הקלטת תיקון מהדק מצורף תא אחד ערוצים

Summary

שתואר כאן הוא הליך לקבלת משתרע הקלטה הנוכחית ארוך מערוץ יון אחד עם טכניקת התיקון-clamp מצורף תא. שיטה זו מאפשרת להתבוננות, בזמן אמת, את הדפוס של תצורות ערוץ פתוחות קרובים העומדות בבסיס האות הביולוגית. נתונים אלה להודיע ​​על נכסי ערוץ בממברנות ביולוגיות באין מפריע.

Abstract

חלבוני ערוץ יון הם מכשירים אוניברסליים לתקשורת מהירה על פני ממברנות ביולוגיות. החתימה הזמנית של השטף היוני הם מייצרים תלויה במאפיינים פנימיים לכל חלבון ערוץ, כמו גם את המנגנון שבאמצעותו הוא נוצר ונשלט ומייצגת תחום חשוב של מחקר הנוכחי. ניתן להשיג מידע על הדינמיקה התפעולית של חלבוני תעלת יונים על ידי התבוננות פרקי זמן ארוכים של זרם המיוצרים על ידי מולקולה בודדת. שתואר כאן הוא פרוטוקול להשגת הקלטות אחד ערוצים מצורפים תא התיקון-clamp הנוכחיות לערוץ יגנד מגודרת יון, הקולטן NMDA, הביע heterologously בHEK293 תאים או באופן מקורי בתאי עצב בקליפת המוח. גם סיפקו הוראות כיצד להתאים את השיטה לתעלות יונים אחרות של עניין על ידי הצגת הדוגמא של PIEZO1 ערוץ מיכני רגיש. שיטה זו יכולה לספק נתונים לגבי מאפייני המוליכות של הערוץ ואת הרצף הזמני של אופתצורות n-סגורים המרכיבות את מנגנון ההפעלה של הערוץ, ובכך לסייע להבנת תפקודם בבריאות ובחוליים.

Introduction

תקשורת מהירה על פני ממברנות ביולוגיות מסתמכת כמעט אך ורק על חלבוני oligomeric נקבוביות ויוצר קרום, המכונות גם ערוצים. חלבונים אלה שונים באופן נרחב באותות הפעלה, מנגנוני gating, ומאפייני מוליכות. חלבוני ערוץ נקבוביות שהם סלקטיבית ליוני מסווגים כתעלות יונים; ההפעלה שלהם מייצרת זרמים יוניים על פני הקרום, והתגובות שלהם יכולות להיות מוקלטות עם רזולוציה גבוהה בזמן אמת תוך שימוש בטכניקות אלקטרו. אותות ההפעלה span מגוון רחב של תשומות כימיות ופיזיות הכוללים מילויים ריכוז, כוחות מכאניים וחשמליים, וטמפרטורה; וכך, סיווג נוסף תעלות יונים ליגנד מגודרת, mechanosensitive, מתח מגודרת, או סוגים רגישים לחום. במאמר זה, פרוטוקולים מתוארים להקליט פעילות אחד ערוצים מערוץ יגנד מגודרת, הקולטן NMDA, וערוץ mechanosensitive, PIEZO1, תוך שימוש בטכניקת תיקון מהדק.0;

אלקטרופיזיולוגיה תיקון מהדק היא השיטה הניסיונית הראשונה והנפוצה ביותר רגישה מספיק כדי לאפשר התצפית של מולקולות בודדות ^{1, 2.} בנוסף לרגישות המעודנת זה, היא הרחיבה במידה רבה את ההכנות ביולוגיות ניתנות להקלטת אלקטרו וגם אפשרה התצפית של תעלות יונים בקרומים שלמים. ראשית, משום ששניהם הידוק המתח והקלטה נוכחית הם השיגו עם אותו אלקטרודה, ניתן להשתמש בו כדי להקליט את האותות פני תאים קטנים או תיקוני ממברנות. הטכניקה גילתה כי תעלות יונים אינן מוגבלות לממברנות להתרגש של שרירי צפרדע, electroplaques צלופח, או אקסונים ענק דיונון ^{3, 4,} אלא שהם מייצגים גופי בכל מקום של מנגנוני איתות הטרנסממברני ומהותיים לכל סוגי קרום התא של חד או אורגניזמים רב תאיים, וגם לקרומים תאיים. יבואantly, היכולת להקליט זרמים הטרנסממברני פשוט על ידי חיבור פיפטה זכוכית לתא שלם סיפקה את ההזדמנות חסרת תקדים להקליט פעילות מתעלות יונים בקרום בלא ההפרעה האם שלהם. לכן, טכניקת התא המצורפת תיקון מהדק, אשר מתוארת בפרוטוקול זה, מאפשרת ניטור הפעילות של תעלות יונים ברציפות במשך עשרות דקות או יותר בסביבה הטבעית שלהם.

על פי תנודות תרמיות נורמליות, כל החלבונים, כוללים חלבוני ערוץ יון, לעבור שינויים מבניים על פני זמן בקנה מידה רחבה, עם השחלופים המהירים ביותר והשכיח ביותר ייצגו ככל הנראה על ידי תנועות בצד שרשרת ושינויים הרבה יותר איטיים, פחות תכופים מיוצגים על ידי מיקום מחדש של כל תחומים או יחידות משנה, או במקרים מסוימים על ידי שינויים שלאחר translational או אינטראקציות בין חלבונים ^{5, 6.} התבוננות תקופות ארוכות של פעילות שנוצרו על ידי מולקולה אחת יכולה לעזור להבין את התפקודדינמיקה תזונתית של תעלות יונים בקרום פיסיולוגי שלם ומספקת מידע רב ערך על המנגנון המבצעי של המולקולה שנצפתה.

בניגוד להבנה הגדלה והולכת של הגיוון של תעלות יונים על פני סוגי תאים ושלבי התפתחות, ידע על ההרכב המולקולרי של תעלות יונים בקרום ילידים עדיין מוגבל. כל תעלות היונים הן חלבוני Multimeric ורוב תעלות יונים האם להרכיב ממספר סוגים של תת יחידות ייצור חלבונים של גיוון מולקולרי רחב, אשר לעתים קרובות מלווה עם תכונות מוליכות וgating מגוונות. מסיבה זו, תעלות יונים של הרכב מולקולרי מוגדר נלמדות על ביטוי במערכות Heterologous. בפרט, HEK293 תאים, שהם קו משובט של תאים עובריים אנושיים הונצחו בכליות ^7, זכו בהכרה נרחבת כמערכת המועדפת לביטוי Heterologous של תעלות יונים רקומביננטי. בין האדםיתרונות y שהעלו HEK293 תאים כמערכת הבחירה לאלקטרופיזיולוגיה ערוץ יון הם את הקלות ואת affordability של culturing ושמירה על תרבויות יציבים חיים ארוכות, את היכולת שלהם לבצע קיפול לאחר translational, עיבוד וסחר של חלבוני יונקים, ובמקרים רבים , רמתם הנמוכה או אפילו העדר ביטוי אנדוגני לערוץ של עניין ^{7, 8.} להביע תעלות יונים רקומביננטי ולומדים את מאפייני הפעילות שלהן בתאי HEK293 ממשיך להיות גישה רבת ערך לקבלת מידע על נכסי מבנה לתפקוד של תעלות יונים, כמו גם את המאפיינים הספציפיים של isoforms ערוץ יון ואת תפקידם ברקמות מקומיות. הפרוטוקולים מתוארים במאמר זה יכול להיות מיושמים באופן שווה גם לתעלות יונים רקומביננטי המתבטאות בתאי HEK293 ולתעלות יונים ילידים.

לסיכום, טכניקת תיקון מהדק, באמצעות היכולת חסרת תקדים שלה כדי לפתור אותים ממולקולה אחת נותר, עד כה, השיטה הישירה ביותר להתבוננות בהתנהגות של מולקולות בודדות. במצב מחובר התא שלה, הקלטת התיקון-clamp מאפשרת תצפית תקופות ארוכות אשר, כאשר נעשה למולקולה אחת, יכול לספק תובנה יוצאת דופן לפעילות של תעלות יונים. להלן מוצג פרוטוקול להשגת הקלטות הנוכחיות ברזולוציה גבוהה מתיקונים מצורפים תא המכילים חלבון ערוץ יון אחד.

Protocol

1. ביטוי תרבית תאים וחלבונים

1. שמור על תאי HEK293 (מספר ATCC CRL-1573) בין הקטעים 22 ו40, הכולל קטעים שבוצעו על ידי ATCC, בתרבות monolayer DMEM בתוספת 10% שור סרום עוברי (FBS) ו -1% פניצילין / סטרפטומיצין בתערובת 5% CO ₂ ו37 ° C. בין ניסויים, תאי מעבר לתוך צלוחיות T25 ב5-20 דילולים לקפל בנפח סופי של 10 מיליליטר. הערה: שימוש בתאים במהלך מעברים אלה מבטיח בריאות תא חיובית אשר תאפשר להיווצרות חותם אופטימלית ויציבות תיקון.
2. עבור transfection, תאי צלחת HEK293 ב35 מנות מ"מ בצפיפות של ~ 10 ⁵ תאים / צלחת, אשר תואמת ~ 0.5-0.6 מיליליטר של השעיה תא לכל צלחת ולגדל תאים ב2 בינוני מיליליטר לשעה 18-24.
3. בצינור צנטריפוגות סטרילי 1.5 מיליליטר, להכין את תערובת transfection לארבע מנות 35 מ"מ על ידי הוספה (לפי סדר זה): (1) 1 מיקרוגרם של כל cDNA (GluN1, GluN2A, וGFP); (2) 315 μl שלמים מזוקקים פעמיים (DDH ₂ O); (3) 350 μl של 42 4 מ"מ - (2-Hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic חומצה (HEPES), ו (4) 35 μl של 2.5 M CaCl ירידה של ₂ חכמה, המשמשת כדי ליצור את המשקע.
4. צינור המערבולת במשך 5 שניות ולהוסיף 175 μl של ההשעיה transfection בכל אחת מארבע המנות 35 מ"מ מצופה היום לפני, אשר כעת מכיל תאים במפגש 50-60%, דגירה התאים ב 37 מעלות צלזיוס למשך 2 שעות.
5. לשאוב את מדיום transfection, לשטוף עם PBS ולהחליף עם 2 מיליליטר של מדיום גידול בתוספת 2 מ"מ MgCl ₂ כדי למנוע הקולטן NMDA בתיווך הפעלת יתר רעילה ^9. הערה: התאים יכולים לשמש עבור קלטות אלקטרו הודעה 24-48 שעה transfection.

2. אלקטרודה הכנה

1. ליצור 2 טפטפות הקלטה סימטרית על ידי משיכת צינורות זכוכית בורוסיליקט עם חולץ אנכי. בהתבסס על הגודל והגיאומטריה של הקצה וכתוצאה מכך, טפטפות צורה נוספתבאמצעות ליטוש. הערה: גודל הטיפ ניתן להעריך מבחינה ויזואלית וחשמלי. מבחינה ויזואלית, הקוטר החיצוני צריך להיות בטווח מיקרומטר 1.4-5.6. חשמלי, קצה גודל אופטימלי, כאשר התמלא פתרון תאי, צריך לייצר התנגדויות בטווח MΩ 12-24 (ראה איור 2).
2. להשתמש בפתרון פיפטה, אשר לניסויי תא מצורפים מייצג את הסביבה תאית שתפיק פעילות ערוץ מקסימלי ואמפליטודות נוכחית גבוהה. הערה: לקולטני NMDA, זה מתאים לתמיסה המכילה ריכוזים להרוות של אגוניסטים (גלוטמט וגליצין), 1 mM EDTA, אשר chelates מעכבי קטיוני דו הערכי וחוסמים, ויש ריכוזים פיסיולוגיים של נתרן (150 מ"מ) כיון permeant הבלעדי ( במ"מ: גלוטמט 1, 0.1 גליצין, 150 NaCl, KCl 2.5, EDTA 1, ו10 HEPBS, שנאגרו ב-pH 8.0 עם 1 N NaOH).

3. הקלטת תיקון מהדק מצורף נייד

1. softwa רכישת נתונים QuB הפתוחמחדש (www.qub.buffalo.edu), ובחר את חלון הרכישה תחת "פריסה". פתח קובץ נתונים QuB חדש (QDF) על ידי לחיצה על "נתונים חדשים" תחת תפריט הנפתח שכותרתו "קובץ" ולהזין את הפרמטרים הראשוניים הבאים: קצב דגימה, 40 kHz; דרוג / D, 3,000; ערוץ פלט, 1; וגודל / D נתונים, 2. התאימו את קנה המידה משרעת ל0.1 V / הרשות הפלסטינית על ידי לחיצה ימנית על קובץ הנתונים, בחירת מאפיינים, ולחיצה על הכרטיסייה 'נתונים'. הערה: פרמטרים אלו יכולים להיות מעודנים לכל התקנה תוך שימוש במודל תאים במצב מחובר התא. הוראה נוספות על רכישת נתונים עם תוכנת QuB ומאפייני QDF הן באופן מקוון ב www.qub.buffalo.edu.
2. בחר צלחת 35 מ"מ המכילה ערוץ יון לבטא בתאים ולהחליף את מצע גידול עם 2 מיליליטר PBS המכיל סידן ומגנזיום; הר הצלחת לבמה מיקרוסקופ ולהתמקד בתחום הסלולר באמצעות מיקרוסקופ לעומת השלב להעריך כי תאים בריאים ומחוברים היטב לצלחתב( איור 1 א) אופנה שכבה. לעבור לגילוי הקרינה כדי לוודא שtransfection היה מוצלח (איור 1). הערה: הטווח של עוצמות הקרינה יכול לשמש כמדד גס של ביטוי חלבון.
3. להקלטת ערוץ אחד, להגדיר את רווח מגבר פלט x10, תצורת תיקון לβ = 1, מסנן אנלוגי ל10 קילוהרץ, במצב למתח-clamp ולהחיל מתח ל+100 mV. עם פקודת החזקת המתח במצב OFF, בחר בלחצן "מבחן חותם".
4. המבוסס על הקרינה ובריאות תא, בחר תא לתיקון. ודא תחת לעומת שלב שהתא מחובר היטב לצלחת, יש חלק גדול של תא השטח החשוף לתיקון, ואחרת נראה בריא. הערה: שמור על תאורה בניגוד שלב, כדי למנוע הלבנת התא במהלך הגישה ותיקון-ההידוק.
5. מלא פיפטה טריות מלוטשת עם רק פתרון מספיק, כך שהוא יוצר קשר עם electrodדואר וללחוץ בעדינות כדי לסלק בועות אוויר שעלול להיות לכודים בקצה. אבטח את פיפטה ההקלטה על גבי headstage המגבר על ידי הידוק בורג האיטום של בעל פיפטה ולוודא כי חוט הכסף הוא שקוע בפתרון פיפטה.
6. באמצעות מזרק קטן (5 סמ"ק) פלסטיק, אשר מחובר למחזיק פיפטה על ידי צינורות, בעדינות להפעיל לחץ חיובי על מנת למנוע זיהומים מלהיכנס וסותם את הקצה במהלך הגישה (איור 2 א).
7. שימוש micromanipulator, לכוון את פיפטה לתוך האמבטיה ולמקם אותו ישירות מעל לתא שנבחר לתיקון (איור 1 ג), סוגר את המעגל החשמלי. שימו לב לאוסצילוסקופ, אשר אמור להצביע על צורת גל מלבני המקביל לאות בדיקת החותם של המגבר (איור 2). הערה: עם כניסתו לאמבטיה, התנגדות פיפטה בטווח האופטימלי היא 12-24 MΩ. לאות בדיקת 5 mV, r הנוכחי נמדדAnge מתאים ל~ 20-40 רשות.
8. תוך מעקב אחר מצב פיפטה ויזואלית דרך התנגדות מיקרוסקופ ופיפטה חשמלית על אוסצילוסקופ, תמשיך בגישה במרווחים קטנים עד פיפטה פוגעת בעדינות על התא, ואות הבדיקה מקטינה מעט כדי לציין התנגדות מוגברת (איור 2).
9. כדי ליצור חותם, להרים את המזרק ולהפעיל לחץ שלילי קל דרך צינורות לרוחב על ידי משיכת בוכנת המזרק, מה שמושך את קרום התא אל קצה פיפטה ההקלטה ויוזמת את הקמתה של חותם התנגדות GΩ ^10. שימו לב לצורת גל בדיקת האות על אוסצילוסקופ, שבו היווצרות חותם מצויינים על ידי השטחה המלאה שלה, ורק ארעיים קיבולי גלויים (איור 2). הערה: אם אות לא לשטח לחלוטין או הבסיס הופך להיות רועש, זה מצביע על חותם חלש עם דליפה נוכחית משמעותית סביב החותם. זה ימנע resolving זרמי ערוץ אחד. אם זה המקרה, למשוך את פיפטה מהתא ומהם לאמבטיה, להסיר אותו מהבמה בראש וזורקים אותו. חזור על התהליך עם טפטפת טרי מלוטש עד לקבלת חותם בטווח המתאים (≥ 1 GΩ).
10. על המגבר, להחליף את מתג הפיקוד החיצוני מ" מבחן חותם 'ל' כבוי '; לעבור את פקודת המתח מחזיק לחיובי (שהוקם בעבר ל'כבוי '); ולהגדיל את הרווח לx100. שים לב אוסצילוסקופ לפעילות ערוץ, אשר, אם קיימים, יוצג כסטיות כלפי מעלה מרובעות מהבסיס השטוח בעבר (איור 2 ג).
11. אם פעילות הערוץ מוצגת על אוסצילוסקופ, לרכוש נתונים לתוך הקובץ הדיגיטלי פתח בעבר בQuB, על ידי לחיצה על הכפתור "המשחק" ואחריו על הכפתור 'השיא'. להפסיק לרכוש נתונים, לחץ על כפתור העצירה בQuB, ולשמור את הקובץ בקלות לQDF retrievמיקום הצליח על הכונן הקשיח של המחשב על ידי בחירה "שמור נתונים בשם ... 'בתפריט הנפתח שכותרתו" קובץ ".

4. נתונים עיבוד מקדימים ואידיאליזציה

הערה: מידע חשוב ניתן להפיק מהקלטות ערוץ אחד על ידי ניתוחים סטטיסטיים שמקצה כל נקודת נתונים לכיתת מוליכות מתאימה (במקרה הפשוט ביותר, סגור או פתוח). תהליך זה מכונה אידיאליזציה נתונים ותיאור קצר של אידיאליזציה נתונים עם האמצעי המגזרי k (SKM) שיטה ¹¹ בQuB מתוארת להלן.

1. פתח את קובץ הנתונים בQuB, ולהציג את העקבות הנוכחיות בממשק 'קדם' תחת 'פריסה'. להציג את הקובץ המוקלט לא מסונן (להסיר מסנן דיגיטלי) על ידי ביטול הסימון התיבה שכותרתה "מועדון כדורגל".
2. מבחינה ויזואלית לסרוק את השיא לזהות חריגות וממצאים (איור 4 א). קוצים הנוכחיים קצרים נכון שoccur בתוך העקבות (איור 4 א) על ידי בחירת אזור נקי סמוך מאותו סוג המוליכות, המדגיש אזור זה, לחיצה ימנית ובחירה באפשרות "חיץ למחוק מוגדר. ' קרב על העלייה החדה עד נקודות מדגם בודדות נראות, בחר את האזור כדי להיות מוחלפים ולמחוק ידי הדגשה רק אזור זה ולאחר מכן לחץ לחיצה ימנית על "למחוק".
3. הגדר את הבסיס הנוכחי אפס עבור כל הרשומה על ידי בחירת חלק מוקדם של התקליט שבו הבסיס יציב, גולת כותרת, לחץ לחיצה ימנית ובחר 'קו בסיס שנקבע ". ודא כי הקו המנחה המופיע מייצגת במדויק את הרמה הבסיסית (סגול באיור 4 ב)
4. לזהות נקודות בשיא שבו בסיס הנתונים הגולמי חורג בעליל מנקודת ההתחלה שנקבעה. לתקן זאת על ידי בחירת קטע קטן של קו בסיס באזור הסטייה, לחץ לחיצה ימנית ובחר בפקודה 'להוסיף צומת בסיס ".
5. לזהות אזורים של tהוא הקלטה המכיל רעש עודף או חפצים שלא ניתן לתקן (איור 4C) בקלות. הדגש את האזור כדי להיות מושלכים, לחץ לחיצה ימנית, ובחר 'מחק'. הערה: במקרה זה מידע הקינטית ייאבד: שיא מעובד יהיה קצר יותר והנקודות שהתרחשו לאחר נקודת אחוי יופיעו להיות רציף עם האזור לפני הרעש.
6. לעשות אידיאליזציה רשומות באמצעות אלגוריתם SKM ^11, להדגיש חלק מהעקבות המכילות את שני אירועים פתוח וסגור ולהיכנס לממשק 'מוד' תחת 'פריסה'. בפנל "המודל", להדגיש חלק נקי של הקורט כי הוא נציג של קו הבסיס לאורך כל הקובץ, לחץ לחיצה ימנית על הריבוע השחור (מצב סגור) ובחר באפשרות "לתפוס". לעשות את אותו הדבר לפתחי ערוץ על ידי הדגשת המוליכות פתוחות, לחץ לחיצה ימנית על הריבוע האדום בפנל "המודל" ובחר באפשרות "לתפוס".
7. בצע idealization לכל השיא על ידי בחירה על הכפתור "הקובץ" תחת "מקור נתונים". לחץ לחיצה ימנית על הכרטיסייה 'אידיאליזציה' מתחת לחלק 'דוגמנות' כדי לוודא שהפרמטרים הרצויים לניתוח נכונים, ולאחר מכן לחץ על 'הפעלה'. התוצאה של האידיאליזציה, יחד עם היסטוגרמה משרעת לקובץ כולו, היא ועליהן את הנתונים, כדי לאפשר בדיקה ויזואלית של האידיאליזציה (איור 5). הערה: אידיאליזציה לקויה עלולה להוביל לדור של 'אירועי שווא, "שבי QuB מזהה פתחי ערוץ וסגרים שלא באמת מתרחשים. במסגרת החלטת ההקלטה, אשר מוגדרת על ידי המסנן האנלוגי של המגבר ואת קצב הדגימה, ברזולוציה שבה SKM מזהה אירועים פתוחים וסגורים יכולה להיות נשלטה על ידי הגדרת זמן מת לניתוחים. שעות מתות אופטימליות חייבים להיות נבחרו על ידי ניסוי וטעייה ותהיה תלויות בקצב דגימה, לעומת זאת, כלל אצבע טובה הואכדי לבחור זמן מת שהוא 2-3 דגימות ^12.
8. כדי לוודא שהאידיאליזציה מייצגת במדויק את הנתונים הגולמיים, סריקה ידנית עקבות אידיאליזציה. עם זיהוי של שגיאות באידיאליזציה, להדגיש את העקבות על אירוע השווא, קליק ימני ובחר 'הצטרף IDL.' הערה: לאפשרויות נוספות והסבר מפורט של פקודות שונות ופונקציות בQuB, להתייעץ QuB מקוון ידני (www.qub.buffalo.edu).

תוצאות

רקומביננטי NMDA רצפטורים

קולטני NMDA להיקשר ולהגיב לפעולה במקביל של שני עמיתים לאגוניסטים: גלוטמט וגליצין. הם להרכיב כheterotetramers של שני גליצין המחייב יחידות משנה GluN1 ושני גלוטמט מחייב יחידות משנה GluN2. יחידות משנה GluN2 מקודדות ע?...

Discussion

בתחום ערוץ יון, אזור חשוב של מחקר מוקדש להבנת רצף אירועים שמוביל לערוץ פתיחה או מנגנון gating של הערוץ. עבור רוב הערוצים, תהליך זה הוא מורכב וכולל מספר שלבים הקינטית שלא ניתן להסיק מאות רב ערוצים מקרוסקופית. לעומת זאת, יכולים להיות מתוכננים ניסויים שבם התבוננות רצף אירוע...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chemicals	Sigma	Various
Borosillicate Glass	Sutter	BF-150-86-10
Bright field inverted microscope	Olympus	1x51	Nikon also has similar microscopes
Fluroescent box	X-cite	Series 120
Liquid Light Guide	X-cite	OEX-LG15
Micromanipulator	Sutter Instruments	MP-225
Oscilloscope	Tektronix	TDS1001
Amplifier	Molecular Devices	Axon Axopatch 200B
Table	TMC	63561
NIDAQ card	National Instruments	776844-01
Puller	Narishige	PC-10
Polisher	Narishige	Microforge MF-830
Faraday Cage	TMC	8133306
High Speed Pressure Clamp	ALA Scientific Instruments	ALA HSPC
Pressue/Vaccuum Pump	ALA Scientific Instruments	ALA PV-PUMP	For HSPC-1