Tek kanallı bir hücre-bağlı Patch-clamp kayıt

Özet

Burada tarif edilen hücre-bağlı patch-clamp tekniği ile, bir iyon kanalının güncel kayıt uzun uzanır elde edilmesi için bir işlemdir. Bu yöntem, gerçek zamanlı olarak, gözlemlemek için izin veren, biyolojik sinyali altında yer open-close kanal konformasyonlarının desen. Bu veriler rahatsız biyolojik membranların kanal özellikleri hakkında bilgilendirmek.

Özet

Iyon kanal proteinleri biyolojik zarların üzerinden hızlı iletişim için evrensel cihazlardır. Ürettikleri iyonik akının zamansal imzası her kanal proteini bunun yanı sıra oluşturulur ve kontrol edildiği mekanizma içsel özelliklerine bağlıdır ve güncel araştırma önemli bir alanını temsil eder. Iyon kanalı proteinlerin işlevsel dinamikleri ile ilgili bilgiler, tek bir molekül tarafından üretilen akımın uzun uzanır gözlemleyerek elde edilebilir. Ligand kapılı iyon kanalı, NMDA reseptörü için bir kanalı, hücre bağlı patch-clamp kayıtları akım elde etmek için bir protokol, aşağıda tarif edilmiştir, kortikal nöronlarda HEK293 hücrelerinde doğal olarak ya da heterolog bir şekilde eksprese. Ayrıca mekano duyarlı kanal PIEZO1 örneğini sunarak ilgi diğer iyon kanallarına yöntemi nasıl adapte talimatları vardır sağladı. Bu yöntem, kanal iletkenlik özellikleri ve ope zamansal dizisi ile ilgili verileri sağlayabilirBöylece sağlık ve hastalık onların işlevlerini anlamak için yardımcı kanalın aktivasyon mekanizmasını oluşturan n-kapalı konformasyonlar.

Giriş

Biyolojik zarları arasında hızlı iletişim kanalları yaygın olarak adlandırılan oligomerik gözenek oluşturma membran proteinleri, neredeyse sadece dayanır. Bu proteinler aktivasyon sinyalleri, yolluk mekanizmaları ve iletkenlik özellikleri çok farklıdır. Gözenekleri iyonları seçici kanal proteinleri, iyon kanalları olarak sınıflandırılır; onların aktivasyon zarından iyonik akımları üretir ve bunların yanıtları elektrofizyolojik teknikler kullanarak gerçek zamanlı olarak yüksek çözünürlük ile kaydedilebilir. Aktivasyon sinyalleri konsantrasyon dereceleri, mekanik ve elektrik kuvvetleri, ve sıcaklık gibi kimyasal ve fiziksel girdilerin geniş bir dizi kapsar; Böylece, başka bir bağ içine iyon kanallarını sınıflandırmak, kapı mechanosensitive, voltaj kapılı veya ısıya duyarlı türleri. Bu makalede, protokoller patch-clamp tekniği kullanılarak, bir ligand kapılı kanal, NMDA reseptörü ve bir mechanosensitive kanal PIEZO1 gelen tek kanal aktivitesini kaydetmek için tarif edilmiştir.0;

Patch-clamp elektrofizyoloji tek moleküllerin ^{1, 2} gözlem izin vermek için yeterince hassas ilk ve en yaygın olarak kullanılan bir deney yöntemidir. Bu zarif hassasiyete ek olarak, bu çok elektrofizyolojik kayıt için uygun biyolojik hazırlıkları genişletilmiş ve aynı zamanda sağlam zarlarında iyon kanallarının gözlem izin verdi. Gerilim ve akım sıkıştırma kaydı hem de aynı elektrot ile gerçekleştirilir, çünkü İlk olarak, bu küçük hücreler ya da zarlar üzerinde yamalar sinyalleri kaydetmek için kullanılabilir. Teknik iyon kanalları kurbağa kasları, yılan balığı electroplaques veya kalamar dev akson ^{3, 4,} ancak bunun yerine transmembran sinyal mekanizmalarının her yerde demirbaş temsil eden ve tek veya her hücresel membran türlerine özgü olan bunun heyecanlı zarlarına sınırlı olmadığını ortaya koydu çok hücreli organizmalar ve aynı zamanda hücre içi zarlarına. Ithalatantly, sadece sağlam bir hücreye bir cam pipet takarak zar akımları kaydetmek için yeteneği kendi ana undisrupted zarlarında iyon kanalları aktivite kayıt için benzersiz bir fırsat sağladı. Böylece, bu protokol açıklanan hücre bağlı patch-clamp tekniği, on dakika ya da doğal bir ortamda uzun bir süre sürekli olarak iyon kanallarının etkinliği izleme izin verir.

Normal termal dalgalanmalardan altında, iyon kanal proteinleri dahil tüm proteinler, yan zincir hareketleri ve bütünün yeniden konumlandırılması tarafından temsil çok daha yavaş, daha az sık değişikliklerden büyük olasılıkla temsil hızlı ve en sık düzenlenmeleri ile, geniş bir zaman ölçeğinde yapısal değişikliklere etki veya alt birimleri veya translasyon sonrası modifikasyon veya protein-protein etkileşimleri ^{5, 6,} bazı durumlarda. Bir molekül tarafından oluşturulan faaliyet uzun süre gözlemleyerek fonk anlamak için yardımcı olabilirtional sağlam fizyolojik zarlarında iyon kanalları dinamikleri ve gözlenen molekülün işletme mekanizması hakkında değerli bilgiler sağlar.

Hücre tipleri ve gelişim aşamaları boyunca iyon kanalları, doğal membran iyon kanallarının moleküler bileşimi hakkında bilgi çeşitliliğinin artan anlaşılması aksine hala sınırlıdır. Tüm iyon kanalları multimerik proteinleri ve doğal iyon kanallarının çoğunluğu genellikle çeşitli iletkenlik ve perdeleme özellikleri ile birlikte olan, geniş moleküler çeşitlilik, proteinleri üretme alt birimlerinin çeşitli türlerinden monte edin. Bu nedenle, tanımlanan terkibin moleküler iyon kanalları heterolog sistemlerde tanımlanması üzerine çalışılmıştır. Özellikle, ölümsüzleştirilmiş insan embriyonik böbrek hücreleri ⁷ klonal çizgi HEK293 hücreleri, yeniden birleştirici iyon kanallarının heterolog ekspresyonu için tercih edilen bir sistem olarak yaygın bir kabul gördü. Adam arasındaiyon kanal elektrofizyoloji için seçim sistemi olarak HEK293 hücreleri yükselmiş y avantajları kolaylığı ve Kültüre uygun fiyatta ve uzun ömürlü istikrarlı kültürlerini koruyarak, post-translasyon katlama, işleme ve memeli proteinlerinin ticaretini yürütmek için kendi yetenek ve birçok durumda , düşük düzeyde veya ilgi duyulan ^{7, 8,} kanalın endojen ekspresyonunun da olmaması. Rekombinant ifade iyon kanallarını ve HEK293 hücrelerinde fonksiyonel özelliklerini inceleyerek yapı-işlev iyon kanalları özellikleri yanı sıra, bir iyon kanalı izoformları ve doğal doku içinde rolleri spesifik özellikleri hakkında bilgi elde etmek için bir değerli bir yaklaşım olmaya devam etmektedir. Bu makalede açıklanan protokoller HEK293 hücrelerinde eksprese edilen rekombinant iyon kanalları ve yerel iyon kanalları için eşit ölçüde iyi uygulanabilir.

Özetle, onun eşi görülmemiş kapasitesi ile yama kelepçe tekniği, sinyal çözmek içinbir molekülden s, bugüne kadar, tek moleküllerin davranışını gözlemlemek için en doğrudan yöntem olmaya devam etmektedir. Kendi hücre-bağlı modunda, patch-clamp kayıt bir molekül için tamamlandığı zaman, iyon kanallarının devreye olağanüstü bilgi sağlar, uzun gözlem süreleri sağlar. Aşağıda, bir iyon kanalı protein ihtiva eden hücre bağlı yamalar yüksek çözünürlüklü akım kayıtları elde etmek için bir protokol sunulmuştur.

Protokol

1.. Hücre Kültürü ve Protein Expression

1. HEK293 hücreleri,% 10 Fetal Sığır Serumu (FBS) ile takviye edilmiş DMEM içinde tek tabakalı kültürü, ATCC tarafından gerçekleştirilen parçaları içerir geçitleri 22 ve 40 arasında (ATCC numarası CRL-1573) ve% 5 _CO2,% 1 penisilin / streptomisin karışımı tutun ve 37 ° C. Deneyler arasında, 10 ml'lik bir final hacmi içinde, 5-20 kat seyreltmelerde T25 şişeleri içine geçiş hücreleri. Not: Bu geçişleri sırasında hücreleri kullanarak optimum mühür oluşumu ve yama istikrar sağlayacak olumlu hücre sağlığını garanti eder.
2. Transfeksiyon için, çanak başına hücre süspansiyonu için ~ 0.5-0.6 ml karşılık gelen ~ 10 ⁵ hücre / kap yoğunluğunda, 35 mm tabaklar içinde HEK293 hücreleri plaka ve 18-24 saat boyunca 2 ml ortam içinde hücreler büyür.
3. 1.5 ml steril santrifüj tüpü içinde, (bu sıraya göre) eklenmesi ile dört adet 35 mm tabaklar için transfeksiyon karışımı hazırlandı: Her cDNA (GluN1, GluN2A ve GFP) (1) 1 ug; (2) 315 ulçift ​​distile su (GKD ₂ O); (2-hidroksietil)-1-piperazinetansülfonik asit (HEPES), ve çökelti oluşturmak için kullanılan akıllı 2.5 M _CaCl2 damla, (4) 35 ul (3) - 350 42 mM 4 ul.
4. Vortex 5 saniye için boru ve dört adet 35 mm tabaklar her transfeksiyon süspansiyonu 175 ul ekle hemen% 50-60 izdiham hücreleri içerir, ve 2 saat boyunca 37 ° C'de inkübe hücreleri bir gün önce, kaplama.
5. Transfeksiyon ortamı aspire, PBS ile yıkayın ve NMDA reseptör eksitotoksisiteyi ⁹ aracılı önlemek için 2 mM _MgCl2 ile desteklenmiş büyüme ortamında 2 ml ile değiştirin. Not: Hücreler, elektrofizyolojik 24-48 saat sonrası transfeksiyonu için kullanılabilir.

2.. Elektrot Hazırlanması

1. Dikey çektirmesi ile borosilikat cam tüpler çekerek 2 simetrik kayıt pipetler oluşturmak. Elde edilen ucunun büyüklüğüne ve geometrisine, ayrıca şekil pipetler görebir parlatıcı kullanılmıştır. Not: uç boyutu görsel ve elektriksel değerlendirilebilir. Görsel olarak, dış çapı 1,4-5,6 um aralığında olmalıdır. Elektrikle, optimum bir boyut ucu, dışı çözelti ile dolu iken, (Şekil 2B) 12-24 MQ aralığında dirençleri üretmek gerekir.
2. Hücre bağlı deneyler için maksimum kanal aktivitesi ve yüksek akım genlikleri üretecek hücre dışı ortamı temsil eden bir çözelti pipet kullanın. Not: NMDA reseptörleri için, bu agonistleri (glutamat ve glisin), çift değerli katyonik inhibitörleri ve blokerleri kelat 1 mM EDTA içinde doyurarak konsantrasyonlarını ihtiva eden bir çözeltiye karşılık gelen ve tek bir geçirgenlik iyonu (sodyum gibi fizyolojik konsantrasyonlarda (150 mM) sahiptir mM olarak: 1 glutamat, 0.1 glisin, 150 NaCl, 2.5 KCl, 1 N NaOH ile pH 8.0 'da tamponlu 1 EDTA ve 10 HEPBS).

3. Hücre bağlı Patch-kelepçe Kaydı

1. Açık qub veri toplama softwa(www.qub.buffalo.edu) yeniden ve 'düzen' başlığı altında satın alma penceresini seçin. Başlıklı açılır menüden 'Dosya' başlığı altında 'Yeni Verileri' tıklayarak yeni qub veri dosyası (KFY) açın ve aşağıdaki başlangıç ​​parametreleri girin: örnekleme oranı, 40 kHz; A / D ölçekleme, 3000; çıkış kanalı, 1; ve A / D veri boyutu 2., veri dosyasını sağ tıklayıp özellikleri seçerek, ve 'veri' sekmesini tıklayarak 0,1 V / Pa için genlik ölçeklendirme ayarlayın. Not: Bu parametreler, hücreye bağlı modunda bir model hücre kullanarak her bir kurulum için rafine edilebilir. Qub yazılım ve QDF özellikleri ile veri edinme hakkında ek talimat www.qub.buffalo.edu online vardır.
2. Hücreleri ifade iyon kanalı ihtiva eden bir 35 mm tabak seçip kalsiyum ve magnezyum ihtiva eden 2 ml PBS ile büyüme ortamı yerine; mikroskop sahneye çanak montaj ve hücrelerin sağlıklı ve iyi çanak bağlı olduğunu değerlendirmek için faz kontrast mikroskobu kullanarak hücresel alanında odaklanmaktek tabaka moda (Şekil 1A) içinde. Transfeksiyon (Şekil 1B) başarılı olduğunu doğrulamak için floresan tespiti geçin. Not: floresan yoğunlukları aralığı protein ifade ham bir ölçüsü olarak kullanılabilir.
3. Tek kanallı kayıt için, x10 amplifikatör çıkış kazancını, = 1 β için yama yapılandırma, 10 kHz analog filtre,-kelepçe voltaj modunu ayarlamak ve +100 mV gerilim uygulanır. OFF konumunda gerilim tutma komutu ile, 'sızdırmazlık' düğmesini seçin.
4. Floresan ve hücre sağlığı dayanarak, yama için bir hücreyi seçin. Hücre de çanak bağlı olduğu faz kontrast altında doğrulama, yama maruz hücre yüzeyinde büyük bir kısmına sahip ve sağlıklı görünüyor. Not: yaklaşımı ve patch-sıkma esnasında hücre beyazlatma önlemek için faz kontrast aydınlatma koruyun.
5. Bu elektrod ile temas yapar bu yüzden sadece yeterli bir çözüm ile taze cilalı pipet doldurune ve hafifçe sallayın ucu tuzak olabilir hava kabarcıklarını çıkarmak için. Pipet tutucusunun sıkma vidasını sızdırmazlık ve gümüş tel pipet solüsyonuna batırılır emin yaparak amplifikatör headstage üzerine kayıt pipet edin.
6. Boru ile pipet tutucu bağlı bir küçük (5 cc) plastik şırınga kullanarak, yumuşak (Şekil 2A) giren ve yaklaşma sırasında ucu tıkanmasını önlemek için kirleri pozitif basınç uygulanır.
7. Mikromanipülatör kullanarak, banyo içine pipet doğrudan ve elektrik devresini kapatarak, (Şekil 1C) yama için seçilen hücrenin üzerinde doğrudan yerleştirin. Amfinin mühür test sinyali (Şekil 2B) karşılık gelen bir dikdörtgen dalga belirtmelidir ki, osiloskop not alın. Not: banyoya girmesinden sonra, optimum aralığında pipet direnci 12-24 MQ olduğunu. 5 mV test sinyali için, ölçülen akım range ~ 20-40 pA karşılık gelir.
8. Osiloskopta elektriksel mikroskop ve pipet direnç yoluyla görme pipet konumunu izlerken, pipet hücre üzerinde hafifçe çarpmasına kadar küçük artışlarla yaklaşımı devam ve test sinyali artan direnci (Şekil 2B) belirtmek için hafifçe düşer.
9. , Bir mühür formu şırınga pick up ve kayıt pipet ucu içine hücresel membran çeker ve bir GΩ direnç mühür ¹⁰ oluşumunu başlatır şırınga pistonu, çekerek yanal boru içinden hafif negatif basınç uygulayın. Mühür oluşumu görülebilir sadece kapasitif geçici (Şekil 2B) ile, onun tam düzleşme ile belirtilir hangi osiloskopta test sinyali dalga, not alın. Not: Sinyal tamamen dümdüz değil veya temel gürültülü hale gelirse, bu mühür etrafında önemli akım kaçağı ile zayıf bir mühür gösterir. Bu r önleyecektirbir kanal akımları esolving. Bu durumda ise, hücreden pipet çekilme ve uzak banyosundan, baş aşamasından çıkarın ve atın. Yeterli bir aralık (≥ 1 GΩ) bir mühür elde edilinceye kadar taze cilalı pipet ile işlemi tekrarlayın.
10. Amplifikatör, 'kapalı' için 'sızdırmazlık testi' dan dış komut geçiş anahtarı; ('off' Önceden ayarlanmış olan) pozitif gerilim tutan komutunu geçiş; ve x100 için kazancı artırmak. Varsa, önce düz taban (Şekil 2C) adlı kare yukarı deplasmanlar gibi görünecektir, kanal etkinlik için osiloskop, gözlemlemek.
11. Kanal etkinliği osiloskoptan ise, 'rekor' düğmesinin ardından 'oyun' düğmesine basarak, qub yılında daha önce açılmış dijital dosyaya veri elde. , Veri edinme durdurmak qub içinde durdurma düğmesine basın, ve kolay retriev için QDF dosyayı kaydetmek için'Dosya' başlıklı açılır menüden de 'Save Data As ...' seçerek bilgisayarın sabit diskinde güçlü konumu.

4. Veri Ön işleme ve Idealleştirme

Not: Önemli bilgiler (basit durumda, kapalı veya açık) uygun bir iletkenlik sınıfa her bir veri noktası atar istatistiksel analizler ile tek kanallı kayıtları elde edilebilir. Bu işlem veri idealize ve segmental k araçlarının (SKM) qub in yöntemi ¹¹ aşağıda açıklanan veri idealize kısa bir açıklama olarak adlandırılır.

1. Qub veri dosyasını açın ve 'düzen' başlığı altında 'Pre' arayüzüne geçerli izlerini görmek. Etiketli kutunun işaretini kaldırarak (dijital filtreyi kaldırmak) filtresiz kaydedilen dosyayı görüntüler 'Fc.'
2. Görme usulsüzlük ve eserler (Şekil 4A) nokta kayıt tarayın. Doğru kısa akım ani ki istediğimiz anr iz içinde, aynı iletkenlik sınıfının bir komşu temiz bir bölgeyi seçerek bu bölgeyi vurgulayarak, sağ tıklayarak ve seçerek (Şekil 4A) 'set silme tampon.' Bireysel örnek noktaları görünür kadar başak yakınlaştırmak, değiştirilmesi gereken bölgeyi seçmek ve sadece bu bölgeyi vurgulayarak ve ardından 'silme' sağ-tıklayın, silmek.
3. Temel istikrarlı kaydın erken bir kısmını seçerek tüm kayıt için sıfır akım temel tanımlayın, vurgulamak, sağ tıklayın ve 'set temel' seçeneğini seçin. Doğru görünen kılavuz (Şekil 4B mor) temel düzeyde temsil doğrulayın
4. Ham veri taban kümesi başlangıca gözle sapma kaydında noktaları belirlemek. Sapan bölgede taban küçük bir bölümünü seçerek bu düzeltin, sağ tıklayın ve 'bir temel düğüm eklemek' komutunu seçin.
5. T bölgeleri belirlemekO kolayca (Şekil 4C) düzeltilmiş olamaz aşırı gürültü ya da eserler içeren kayıtlarının tutulması. Atılması gereken bölgeyi vurgulamak, sağ tıklatın ve 'sil.' Not: Bu durumda kinetik bilgiler kaybolur: işlenmiş rekor daha kısa olacak ve ekleme noktasından sonra oluşan puan öncesi gürültü bölge sürekli olarak görünür.
6. SKM algoritması ¹¹ kullanarak kayıtları idealize etmek, açık ve kapalı etkinlik hem de içeren iz bir kısmını vurgulamak ve altında 'Mod' arayüzüne girin 'Düzen.' "Model" panelinde, siyah kare (kapalı hali) sağ tıklayın ve "kapmak" seçeneğini seçin, dosya boyunca taban temsili iz temiz bir kısmını vurgulayın. Açık iletkenliği vurgulayarak kanal açıklıklar için aynı yapmak, doğru "model" panelinde kırmızı kareyi tıklatın ve "kapmak" seçeneğini seçin.
7. Idealiza gerçekleştirinaltında 'Dosya' düğmesini seçerek tüm kayıt için korunma 'veri kaynağı.' Analizi için istenen parametreler doğru olduğunu doğrulayın ve ardından tıklatın 'Modelleme' bölümünün altındaki 'idealize' sekmesine sağ tıklayın 'Çalıştır.' Idealize sonucu, tüm dosya için genlik Histogram ile birlikte, idealize görsel inceleme (Şekil 5) için izin veri ile kaplanır. Not: Yetersiz idealizasyon qub kanal açıklıkları ve aslında meydana gelmez kapanışları tespit ettiği 'sahte olaylar,' bir nesil yol açabilir. Amfinin analog filtresi ve örnekleme oranı ile ayarlanır kayıt çözünürlüğü, içinde, SKM, açık ve kapalı olayları algılar hangi ile çözünürlük analizler için ölü bir zaman ayarı ile kontrol edilebilir. Optimal ölü zamanlar deneme yanılma tarafından seçilmelidir ve örnekleme hızına bağlıdır, ancak, başparmak iyi bir kuraldır2-3 örnekleri ¹² olan ölü bir zaman seçin.
8. Idealleştirme doğru ham verileri temsil ettiğini doğrulamak için, elle idealize iz tarayın. Idealize hataların belirlenmesi üzerine, sahte olay üzerine iz vurgulayın, sağ tıklayın ve 'IdL katılın.' Not: Ek seçenekler ve qub çeşitli komutlar ve işlevleri ayrıntılı bir açıklama için, qub Manual çevrimiçi (www.qub.buffalo.edu) danışın.

Sonuçlar

Rekombinant NMDA Reseptör

NMDA reseptörleri bağlayan ve iki eş agonistlerinin birlikte eyleme yanıt: glutamat ve glisin. Bunlar GluN1 alt birimleri ve GluN2 alt birimleri bağlayıcı iki glutamat bağlanması, iki glisin heterotetramers olarak monte edin. GluN2 alt birimleri beyindeki en yaygın formları transkribe çocuk ve yetişkin hayvanlarda GluN2B olarak GluN2A dört gen (MS) ile ve bunlardan kodlanır. Çünkü (Şekil 1A) alt birimi bileşimin...

Tartışmalar

Iyon kanalı alanında, araştırma önemli bir alan açılmasını veya kanalın yolluk mekanizmasını kanal açan olaylar dizisini anlamak için adamıştır. En çok kanal için, bu işlem karmaşıktır ve gözle görülebilir çok kanallı sinyalden çıkarılabilir edilemez kinetik çeşitli adımlar içerir. Buna karşılık, deneyler tek kanallı kayıt, açık / kapalı olaylar dizisini gözlemleyerek mekanizmaları yolluk hakkında daha detaylı bilgi üretebilir nerede dizayn edilebilir. Minimal invaziv patc...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chemicals	Sigma	Various
Borosillicate Glass	Sutter	BF-150-86-10
Bright field inverted microscope	Olympus	1x51	Nikon also has similar microscopes
Fluroescent box	X-cite	Series 120
Liquid Light Guide	X-cite	OEX-LG15
Micromanipulator	Sutter Instruments	MP-225
Oscilloscope	Tektronix	TDS1001
Amplifier	Molecular Devices	Axon Axopatch 200B
Table	TMC	63561
NIDAQ card	National Instruments	776844-01
Puller	Narishige	PC-10
Polisher	Narishige	Microforge MF-830
Faraday Cage	TMC	8133306
High Speed Pressure Clamp	ALA Scientific Instruments	ALA HSPC
Pressue/Vaccuum Pump	ALA Scientific Instruments	ALA PV-PUMP	For HSPC-1