Schnelle Identifizierung von Gram-negativen Bakterien aus Blutkulturbrühe unter Verwendung von MALDI-TOF-Massenspektrometrie

Zusammenfassung

Die Anwendung der Matrix-unterstützten Laserdesorption / Ionisation Flugzeit (MALDI-TOF)-Massenspektrometrie (MS) direkt an Blutkulturbrühe beschleunigt die Identifizierung von Bakterien. Das vorgestellte Verfahren ist ein schnelles und zuverlässiges Verfahren zur Identifizierung von Gram-negativen Bakterien direkt aus Blutkulturbrühe.

Zusammenfassung

Eine wichtige Rolle der klinischen Mikrobiologie-Labor ist eine schnelle Identifizierung von Bakterien, die Infektion der Blutbahn liefern. Traditionelle Identifizierung erfordert die Subkultur der signalisiert Blutkulturbrühe mit Identifikations erst verfügbar, nachdem Kolonien auf festen Agar sind gereift. MALDI-TOF-MS ist ein zuverlässiges, schnelles Verfahren zur Identifizierung der meisten klinisch relevanten Bakterien als Kolonien auf festem Medium aufgebracht. Die Anwendung der MALDI-TOF-MS direkt an Blutkulturbrühe ist ein attraktiver Ansatz, da sie das Potenzial hat, Artbestimmung von Bakterien beschleunigen und zu verbessern klinische Management. Allerdings ist ein wichtiges Problem zu überwinden, die Pre-Analyse Entfernung von störenden Harze, Proteine ​​und Hämoglobin in Blutkulturproben, die, wenn nicht entfernt werden, stören die MS-Spektren und kann zu einer unzureichenden oder niedrigen Diskriminierung Identifizierung Partituren Ergebnis enthalten. Zusätzlich ist es notwendig, bacter konzentrierenia zu entwickeln Spektren von ausreichender Qualität. Die vorgestellte Methode beschreibt die Konzentration, Reinigung und Gewinnung von Gram-negativen Bakterien so dass für die frühzeitige Identifizierung von Bakterien aus einer Blutkultur signalisiert Brühe.

Einleitung

Patienten mit Infektion der Blutbahn (BSI) durch Bakterien weiterhin hohe Mortalität im Krankenhaus haben, angefangen von 6 bis 48% ^ein. Die Lieferung der entsprechenden Antibiotika fördert das Überleben und in der Untergruppe der Patienten mit schwerer Sepsis, jede Stunde Verzögerung, um eine geeignete Therapie korreliert mit verringerten Überlebens ^2,3. Dementsprechend ist ein zentrales Ziel der klinischen Labor, um schnell zu erkennen, zu identifizieren und kommunizieren die Anwesenheit von Bakterien in Blutkulturen, klinische Entscheidungen. Es hat sich gezeigt, dass die mikrobiologischen Labor hat den größten Einfluss auf eine antimikrobielle Therapie bei der Berichterstattung über die Gram-Färbung ⁴ und vor kurzem eine Beobachtungsstudie gezeigt, dass Matrix-Assisted Laser Desorption / Ionisation Flugzeit-Massenspektrometrie (MALDI-TOF-MS) direkt auf die Blutkulturbrühen durchgeführt beeinflussen Verschreibung in über einem Drittel der BSI, die durch Gram-negative Bakterien verursacht werden ^5.

Die kommerzielle Entwicklung von MALDI-TOF MS wurde auf einem Laborwerkzeug wirksam für die Identifizierung von Mikroorganismen ^6,7 führte. Die Technologie ist mittlerweile etabliert und hat sich in vielen Labors für die schnelle und genaue Identifizierung von Mikroorganismen isoliert auf festen Medien ^6,8 integriert. Die direkte Anwendung der MALDI-TOF-MS zu Blutkultur (BC) Brühe, die für Mikroorganismen appelliert an beide Kliniker und Laborleiter, weil das Potenzial, eine frühere Identifizierung von Mikroorganismen bei niedrigen Kosten zu erhalten "positiv" signalisiert haben.

Der klinische Nutzen der direkten Anwendung der MALDI-TOF-MS, um den Blutkulturbrühe wurde von der breiten Palette der beobachteten Empfindlichkeiten beschränkt worden, als mit Standard-phänotypischen Kultur Methoden der Identifizierung, mit Berichten über erfolgreiche Identifizierung von Gram-negativen Bakterien bis hin verglichen 47-98,9 ^9-11%. Die Variation in der Empfindlichkeit wahrscheinlichbezieht sich auf die Zusammensetzung BC Brühe, Anfangsbakterienkonzentration, Variation in der Probenvorbereitung Methoden sowie die Anordnung von Gram-negativen Organismen in Studienpopulationen ⁹ gestoßen. Verglichen mit diesen anderen veröffentlichten Protokollen der hier vorgestellten Verfahren vermeidet die Verwendung von Ethanol, Ammoniumchlorid oder zusätzliche (nicht-Matrix) Acetonitril. Als Ergebnis wird das Bakterienpellet lebensfähig bleiben (bis zum Punkt des Proteinextraktion) unter Berücksichtigung der potentiellen phänotypischen Suszeptibilität Testverfahren unmittelbar auf diese Organismen in der Brühe verwendet werden. Darüber hinaus hat das vorgestellte Verfahren wurde gezeigt, kostengünstige, zuverlässige und rasche Identifizierung von Bakterien mit innerhalb von 25 min der Blutkultur Gramfärbung Ergebnisse mit minimalen "hands on" Zeit ¹² ist.

Diese Methode ist eine einfache Inhouse-Spin-Lyse-Protokoll unter Verwendung von Ameisensäure Extraktion Gram-negative b identifizieren direkt an positiven Blutkulturbrühen angewendetacteria mit MALDI-TOF-MS-Technologie.

Protokoll

1. Blutkultur Brühen Flagge als "Positiv"

1. Entfernen Sie die signalisiert Blutkulturflasche von der kontinuierlichen Überwachung Brutschrank und legen Sie sie in einem biologischen Sicherheitsschrank. Hinweis: Die Flaschen können gefährliche Mikroorganismen enthalten und allgemeine Vorsichtsmaßnahmen befolgt werden müssen. Wegen der Gefahr von Infektions Aerosole bei der Probenahme, müssen alle Stichprobenverfahren in einem Biosafety Klasse II Sterilbank durchgeführt werden.

2. Gram Stain ist bereit

1. Bereiten Sie eine Gram-Färbung aus dem Blut signalisiert Kulturbrühe nach lokalen institutionellen Protokolle. Hinweis: Bei gramnegativen Organismen Mikroskopie identifiziert die Blutkulturbrühe wird nach der folgenden Methode verarbeitet. Wenn Gram-positive Organismen identifiziert werden, wird eine alternative Methode Molekular Targeting genetischen Identifizierung und Resistenzmarker auf dem Medium (in diesem Artikel nicht angesprochen) ¹³ angelegt.

e "> 3. Transfer markiert Blutkulturbrühe zu einem Serum Trennrohr

1. Vorsichtig mischen die Blutkulturflasche durch Umdrehen 2-3x.
2. Im Rahmen der biologischen Sicherheitsschrank legen Sie eine 10-ml-Spritze mit einer Sicherheitsblutübertragungseinrichtung.
3. Befestigen Sie den Bluttransfer-Gerät an den Blutkulturflasche und ziehen 5 ml der Brühe in die Spritze. Übertragen Sie die angesaugte BC Brühe in einer Serumtrennrohr.

4. Konzentration der Blutkulturbrühe

1. Zentrifugieren des Serumtrennrohr bei 1250 × g für 15 min, die ein großes Volumen an roten Blutzellen entfernt.
2. Absaugen und Verwerfen des Überstandes mit einer sterilen Transferpipette vorsichtig auf ca. 1 ml der Buffy-Coat unmittelbar über dem Gel / Fluid-Grenzfläche zu verlassen. Hinweis: Die Aerobic-Flaschen zeigen eine klare Trennung von roten Blutkörperchen an den Boden des Röhrchens mit dem Gel / Fluid-Grenzfläche erscheinen, eine undurchsichtige weiße Farbe. Wenn im Gegensatzangewendet, um den lytischen anaerobe Blutkulturbrühe das Gel / Fluid-Grenzfläche wird als tiefrote Farbe durch die lysierten roten Blutzellbestandteile im Überstand bleibt suspendiert.

5. Wiederholen Zentrifugation Waschschritte

1. Vorsichtig mischen die letzten 1 ml Buffy-Coat-Flüssigkeit über der Gel-Schnittstelle mit einer sterilen Pipette und übertragen das gesamte Volumen in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen dann. Zentrifugieren Sie die neue Röhre bei 288 g für 30 Sekunden.
2. Den Überstand mit einem Kunststoff-Einweg-1 ml Transferpipette in ein neues 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen und entsorgen Sie die Röhrchen mit dem Pellet. Hinweis: Es ist wichtig, in diesem Schritt, wird darauf geachtet, die Übertragung des Pellets zu vermeiden. Dies ist besonders wichtig für eine Probe aus der anaeroben BC Flasche verarbeitet, wie der Überstand bleibt und die pigmentierte Pellets ist nicht immer klar ersichtlich.

6. Lyse der Rest Cells

1. Zentrifugieren Sie die Proben bei 18.407 g für 1 min und dann gründlich absaugen (und verwerfen) der Überstand mit einem spitzen, dünnen Transferpipette, um so wenig wie möglich Restflüssigkeit, ohne dass der Pellet verlassen.
2. Resuspendieren des Rest Pellet in 1 ml steriler DNAse und RNAse freies Wasser durch Pipettieren auf und ab. Hinweis: Einige Autoren haben die Verwendung von Alkohol-Lösungen anstelle von sterilem Wasser, um das Pellet die Bakterien nicht lebensfähig macht resuspendieren beschrieben.
3. Zentrifugieren Sie die resuspendierten Lösung bei 18.407 g für 1 min.

7. Extraktion bakterieller Proteine

1. Absaugen und den Überstand verwerfen, wieder mit Aspiration mit einer feinen Spitze Pipette sicherzustellen, dass so viel Flüssigkeit wie möglich entfernt wird.
2. Das Pellet in 10 &mgr; l Ameisensäure (70% v / v). Hinweis: Ameisensäure kann den Körper beeinflussen, wenn es eingeatmet wird oder wenn es in Kontakt mit der Haut kommt. Bei der Erstellung oder Manipulation von Lösungen ist es rMPFOHLENE, dass die Mitarbeiter mit einem Abzugsschrank neben persönlicher Schutzausrüstung.
3. Gut mischen mit der Pipette, um eine homogene Lösung resuspendiert gewährleisten. Verwendung der Pipettenspitze physisch stören das Pellet kann notwendig sein, um eine homogene Lösung zu gewährleisten.

8. Herstellung der MALDI-TOF-Zielplatte

1. Impfen eine saubere MALDI-TOF-Zielplatte mit 2 ul der hergestellten Suspension pro Zielpunkt. Bereiten Sie 3 Zielstellen für jede Probe, um die gelegentliche Problem der gescheiterten liest überwinden.
2. Damit der MALDI-TOF-Zielplatte zu trocknen. Die Trocknungsgeschwindigkeit kann, indem man die Platte am Rand der Abzugshaube um den Luftstrom über die Platte zu maximieren erhöht werden.
3. Überlagern getrocknet Spot mit 1 ul der Matrixlösung (10 mg / ml α-Cyano-4-Hydroxy-Säure (HCCA), 50% Acetonitril, 2,5% Trifluoressigsäure). Hinweis: Matrix-Lösung kann den Körper beeinflussen, wenn es eingeatmet wird oder wenn es in conta kommtct mit der Haut. Bei der Erstellung oder Manipulation Lösungen empfiehlt es sich, dass die Mitarbeiter mit einem Abzugsschrank neben persönlicher Schutzausrüstung.
4. Damit der MALDI-TOF-Zielplatte auf dem Rand des Abzugs wie oben beschrieben zu trocknen. Gewährleisten eine homogene Zubereitung füllt jede der Zielstellen auf der Platte.

9. Platz MALDI-TOF-Zieltafel in das Massenspektrometer

1. Legen Sie die MALDI-TOF-Zielplatte in die MALDI-TOF-Massenspektrometer. Stellen Sie sicher, die Platte sitzt bündig mit den federbelasteten Platten. Hinweis: nicht die Zielplatte nicht ein, bis alle Ziel Flecken trocken sind.
2. Sicherstellen, dass die Gummidichtung ist sauber von Fusseln, Staub und Haare, damit die erforderlichen Vakuumbedingungen geschaffen werden.
3. Schließen Sie die MALDI-TOF-Bühne Deckel und drücken Sie die "In / Out"-Taste auf der Vorderseite des Gerätes. Der Deckel wird nun sperren und damit das erforderliche Vakuum geschaffen werden.

10. MALDI-TOF-MS-SPectra Acquisition

1. Öffnen Sie die MALDI Biotypisierung und Flexcontrol-Software.
2. Innerhalb der Typing Software wählen Sie "neue Klassifizierung" aus dem Dropdown-Menü "Datei" betitelt. Nennen Sie das Projekt und wählen Sie dann "neu". Wählen Sie "Weiter", um das Setup im Typing Software abzuschließen.
3. Innerhalb der Software-Systemsteuerung identifizieren die Grafik der Zielscheibe auf dem Bildschirm. Markieren Sie die MALDI-TOF-Ziel-Spots, die in Gebrauch sind, indem Sie die Maus über die Punkte eingeimpft, während Sie die linke Maustaste gedrückt halten.
4. Mit der rechten Maustaste auf eine beliebige Stelle auf der ausgewählten Zielpositionen Maustaste und wählen Sie dann "addieren Analyte" aus dem Dropdown-Menü.
5. In Blutkultur Identifikationsdaten in die Spalte "ID" für jede der Ziel Flecken und klicken Sie auf "weiter", wenn Sie fertig.
6. Wählen Sie den Werbespot "Taxonomie" Spektrendatenbank, und wählen Sie "Weiter". Hinweis: Labotorien verwenden kann zusätzliche in-house oder kommerziellen Datenbanken, um die Anzahl von Referenzspektren zu erhöhen.
7. Klicken Sie auf "Finish" und der MALDI-TOF-MS-Spektren erzeugen beginnen wird. Hinweis: MALDI-TOF-Einstellungen waren nach Herstellereinstellungen (linear positiven Modus, 60 Hz Laserfrequenz, 20 kV Beschleunigungsspannung, 16,7 kV IS2 Spannung, 170 ns Verzögerung Extraktion und 2,000-20,137 m / z-Bereich).
8. Wenn die MALDI-Control-Software nicht auf Gipfeln zu erzeugen, kann die manuelle Erfassung von Spektren durchgeführt werden (Methode nicht beschrieben).

11. Beitrag Analyse Interpretation der MALDI-TOF-MS-Ticker

1. Sobald die Spektren erfasst und Analyse abgeschlossen ist, wählen Sie die "+"-Button neben Artbestimmung auf der Typing Software, um die Identifikationsliste für jede Ziel erweitern.
2. Studieren Sie die Top-5-Identifikationen und stellt fest, ob die Top-5 sind ähnlich. Discordant Top 5 Gattungen mit Noten ≥ 1.7 der gleichen ZielOrt erhöht die Möglichkeit der Mischbrühen. Hinweis: MALDI-TOF-Technologie hat schlechte Empfindlichkeit für den Nachweis von Mischbrühen. Wenn beispielsweise eine Brühe enthält gemischte Spezies eine hohe Vertrauensbewertung kann nur eine der gemischten Spezies identifiziert werden.
3. Wenn ein Score ≥ 2.0 ist für das höchste Spiel auf einem Zielpunkt festgestellt, berichten die Arten.
4. Wenn die höchste Punktzahl auf einem Zielpunkt ist ≥ 1,7, aber <2,0, berichten nur die Gattungen. Wenn zusätzliche Kriterien der Top-5-Identifikationen sind übereinstimmende, dann auf Artenebene zu melden.

12. Entfernung von MALDI-TOF-Zielplatte

1. Wenn alle Spektren sind komplette drücken Sie die "In / Out" auf der MALDI-TOF-Maschine.
2. Öffnen Sie die MALDI-TOF-Zielplatte Behälter und entfernen Sie die MALDI-TOF-Zielplatte.
3. Wenn Sie eine wiederverwendbare MALDI-TOF-Zieltafel, sauber, alle Ziel Flecken mit Alkohol und speichern die MALDI-TOF-Platte bei RT, wenn es sauber und trocken ist.

Ergebnisse

Die erzeugte MALDI-TOF MS-Spektren sind mit der integrierten Referenzspektren der Datenbank verglichen. Eine logarithmische Score ist für das Vertrauen der Partie zwischen dem Test-Isolat und der Referenzdatenbank isoliert, mit der Empfehlung von einem Score ≥ 1,7 für wahrscheinlich, Identifikation zu Gattungen Ebene (Abbildung 1) und ≥ 2,0 für wahrscheinliche Identifizierung von Arten (Abbildung erforderlich zugeordnet 2). Bericht zur Art, wenn die Punktzahl ≥...

Diskussion

Es ist wichtig, bei der Anwendung von MALDI-TOF-MS, um den Blutkulturbrühe, die die Post Zentrifugationsschritte werden mit ausreichender Sorgfalt durchgeführt, nicht die getrennten Komponenten remixen. Es ist besonders wichtig, die Blutkulturbestandteilen und humanen zellulären Proteine, einschließlich Hämoglobin, das Spikes Störung der MALDI-TOF-Spektren erzeugen können, zu entfernen.

Obwohl MS Hersteller empfehlen der Partitur von ≥ 2,0 für Arten geschnitten und ≥ 1,7 für Gat...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
BACTEC Plus Aerobic/F Medium	Becton Dickinson; BD, Franklin Lakes, NJ, USA	442192
BACTEC Lytic/10 Anaerobic /F Medium	Becton Dickinson; BD, Franklin Lakes, NJ, USA	442265
BACTEC Peds Plus Medium	Becton Dickinson; BD, Franklin Lakes, NJ, USA	442194
Vacutainer - Blood transfer device	Becton Dickinson; BD, Franklin Lakes, NJ, USA	364880	Single use sampling device reducing the risk of needlestick injury
Vacutainer SST 5.0mL, Advance plus	Becton Dickinson; BD, Franklin Lakes, NJ, USA	367954	Serum separating tube
Syringe 10 mL	Becton Dickinson; BD, Franklin Lakes, NJ, USA	302143
Transfer pipette	Samco, USA	222-20S
Transfer pipette (fine tipped)	Samco, USA	232-20S
Microcentrifuge tube (2.0 mL)	Eppendorf, Hamburg, Germany	0030.120.094
Sterile water (DNAse and RNAse free)	Life Technologies, Carlsbad, California, USA	10977-015
Formic acid	Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA	F0507
Matrix solution	Bruker Daltonics, Bremen Germany	285074	10 mg/ml α-cyano-4-hydroxycinnamic acid, 50% acetonitrile, 2.5% trifluoroacetic acid
Benchtop microflex LT MALDI-TOF MS	Bruker Daltonics, Bremen Germany		Utilizing BioTyper 3.1 (Build 65) and FlexControl 3.3 (Build 99) software