 신호 (그림 2B)에 해당하는 구형 파형을 표시해야하는 오실로스코프에주의하십시오. 참고 : 화장실에 진입하면, 최적의 범위 내에서 피펫 저항이 12 ~ 24 MΩ입니다. 5 MV 시험 신호에 대한, 측정 된 전류 R앤지는 ~ ~ 40 펜실바니아에 해당합니다.
8. 오실로스코프에 전기적으로 현미경 피펫 저항을 통해 시각적으로 피펫의 위치를 모니터링하면서, 피펫 세포에 부드럽게 충돌 할 때까지 조금씩 접근을 계속하고, 테스트 신호는 저항 증가 (그림 2B)를 나타 내기 위해 약간 감소한다.
9. , 시일을 형성 주사기를 들고 녹음 피펫의 끝으로 세포막을 구해 GΩ 저항 시일 ^(10)의 형성을 시작하는 주사기 플런저를 잡아 당겨 측면 튜브를 통해 약간의 부정적인 압력을 적용합니다. 씰 형성이 볼 만 용량 과도 (그림 2B)로, 그 완벽한 평탄화로 표시되는 오실로스코프에 테스트 신호의 파형에주의하십시오. 참고 : 신호가 완전히 평평하지 않거나 기준에 잡음이되면,이 물개의 주위에 상당한 누설 전류와 약실을 나타냅니다. 이것은 R을 방지 할하나의 채널 전류를 esolving. 이 경우, 셀로부터 피펫을 철회 멀리 조로부터, 헤드 단계에서 분리 해 버린다. 적절한 범위 (≥ 1 GΩ)에 씰을 획득 할 때까지 새로 연마 피펫 과정을 반복합니다.
10. 앰프에서 '해제'에서 '도장 시험'에서 외부 명령 토글 스위치; ( '오프'로 이전에 설정 한) 양에 전압 유지 명령을 전환; 과 X100에 이득을 증가시킨다. 존재하는 경우, 이전에 평면 기준 (그림 2C) 광장에서 위쪽으로 편향으로 표시됩니다, 채널 활동에 대한 오실로스코프를 관찰합니다.
11. 채널 활동이 오실로스코프에 표시되는 경우, '기록'버튼 뒤에 '플레이'버튼을 누르면, QUB에서 이전에 열린 디지털 파일로 데이터를 획득. 데이터 수집을 중단 QUB에서 정지 버튼을 눌러 쉽게 retriev을 QDF 파일을 저장하려면'파일'라는 제목의 드롭 다운 메뉴에서 '저장 데이터로를 ...'을 선택하여 컴퓨터 하드 드라이브의 수 없습니다.

4. 데이터 전처리 및 이상화

참고 : 중요 정보는 (가장 간단한 경우에, 폐쇄 또는 개방) 적절한 컨덕턴스 클래스에 각각의 데이터 포인트를 할당 통계 분석에 의해 단일 ​​채널 녹음으로부터 추출 될 수있다. 이 프로세스는 데이터 이상화 및 분절 K 수단 (SKM) QUB있는 방법 ^(11)이 아래에 설명되어있는 데이터 이상화의 간단한 설명으로 언급된다.

1. QUB의 데이터 파일을 열고, '레이아웃'에서 '사전'인터페이스에서 현재의 흔적을 볼 수 있습니다. 표시된 상자를 취소하여 (디지털 필터를 제거) 여과되지 않은 녹음 파일을 표시 '구단을.'
2. 시각적으로 부정과 유물 (그림 4A)를 탐지하는 레코드를 검색합니다. 올바른 간단한 전류 스파이크 그 occuR 추적 내에서, 같은 전도성 클래스의 인접한 청정 지역을 선택이 지역을 강조, 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 선택하여 (그림 4A) '설정 지우기 버퍼를.' 각각의 샘플 포인트가 표시 될 때까지 스파이크 확대, 대체 할 수있는 지역을 선택 만이 지역을 강조하고 '삭제'를 마우스 오른쪽 단추로 클릭하여 삭제합니다.
3. 베이스 라인이 안정 레코드의 초기 부분을 선택하여 전체 레코드의 제로 전류 기준을 정의, 하이라이트, 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 '설정 기준'을 선택합니다. 정확하게 표시 가이드 라인 (그림 4B 보라색)의 기준 레벨을 나타내는 확인
4. 원시 데이터의베이스 라인 설정 기준에서 눈에 띄게 벗어나는 레코드 점을 확인합니다. 일탈 영역 내에서 기준의 작은 부분을 선택하여이 문제를 해결, 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 '기본 노드를 추가'명령을 선택합니다.
5. T의 영역을 식별그는 쉽게 (그림 4C) 해결할 수없는 과도한 소음이나 유물을 포함 녹음. 폐기 할 지역을 선택하고 마우스 오른쪽 버튼을 클릭하고 '삭제.' 참고 :이 경우 운동 정보가 손실됩니다 처리 된 기록이 단축되며 스플 라이스 시점 이후에 발생하는 지점은 프리 - 노이즈 영역과 연속으로 나타납니다.
6. SKM 알고리즘 ^(11)를 이용하여 기록을 이상화하는 오픈 이벤트를 폐쇄 모두 포함하는 추적의 일부를 선택하고 아래의 'MOD'인터페이스 '을 입력 레이아웃.' "모델"패널에서 검은 사각형 (닫은 상태)를 마우스 오른쪽 단추로 클릭하고 "잡아"를 선택, 파일 전체 기준의 대표적인 트레이스의 깨끗한 부분을 강조 표시합니다. 열린 전도를 강조 표시하여 채널의 오프닝을 위해 동일을 할, 바로 "모델"패널에서 빨간색 사각형을 클릭하고 "잡아"를 선택합니다.
7. idealiza를 수행아래의 '파일'버튼을 선택하여 전체 레코드에 대한 기 '데이터 원본.' 분석을 위해 원하는 매개 변수가 올바른지 확인하고 다음을 클릭합니다 '모델링'섹션 아래의 '이상화'탭을 마우스 오른쪽 단추로 클릭하고 '실행.' 이상화의 결과는, 전체 파일의 진폭 히스토그램과 함께 이상화의 육안 검사 (도 5)을 허용하는 데이터와 중첩된다. 주 : 부적절한 이상화는 QUB 채널의 오프닝 실제로 발생하지 않는 폐쇄를 감지하는 '거짓 사건'의 생성으로 이어질 수 있습니다. 증폭기의 아날로그 필터 및 샘플링 레이트에 의해 설정되어, 기록 해상도, 내 SKM 열고 닫히는 이벤트가 검출되는 해상도는 분석을위한 데드 타임을 설정하여 제어 할 수있다. 최적의 데드 타임이 시행 착오를 선택해야합니다 및 샘플링 속도에 따라 달라집니다,하지만, 엄지 손가락의 좋은 규칙은2-3 샘플 ¹² 데드 타임 (dead time)을 선택합니다.
8. 이상화 정확하게 원시 데이터를 나타낸다는 것을 확인하려면, 수동으로 이상화 추적을 검사합니다. 이상화의 오류를 식별하면, 거짓 이벤트를 통해 추적을 선택, 마우스 오른쪽 버튼을 클릭하고 'IDL에 가입하세요.' 주 : 추가 옵션 및 QUB있는 다양한 명령 및 기능에 대한 자세한 설명은, QUB 설명서 온라인 (www.qub.buffalo.edu)를 참조하십시오.

결과

재조합 NMDA 수용체

NMDA 수용체 결합과 두 개의 공동 작용제의 수반하는 작업에 응답 글루타민산과 글리신. 그들은 GluN1 서브 유닛과 GluN2 서브 유닛을 바인딩 두 글루타민산 바인딩 두 글리신 heterotetramers로 조립합니다. GluN2 서브 유닛은 뇌에서 가장 널리 전사 형태의 청소년 동물 성인 GluN2B에 GluN2A 4 개의 유전자 (AD)에 의해 이들의 인코딩된다. 때문에 (도 1a)...

토론

이온 채널 필드에 연구의 중요한 영역을 열거 나 채널의 게이트 메커니즘을 채널로 연결 이벤트의 순서를 이해하기 위해 최선을 다하고 있습니다. 대부분 채널의 경우,이 프로세스는 복잡하고, 거시적 멀티 채널 신호로부터 도출 될 수없는 여러 운동 단계를 포함한다. 대조적으로, 실험은 단일 채널 레코드의 개방 / 폐쇄 이벤트의 시퀀스를 관찰하는 게이팅 메커니즘에 대한 더 상세한 정보를 생?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chemicals	Sigma	Various
Borosillicate Glass	Sutter	BF-150-86-10
Bright field inverted microscope	Olympus	1x51	Nikon also has similar microscopes
Fluroescent box	X-cite	Series 120
Liquid Light Guide	X-cite	OEX-LG15
Micromanipulator	Sutter Instruments	MP-225
Oscilloscope	Tektronix	TDS1001
Amplifier	Molecular Devices	Axon Axopatch 200B
Table	TMC	63561
NIDAQ card	National Instruments	776844-01
Puller	Narishige	PC-10
Polisher	Narishige	Microforge MF-830
Faraday Cage	TMC	8133306
High Speed Pressure Clamp	ALA Scientific Instruments	ALA HSPC
Pressue/Vaccuum Pump	ALA Scientific Instruments	ALA PV-PUMP	For HSPC-1