La identificación rápida de bacterias gram negativas de Cultura sangre caldo de cultivo utilizando MALDI-TOF espectrometría de masas

Resumen

La aplicación de láser asistida por matriz de desorción / ionización tiempo de vuelo (MALDI-TOF) espectrometría de masas (MS) directamente a caldo de cultivo de sangre acelera la identificación de bacterias. El método presentado es un método rápido y fiable para la identificación de bacterias Gram negativas directamente desde el caldo de cultivo de sangre.

Resumen

Una función importante de los laboratorios de microbiología clínica es proporcionar una rápida identificación de bacterias causantes de infección del torrente sanguíneo. Identificación tradicional requiere la sub-cultura de la señalada caldo de cultivo de sangre con identificación disponible sólo después de colonias en agar sólido han madurado. MALDI-TOF MS es un método fiable, rápido para la identificación de la mayoría de bacterias clínicamente relevantes cuando se aplica a las colonias en medios sólidos. La aplicación de MALDI-TOF MS directamente al caldo de cultivo de sangre es un enfoque atractivo, ya que tiene el potencial de acelerar la identificación de especies de bacterias y mejorar la gestión clínica. Sin embargo, un problema importante a superar es la eliminación de pre-análisis de interferencia resinas, proteínas y hemoglobina contenidas en las muestras para cultivo de sangre que, si no se elimina, interfieren con los espectros de MS y puede resultar en las puntuaciones de identificación de discriminación insuficientes o bajos. Además, es necesario concentrar bacteria para desarrollar espectros de calidad suficiente. El método que se presenta describe la concentración, purificación y extracción de las bacterias Gram negativas que permitan la identificación temprana de las bacterias de un caldo de cultivo de sangre señalado.

Introducción

Los pacientes con infección del torrente sanguíneo (BSI), debido a las bacterias continúan teniendo una alta mortalidad en el hospital, que van 6-48% ^1. La entrega de antibiótico empírico adecuado promueve la supervivencia y en el subconjunto de pacientes con sepsis grave, cada retardo horas a la terapia apropiada se correlaciona con una menor supervivencia ^2,3. En consecuencia, un objetivo clave del laboratorio clínico es detectar rápidamente, identificar y comunicar la presencia de bacterias en cultivos de sangre para informar las decisiones clínicas. Se ha demostrado que el laboratorio de microbiología tiene la mayor influencia en la terapia antimicrobiana en el momento de la presentación de informes de la tinción de Gram ⁴ y, recientemente, un estudio observacional demostró que el tiempo de desorción por láser asistida por matriz / ionización de vuelo espectrometría de masas (MALDI-TOF MS) realizado directamente en caldos de cultivo de sangre influir en la prescripción en más de una tercera parte de BSI causadas por bacterias Gram negativas ^5.

El desarrollo comercial de MALDI-TOF MS ha llevado a una herramienta de laboratorio eficaz para la identificación de microorganismos ^6,7. La tecnología está ahora bien establecida y se ha integrado en muchos laboratorios para la identificación rápida y precisa de los microorganismos aislados en el ^6,8 medios sólidos. La aplicación directa de MALDI-TOF MS para hemocultivo (BC) de caldo que se han señalado "positivo" para los microorganismos apela a los médicos y directores de laboratorio debido a la posibilidad de obtener una identificación más temprana de los microorganismos a bajo costo.

La utilidad clínica de la aplicación directa de MALDI-TOF MS de caldo de cultivo de sangre ha sido limitado por la amplia gama de sensibilidades observados cuando se compara con los métodos basados ​​en la cultura fenotípica estándar de identificación, con los informes de la identificación con éxito de las bacterias Gram negativas que van desde 47 hasta 98,9 ^9-11%. La variación en la sensibilidad probablese refiere a la composición antes de Cristo caldo, la concentración bacteriana inicial, la variación en los métodos de preparación de muestras, así como la gama de organismos Gram negativos encontrados en las poblaciones de estudio ^9. En comparación con estos otros protocolos publicados el método presentado aquí evita el uso de etanol, cloruro de amonio o (no-matriz) acetonitrilo adicional. Como resultado, el sedimento bacteriano se permanecer viable (hasta el punto de extracción de la proteína) que permite métodos potenciales de prueba de susceptibilidad fenotípica a ser aplicados directamente a estos organismos en el caldo. Además, el método que se presenta se ha demostrado para ser de bajo costo, confiable y rápida con la identificación de bacterias disponibles dentro de 25 min de los hemocultivos Gram resultados de la tinción, con un mínimo de "manos en" el tiempo ^12.

Este método es un simple protocolo de spin-lisis de la casa utilizando la extracción con ácido fórmico aplicado directamente a los caldos de cultivo de sangre positivo para identificar Gram negativo bacteria con la tecnología MALDI-TOF MS.

Protocolo

1. Hemocultivos Caldos Marcar como "positiva"

1. Retire el frasco de hemocultivo señalado desde el gabinete de incubación monitoreo continuo y colóquelo en una cabina de seguridad biológica. Nota: Las botellas pueden contener microorganismos peligrosos y precauciones universales deben ser seguidas. Debido al riesgo de aerosoles infecciosos en el muestreo, los procedimientos de muestreo deben realizarse en una cabina de flujo laminar de bioseguridad de Clase II.

2. Tinción de Gram se prepara

1. Preparar una tinción de Gram del caldo de cultivo de sangre señalizado según los protocolos institucionales locales. Nota: Cuando los organismos Gram negativos se identifican en la microscopía del caldo de cultivo de sangre se procesa de acuerdo con el siguiente método. Cuando se identifican los organismos Gram positivos, un método molecular alternativa focalización identificación genética y los marcadores de resistencia se aplica al caldo (no se aborda en este artículo) ^13.

e "> 3. Transferencia de Marcado Blood caldo de cultivo a un tubo de separación de suero

1. Mezcle suavemente el frasco de hemocultivo invirtiendo 2-3x.
2. Dentro de la cabina de bioseguridad adjuntar una jeringa de 10 ml a un dispositivo de transferencia de sangre seguridad.
3. Una el dispositivo de transferencia de sangre a la botella de cultivo de sangre y retirar 5 ml de caldo en la jeringa. Transferir el caldo BC aspirado en un tubo de separar el suero.

4. Concentración de Cultura sangre Caldo

1. Centrifugar el tubo de separación de suero a 1250 xg durante 15 min que elimina un gran volumen de células rojas de la sangre.
2. Aspirar y descartar el sobrenadante usando una pipeta de transferencia estéril teniendo cuidado de dejar aproximadamente 1 ml de la capa leucocitaria inmediatamente por encima de la interfaz de gel / líquido. Nota: Las botellas aeróbicas muestran una clara separación de las células rojas de la sangre a la parte inferior del tubo con la interfaz de gel / líquido que aparece de un color blanco opaco. En contraste, cuandoaplicado al caldo de cultivo de sangre anaeróbica lítico la interfaz de gel / líquido aparece como un color rojo intenso debido a los componentes de las células rojas de la sangre lisadas permaneciendo en suspensión en el sobrenadante.

5. Repita los pasos de centrifugación Wash

1. Mezcle suavemente los últimos 1 ml de líquido de la capa leucocitaria por encima de la interfaz de gel con una pipeta estéril y luego transferir todo el volumen en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Centrifugar el nuevo tubo a 288 g durante 30 seg.
2. Transferir el sobrenadante usando una pipeta de transferencia desechable de 1 ml de plástico en un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,5 ml y desechar el tubo con el sedimento. Nota: Es muy importante en este paso que se tiene cuidado de evitar la transferencia de la pastilla. Esto es particularmente importante para un espécimen que se procesa de la botella antes de Cristo anaeróbica como el sobrenadante permanece pigmentada y el sedimento no se ve siempre claramente.

6. La lisis de las células residuales

1. Centrifugar la muestra a 18.407 xg durante 1 min y luego aspirado (y de descarte) el sobrenadante usando una pipeta de transferencia de punta fina para dejar tan poco líquido residual como sea posible sin perturbar el sedimento.
2. Resuspender el pellet residual en 1 ml de DNAsa RNAsa estéril y libre de agua con la pipeta hacia arriba y abajo. Nota: Algunos autores han descrito el uso de soluciones de alcohol en lugar de agua estéril para volver a suspender el sedimento que hace que las bacterias no viables.
3. Centrifugar la solución se resuspendieron a 18.407 xg durante 1 min.

7. Extracción de Proteínas Bacterianas

1. Aspirar y desechar el sobrenadante, utilizando de nuevo la aspiración con una pipeta de punta fina asegurar que se elimina la mayor cantidad de líquido posible.
2. Resuspender el precipitado en 10 l de ácido fórmico (70% v / v). Nota: El ácido fórmico puede afectar al organismo si es inhalado o si entra en contacto con la piel. Al preparar o manipular soluciones es recommended que el personal utilizan un gabinete de humos, además de los equipos de protección personal.
3. Mezclar bien usando la pipeta para asegurar una solución homogénea resuspendido. Uso de la punta de la pipeta para romper físicamente la pastilla puede ser necesario para asegurar una solución más homogénea.

8. Preparación de MALDI-TOF Target Plate

1. Inocular una placa objetivo clean MALDI-TOF con 2 l de la suspensión dispuesta por lugar de destino. Preparar 3 sitios diana para cada muestra para contrarrestar el problema ocasional de lecturas fallado.
2. Deje que la placa del objetivo MALDI-TOF se seque. La velocidad de secado se puede aumentar mediante la colocación de la placa en el borde de la campana de humos para maximizar el flujo de aire a través de la placa.
3. Superposición de cada punto se secó con 1 l de la solución de matriz (10 mg / ml de ácido α-ciano-4-hidroxicinámico (HCCA), 50% de acetonitrilo, ácido trifluoroacético 2,5%). Nota: La solución de la matriz puede afectar al organismo si es inhalado o si entra en contact con la piel. Al preparar o manipular soluciones, se recomienda que el personal utiliza un armario de humos, además de los equipos de protección personal.
4. Deje que la placa del objetivo MALDI-TOF se seque sobre el borde de la campana extractora de humos como se describió anteriormente. Asegurar una preparación homogénea llena cada uno de los lugares de destino en el plato.

9. Place MALDI-TOF Target Plate en el espectrómetro de masas

1. Inserte la placa del objetivo MALDI-TOF en el espectrómetro de masas MALDI-TOF. Asegúrese de que la placa está sentado a ras con las placas de resorte. Nota: No inserte la placa del objetivo hasta que todos los puntos de destino están secos.
2. Asegúrese de que la junta de goma esté libre de pelusa, polvo y el pelo para que las condiciones de vacío requeridas pueden ser creados.
3. Cierre la tapa etapa MALDI-TOF y luego presione el botón "in / out" en la parte frontal del instrumento. La tapa ahora bloquear y permitir que el vacío necesario que se creará.

10. MALDI-TOF MS SPECTRA Adquisición

1. Abra el MALDI biotipificación y software FlexControl.
2. Dentro del software Typing seleccionar "nueva clasificación" en el menú desplegable titulado "archivo". Asigne un nombre al proyecto y, a continuación, seleccione "nuevo". Seleccione "Siguiente" para completar la configuración en el software de mecanografía.
3. Dentro de la ventana del software de control de identificar el gráfico en pantalla de la tablilla de puntería. Resalte los puntos objetivo MALDI-TOF que están en uso, moviendo el ratón sobre los puntos inoculados mientras mantiene pulsado el botón izquierdo del ratón.
4. Utilice el botón derecho del ratón para hacer clic en cualquier lugar de las posiciones de destino seleccionados y luego seleccione "agregar analitos" en el menú desplegable.
5. Añadir sanguíneos cultura datos identificativos de la columna "ID" para cada uno de los lugares de destino y haga clic en "Siguiente" cuando haya terminado.
6. Seleccione la "taxonomía" base de datos de espectros comerciales y seleccione "siguiente". Nota: Laborios pueden utilizar adicional en-casa o bases de datos comerciales para aumentar el número de espectros de referencia.
7. Haga clic en "Finalizar" y el MALDI-TOF MS se iniciará la generación de espectros. Nota: Los ajustes de MALDI-TOF fueron según la configuración de la producción (modo lineal positiva, 60 Hz de frecuencia láser, 20 kV de tensión de aceleración, 16,7 kV de tensión IS2, 170 de retardo de extracción de nanosegundos, y 2,000-20,137 rango m / z).
8. Si el software de control de MALDI no genera picos, se puede realizar la adquisición manual de los espectros (método no se describe).

11. Interpretación Análisis del anuncio de MALDI-TOF MS Partituras

1. Una vez que los espectros son adquiridos y el análisis esté completo, seleccione el botón "+" al lado de la identificación de especies en el software de mecanografía para expandir la lista de identificación para cada destino.
2. Estudie los 5 mejores identificaciones, observando si el top 5 son similares. Top discordantes 5 géneros con puntuaciones ≥ 1.7 del mismo objetivopunto planteó la posibilidad de caldos mixtos. Nota: la tecnología MALDI-TOF tiene poca sensibilidad para la detección de caldos mixtos. Por ejemplo, cuando un caldo contiene especies mixtas una puntuación alta confianza puede ser identificado por sólo una de las especies mixtas.
3. Cuando una puntuación ≥ 2,0 se caracteriza por el mayor partido en el lugar de destino, el informe de la especie.
4. Cuando la puntuación más alta en un punto de destino es ≥ 1,7, pero <2,0, sólo informamos de los géneros. Si los criterios adicionales de los 5 mejores identificaciones son concordantes, a continuación, informe a nivel de especie.

12. La eliminación de la placa de MALDI-TOF Target

1. Cuando todos los espectros son el botón de "in / out" en la máquina MALDI-TOF de prensa.
2. Abra el MALDI-TOF receptáculo tablilla de puntería y retire la placa del objetivo MALDI-TOF.
3. Si se utiliza una placa reutilizable diana MALDI-TOF, limpie todos los puntos de destino mediante el alcohol y almacenar la placa de MALDI-TOF a TA una vez que esté limpio y seco.

Resultados

La generada MALDI-TOF MS espectros se comparan con la base de datos de referencia integrado de los espectros. Una puntuación logarítmica es asignado por la confianza del partido entre el aislado de prueba y la base de datos de referencia de los aislamientos, con la recomendación de un puntaje ≥ 1,7 requerida para su identificación a nivel de género probable (Figura 1) y ≥ 2,0 para la identificación probable de especies (Figura 2). Informe a nivel de especie cuando la puntuaci?...

Discusión

Es importante aplicar el MALDI-TOF MS de caldo de cultivo de sangre que los pasos posteriores a la centrifugación se llevan a cabo con el cuidado suficiente para no volver a mezclar los componentes separados. Es particularmente importante para eliminar los constituyentes de cultivos de sangre y proteínas celulares humanos, incluyendo la hemoglobina, que pueden producir picos de interferencia con los espectros de MALDI-TOF.

Aunque MS fabrica recomendar cortar de puntuación de ≥ 2,0 para ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
BACTEC Plus Aerobic/F Medium	Becton Dickinson; BD, Franklin Lakes, NJ, USA	442192
BACTEC Lytic/10 Anaerobic/F Medium	Becton Dickinson; BD, Franklin Lakes, NJ, USA	442265
BACTEC Peds Plus Medium	Becton Dickinson; BD, Franklin Lakes, NJ, USA	442194
Vacutainer - Blood transfer device	Becton Dickinson; BD, Franklin Lakes, NJ, USA	364880	Single use sampling device reducing the risk of needlestick injury
Vacutainer SST 5.0 ml, Advance plus	Becton Dickinson; BD, Franklin Lakes, NJ, USA	367954	Serum separating tube
Syringe 10 ml	Becton Dickinson; BD, Franklin Lakes, NJ, USA	302143
Transfer pipette	Samco, USA	222-20S
Transfer pipette (fine tipped)	Samco, USA	232-20S
Microcentrifuge tube (2.0 ml)	Eppendorf, Hamburg, Germany	0030.120.094
Sterile water (DNAse and RNAse free)	Life Technologies, Carlsbad, California, USA	10977-015
Formic acid	Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA	F0507
Matrix solution	Bruker Daltonics, Bremen Germany	285074	10 mg/ml α-cyano-4-hydroxycinnamic acid, 50% acetonitrile, 2.5% trifluoroacetic acid
Benchtop microflex LT MALDI-TOF MS	Bruker Daltonics, Bremen Germany		Utilizing BioTyper 3.1 (Build 65) and FlexControl 3.3 (Build 99) software