MALDI-TOF質量分析法を使用した血液培養ブロスからのグラム陰性菌の迅速な同定

要約

直接血培養液への航空券のマトリックス支援レーザー脱離/イオン化時間（MALDI-TOF）質量分析（MS）の適用は、細菌の同定を促進。提示した方法は、血液培養ブロスから直接、グラム陰性細菌の同定のための迅速かつ信頼できる方法である。

要約

臨床微生物学研究室の重要な役割は、血流感染を引き起こす細菌の迅速な同定を提供することです。伝統的な識別は、固体寒天上のコロニーが成熟した後でのみ利用可能な識別を合図血液培養液の継代培養を必要とします。 MALDI-TOF MSは、固体培地上のコロニーに適用される臨床的に関連する大部分の細菌の同定のための信頼性のある、迅速な方法である。それは、細菌の種の同定を促進し、臨床管理を改善する可能性を有するとして直接血液培養ブロスへのMALDI-TOF MSの適用は魅力的なアプローチである。しかし、克服すべき重要な問題は、除去されない場合、MSスペクトルに干渉し、不十分なまたは低判別識別スコアをもたらすことができる血液培養検体中に含まれる樹脂の妨害、タンパク質、およびヘモグロビンの分析前の除去である。それに加えてバクターを濃縮する必要があるIA十分な品質のスペクトルを開発する。提示された方法は、濃縮、精製、及び合図血液培養液からの細菌の早期発見を可能にし、グラム陰性菌の抽出について説明します。

概要

原因細菌に血流感染（BSI）の患者は^{、6〜48％1}に至るまで、高い院内死亡率を持ち続ける。適切な経験的抗生物質の送達は、生存を促進し、重症敗血症の患者のサブセットでは、適切な治療への各時間の遅延が生存^2,3の低下と相関する。従って、臨床検査室の主な目的は、迅速に検出、同定および臨床決定を通知するために、血液培養物中の細菌の存在を伝えることである。これは、微生物学研究室は、グラム染色^4を報告し、最近時の抗菌療法に最も大きな影響を与える、観察研究は、飛行時間型質量分析法（MALDI-TOF MS）のマトリックス支援レーザー脱離/イオン化時間を実証したことが実証されている血液培養ブロス上で直接実行グラム陰性菌⁵に起因するBSIの三分の一以上で処方に影響する。

MALDI-TOF MSの商業的開発は、微生物^6,7の同定のための有効な実験室ツールにつながっている。技術は、現在十分に確立されており、固体培地の^6,8で単離した微生物の迅速かつ正確な同定のための多くの研究所に統合されました。血液培養のための低コストでの微生物の初期の識別を取得する可能性の両方の臨床医や研究室の管理者への微生物のアピールのために「陽性」合図している（BC）ブロスにMALDI-TOF MSの直接適用。

血液培養ブロスへのMALDI-TOF MSの直接適用の臨床的有用​​性は、47から98.9の範囲のグラム陰性細菌の同定の成功の報告と、識別の標準的な表現型の培養ベースの方法と比較した場合に観察される感度の広い範囲によって制限されてきた^％9月11日 。感度の変動性が高いBCブロス組成物、初期細菌濃度、サンプル調製法の変動ならびに試験集団⁹において遭遇するグラム陰性生物体のアレイに関する。これらの他の公開されたプロトコルと比較して、ここで提示した方法は、エタノール、塩化アンモニウムまたは追加の（非マトリックス）アセトニトリルの使用を回避する。その結果、細菌ペレットは、潜在的な表現型感受性試験法は培養液中で、これらの生物に直接適用することを可能にする（タンパク質抽出の時点まで）の実行可能なままになります。また、提示された方法は、時間¹²最小限の'実践'で、血液培養グラム染色結果の25分以内に利用可能な細菌同定と、安価で信頼性が高く、迅速であることが示されている。

この方法では、ギ酸抽出を利用した単純な社内スピン溶解プロトコルは、グラム負のbを同定するために陽性の血液培養液に直接適用さMALDI-TOF MS技術とacteria。

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プロトコル

「陽性」として1。血液培養ブロス旗

1. 継続的な監視のインキュベーションキャビネットから合図血液培養ボトルを取り外し、生物学的安全キャビネットに入れてください。注：ボトルは、危険な微生物を含むことができ、ユニバーサル予防措置に従わなければする必要があります。サンプリングによるエアロゾル中の感染リスクに、すべてのサンプリング手順は、バイオセーフティクラスII層流キャビネット内で実行する必要があります。

2。グラム染色を用意する

1. 地元の制度的なプロトコルに従って合図血液培養液からグラム染色を準備します。注：グラム陰性生物は、顕微鏡で同定されている場合、血液培養液を以下の方法に従って処理される。グラム陽性菌が特定される場合には、遺伝的同定と耐性マーカーを対象とした代替分子法は（この記事で扱われていない）培養液¹³に適用されます。

血清分離管にフラグ付きの血液培養ブロスのE "> 3。転送

1. ゆっくりと2〜3倍を反転させることにより血液培養ボトルを混ぜる。
2. バイオセーフティキャビネット内での安全性の血液搬送装置に10ミリリットルの注射器を取り付けます。
3. 血液培養ボトルに血液転送装置を取り付け、注射器にスープの5ミリリットルを撤回。血清分離チューブに吸引BCブロスを転送します。

血液培養ブロスの4。濃度

1. 赤血球の大容積を除去する15分間1,250×gで血清分離管を遠心分離する。
2. 吸引し、直ちにゲル/流体界面の上に軟膜の約1ミリリットルを残すように注意して、無菌トランスファーピペットを用いて上清を捨てる。注：好気性ボトルはゲル/流体界面が、不透明な白色に現れると、チューブの底部に赤血球の明確な分離を示す。対照的に、時ゲル/流体界面に起因上清中に懸濁したままで溶解した赤血球成分に深赤色で表示され、溶解性嫌気性血液培養ブロスに適用した。

5。遠心洗い手順を繰り返します

1. 優しく滅菌ピペットでゲル界面上軟膜流体の最後の1ミリリットルを混合し、次いで1.5mlのマイクロチューブにボリューム全体を転送します。 30秒288×gで新しいチューブを遠心分離する。
2. 新しい1.5 mlマイクロチューブにプラスチックの使い捨て1ミリリットルのホールピペットを用いて上清を移し、ペレットとチューブは捨てる。注意：これは注意がペレットの転送を避けるために注意され、この段階で重要である。これは上清色素沈着残り、ペレットを常に明確に示されていないように嫌気紀元前ボトルから処理されている標本のために特に重要です。

6。残留細胞の溶解を

1. 1分間遠心した後、吸引（および廃棄）のための18407×gで試料ペレットを中断することなく、可能な限り少ない残液を残して細かいな先端のホールピペットを用いて上清。
2. 上下にピペッティングにより無菌DNaseおよびRNA分解酵素を含まない水1ミリリットル中の残留ペレットを再懸濁。注：一部の著者は、非生存細菌をレンダリングペレットを再懸濁するために滅菌水の代わりにアルコール溶液の使用が記載されている。
3. 1分間18407×gで再懸濁ソリューションを遠心分離する。

細菌タンパク質の7。抽出

1. 吸引し、再び、できるだけ多くの液体が除去されることを確実に先の細いピペットで吸引を使用して、上清を捨てる。
2. 10μlのギ酸（70％v / v）の中にペレットを再懸濁。注：それが吸入される場合は、それが皮膚と接触するとギ酸が身体に影響を与えることができる。溶液を調製するか、操作するとき、それはrとスタッフは個人用保護具の他に、ヒュームのキャビネットを使用することをecommended。
3. 均質な再懸濁ソリューションを確実にするためにピペットを用いてよく混ぜる。物理的にペレットを破壊するためにピペットチップを使用すると、より均質な溶液を確保するために必要であり得る。

MALDI-TOFターゲットプレート8の調製

1. ターゲットスポットあたり調製した懸濁液の2μlでクリーンなMALDI-TOFターゲットプレートに接種。読み込み失敗の時々の問題を克服するために、各サンプルの3標的部位を準備します。
2. MALDI-TOFターゲットプレートを乾燥させる。乾燥速度は、プレートを横切る空気の流れを最大にするために、ヒュームフードの端に板を配置することによって増加させることができる。
3. マトリックス溶液（10 mg / mlのα-シアノ-4 - ヒドロキシ桂皮酸（HCCA）、50％アセトニトリル、2.5％トリフルオロ酢酸）1μlを各々乾燥させたスポットを重ねる。注：それが吸入されている場合、またはそれがコンタに入ってくる場合は、マトリックス溶液が体に影響を与えることができる皮膚とCT。溶液を調製するか、操作するときには、スタッフが個人用保護具の他に、ヒュームのキャビネットを使用することをお勧めします。
4. 前述したように、MALDI-TOFターゲットプレートはヒュームフードの端に乾燥させます。均質な製剤は、プレート上の標的スポットのそれぞれを満たすことを確認してください。

質量分析計に9か所、MALDI-TOFターゲットプレート

1. MALDI-TOF質量分析計へのMALDI-TOFターゲットプレートを挿入する。プレートはスプリング式のプレートと同一面に座っていることを確認します。注意：ターゲットのすべてのスポットが乾燥するまで、ターゲットプレートを挿入しないでください。
2. ゴム製のシールが必要な真空状態を作成することができますができるように糸くず、ほこりや髪の毛の汚れていないことを確認してください。
3. MALDI-TOFステージふたを閉めてから、機器の前面にある「IN / OUT」ボタンを押してください。蓋は現在ロックして、必要な真空が作成できるようになります。

10。MALDI-TOF MS Spectra買収

1. MALDI BiotypingとFlexControlソフトウェアを起動します。
2. タイピングソフトウェア内の「ファイル」というタイトルのドロップダウンメニューから「新しい分類」を選択します。プロジェクトに名前を付けてから、「新規作成」を選択します。タイピングソフトウェア内のセットアップを完了するために、「次へ」を選択します。
3. 制御ソフトウェアのウィンドウ内でターゲットプレートの画面上のグラフィックを識別します。マウスの左ボタンを押しながら接種したスポットの上にマウスを移動して使用されているMALDI-TOFターゲットスポットを強調表示します。
4. 選択された目標位置の任意の場所をクリックし、ドロップダウンメニューから「検体を追加」を選択し、マウスの右ボタンを使用してください。
5. 対象スポットのそれぞれについて、「ID」欄に血液培養識別の詳細を追加、完了したら「次へ」をクリックします。
6. 商業「分類」スペクトルのデータベースを選択し、「次へ」を選択します。注意：ラボratoriesは、基準スペクトルの数を増加させるため、社内の追加または商用データベースを利用することができる。
7. 「完了」をクリックし、MALDI-TOF MSは、スペクトルを生成開始します。注：MALDI-TOFの設定は、製造者の設定（リニアポジティブモード、60Hzのレーザー周波数、20kVの加速電圧、16.7 kVのをIS2電圧は、170ナノ秒の抽出遅延、および2,000-20,137 m / z範囲）あたりの通りであった。
8. MALDI制御ソフトウェアはピークを生成するために失敗した場合は、スペクトルの手動取得する（メソッドが記述されていない）を行ってもよい。

MALDI-TOF MSスコアの11。ポスト解析の解釈

1. スペクトルを取得し、分析が完了したら、各ターゲットの識別リストを展開しタイピングソフトウェア、種の識別の横の「+」ボタンを選択します。
2. トップ5が類似している場合には注意して、トップ5の同定を研究。スコア同じターゲットの≥1.7と不調和トップ5属スポットは、混合ブロスの可能性を提起した。注：MALDI-TOF技術は、混合ブロスの検出のための貧弱な感度を有する。たとえば、培養液が混合種を含む場合に、高い信頼度スコアは、混合種のほんの一例について同定され得る。
3. スコア≥2.0がターゲット場で最高の試合のために注意されると、種を報告している。
4. ときにターゲットスポットが≥1.7での最高スコアが<2.0のみ属を報告します。トップ5識別の追加基準が一致している場合には、種レベルに報告する。

12。MALDI-TOFターゲットプレートの削除を

1. すべてのスペクトルは、MALDI-TOFマシンの「IN / OUT」ボタンを押して完了している場合。
2. MALDI-TOFターゲットプレートレセプタクルを開いて、MALDI-TOFターゲットプレートを取り外します。
3. アルコールを使用して、クリーンなすべてのターゲットスポットを再利用可能な、MALDI-TOFターゲットプレートを使用している場合、それを清潔で乾いたら、RTで、MALDI-TOFプレートを格納します。

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結果

生成されたMALDI-TOF MSスペクトルは、スペクトルの集積参照データベースと比較される。対数スコアは、試験分離株の間の一致の信頼のために割り当てられ、参照データベースは分離し、種への可能性を識別するための属レベル（ 図1）と≥2.0に足りる相当の識別（ 図に必要なスコア≥1.7の勧告にされている2）。スコア≥1.7と入力ソフトウェアで一致した...

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ディスカッション

ポストの遠心操作は分離された成分をリミックスしない十分な注意を払って行われた血液培養液にMALDI-TOF MSを適用するときには重要です。これは、MALDI-TOFスペクトルに干渉スパイクを生成することができる、ヘモグロビンを含む血液培養成分およびヒト細胞タンパク質を除去することが特に重要である。

MSは種のための≥2.0のスコアのカットや属同定のための≥1.7を推?...

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資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
BACTEC Plus Aerobic/F Medium	Becton Dickinson; BD, Franklin Lakes, NJ, USA	442192
BACTEC Lytic/10 Anaerobic/F Medium	Becton Dickinson; BD, Franklin Lakes, NJ, USA	442265
BACTEC Peds Plus Medium	Becton Dickinson; BD, Franklin Lakes, NJ, USA	442194
Vacutainer - Blood transfer device	Becton Dickinson; BD, Franklin Lakes, NJ, USA	364880	Single use sampling device reducing the risk of needlestick injury
Vacutainer SST 5.0 ml, Advance plus	Becton Dickinson; BD, Franklin Lakes, NJ, USA	367954	Serum separating tube
Syringe 10 ml	Becton Dickinson; BD, Franklin Lakes, NJ, USA	302143
Transfer pipette	Samco, USA	222-20S
Transfer pipette (fine tipped)	Samco, USA	232-20S
Microcentrifuge tube (2.0 ml)	Eppendorf, Hamburg, Germany	0030.120.094
Sterile water (DNAse and RNAse free)	Life Technologies, Carlsbad, California, USA	10977-015
Formic acid	Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA	F0507
Matrix solution	Bruker Daltonics, Bremen Germany	285074	10 mg/ml α-cyano-4-hydroxycinnamic acid, 50% acetonitrile, 2.5% trifluoroacetic acid
Benchtop microflex LT MALDI-TOF MS	Bruker Daltonics, Bremen Germany		Utilizing BioTyper 3.1 (Build 65) and FlexControl 3.3 (Build 99) software