Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Uçuşu (MALDI-TOF) kütle spektrometresi (MS), doğrudan kan kültür çorbasına matris destekli lazer desorpsiyon / iyonizasyon zaman uygulanması bakteri tanımlanmasını hızlandırır. Sunulan yöntemi doğrudan kan kültür besi yerinden, Gram negatif bakterilerin tanımlanması için hızlı ve güvenilir bir yöntemdir.

Özet

Klinik mikrobiyoloji laboratuvarında önemli bir rol kan dolaşımı enfeksiyonu neden bakterilerin hızlı bir şekilde tanınmasını sağlamaktır. Geleneksel kimlik sadece olgunlaşmış katı agar kolonileri sonra geçerli bir kimlik belgesi ile sinyalize kan kültür sıvısının alt-kültürü gerektiriyor. MALDI-TOF MS katı ortam üzerinde koloniler uygulanan klinik olarak ilgili bakterilerin çoğunluğunun belirlenmesi için güvenilir ve hızlı bir yöntemdir. Bu bakteri türlerinin belirlenmesi hızlandırmak ve klinik yönetimini geliştirmek için bir potansiyele sahip olarak doğrudan kan kültür çorbasına MALDI-TOF MS uygulaması çekici bir yaklaşımdır. Bununla birlikte, üstesinden gelmek için önemli bir sorun kaldırılmaz ise, MS spektrumları müdahale ve yetersiz ya da düşük ayrımcılık kimlik puan neden olabilir, kan kültürü örneklerinde içerdiği müdahale reçineler, protein ve hemoglobin ön analiz çıkarılmasıdır. Buna ek olarak Bacter konsantre gereklidiria yeterli kalitede spektrumları geliştirmektir. Sunulan yöntem olup, konsantrasyon, arıtma ve bir işaret kan kültürü sıvısından bakterilerin erken tespiti için izin Gram negatif bakterilerin çıkarılması açıklanmaktadır.

Giriş

Nedeniyle bakterilere kan dolaşımı enfeksiyonu (BSI) olan hastalar 6-48% 1 arasında değişen, yüksek hastane içi mortalite devam etmektedir. Uygun ampirik antibiyotik teslim hayatta teşvik ve ağır sepsis hastalarının alt kümesi, uygun tedaviye her saat gecikme sağkalım 2,3 azalmış ilişkilidir. Buna göre, klinik laboratuvar önemli bir hedefi hızla saptamak, tanımlamak ve klinik kararlarını bildirmek için kan kültürlerinde bakteri varlığını iletişim kurmaktır. Bu mikrobiyoloji laboratuvar son zamanlarda Gram leke 4 raporlanması ve zamanında antimikrobiyal tedavinin üzerinde en büyük etkiye sahip olduğu kanıtlanmıştır, gözlemsel bir çalışma göstermiştir ki, uçuş kütle spektrometresi matris destekli lazer desorpsiyon / iyonizasyon süresi (MALDI-TOF MS) kan kültür sıvılarında doğrudan uygulanan Gram negatif bakterilerin 5 neden BSI üçte biri reçeteleme etkileyebilir.

MALDI-TOF MS ticari gelişimi 6,7 mikroorganizmaların tespit edilmesi için etkili bir laboratuar aracı yol açmıştır. Teknoloji artık iyi kurulmuş ve katı ortamlar 6,8 izole mikroorganizmaların hızlı ve doğru tanımlanması için pek çok laboratuvarda entegre edilmiştir. Kan kültürü çünkü düşük maliyetle mikroorganizmaların önceki bir kimlik elde etmek için potansiyeli hem klinisyen ve laboratuvar yöneticileri için mikroorganizmalar temyiz için "olumlu" sinyalini (BC) suyu MALDI-TOF MS doğrudan uygulama.

Gram negatif bakteriler arasında değişen başarıyla tespit raporları ile kimlik standart fenotipik kültürü bazlı yöntemler ile karşılaştırıldığında kan kültürü suyu için MALDI-TOF MS doğrudan uygulama klinik yarar görülmüştür hassasiyetleri geniş ile sınırlı olmuştur 47-98,9 % 9-11. Duyarlığındaki farklılaşmaya muhtemelBC suyu bileşim, başlangıç ​​bakteri konsantrasyonu, numune hazırlama yöntemi değişkenlik hem de çalışma popülasyonları 9 karşılaşılan Gram negatif organizmaların dizisine ilişkindir. Bu yayınlanmış protokoller ile karşılaştırıldığında Burada yer alan yöntem, etanol, amonyum klorür ya da ek (non-matrix) asetonitril kullanımını önler. Bunun bir sonucu olarak, bakteri peleti potansiyel fenotipik duyarlılık testi yöntemleri suyu içinde, bu organizmalar için direkt olarak uygulanabilir için izin (protein ekstraksiyon noktaya kadar) uygun bir kalır. Buna ek olarak, sunulan yöntem, pahalı olmayan, güvenilir ve süre 12 'eller' minimal ile kan kültürü Gram leke sonuç 25 dakika içinde mevcut bakteriyel tanımlama ile hızlı olduğu gösterilmiştir.

Bu yöntem, Gram negatif b tanımlamak için pozitif kan kültür sıvılarında doğrudan uygulanan formik asit çıkarma kullanan basit bir in-house spin-parçalama protokoldürMALDI-TOF MS teknolojisi ile Ancak bakteriler.

Protokol

"Pozitif" olarak 1. Kan Kültürü et suları Bayrağı

  1. Sürekli izleme kuluçka kabine işaret kan kültürü şişesini çıkarın ve biyolojik güvenlik kabini içine yerleştirin. Not: Şişeler tehlikeli mikroorganizmaları ihtiva edebilir ve evrensel önlemleri takip edilmesi gerekir. Nedeniyle örnekleme bulaşıcı aerosollerin riskinden dolayı, tüm numune alma işlemleri, bir Biyogüvenliği Sınıf II düzgün akış kabininde gerçekleştirilmelidir.

2.. Gram Leke Hazırlanan olduğunu

  1. Yerel kurumsal protokollere uygun olarak bildirilir kan kültürü sıvısından bir Gram boya hazırlayın. Not: Gram negatif organizmalar mikroskobu ile tespit edildiğinde kan kültür brotu aşağıdaki yöntemi ile işlenir. Gram pozitif organizmalar tespit edilirse, gen belirlenmesini ve direnç işaretçileri hedef alternatif bir moleküler metodu (bu makalede açıklanan) suyu 13 uygulanır.
Bir Serum Ayırma Tüp Bayraklı Kan Kültürü Broth'u e "> 3. Transferi

  1. Yavaşça 2-3x ters çevrilerek kan kültürü şişesi karıştırın.
  2. Biyogüvenlik kabini içinde bir emniyet kan transfer cihazı için 10 ml şırınga takın.
  3. Kan kültürü şişesine kan transfer cihazını takın ve enjektörün içine et suyu 5 ml çekilme. Bir serum ayırma tüpüne aspire BC suyu aktarın.

Kan Kültürü Broth 4. Konsantrasyon

  1. Kırmızı kan hücrelerinin büyük bir ses çıkarır, 15 dakika boyunca 1250 x g'de santrifüj tüpü serum ayırma.
  2. Aspire ve hemen jel / sıvı arayüzü üzerindeki ince beyaz tabakada yaklaşık 1 ml bırakmak için dikkatli olmak, steril bir transfer pipet kullanarak süpernatant atın. Not: aerobik şişe jel / sıvı arayüzü opak beyaz renkli görünen ile tüpün dibine kırmızı kan hücreleri net bir ayrım göstermektedir. Buna karşılık, zamanJel / sıvı arayüzü olan lize alyuvar hücresi bileşenleri süpernatan içinde süspansiyon haline getirilmiş, kalan bir koyu kırmızı bir renk olarak görünür litik anaerobik kan kültürü suyu uygulanır.

5.. Santrifugasyon Yıkama Adımları Tekrarla

  1. Yavaşça steril bir pipet ile jel arayüzü üzerinde beyaz tabaka sıvının son 1 ml karıştırın ve daha sonra 1.5 ml mikrosantrifüj tüp içine tüm hacim transferi. 30 saniye boyunca 288 x g 'de yeni tüp santrifüjleyin.
  2. Yeni bir 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü içine plastik bir tek 1 ml transfer pipeti kullanarak süpernatant aktarın ve pelet ile tüp atın. Not: Bu, bakım pelet transferini engellemek için alınır, bu aşamada çok önemlidir. Bu yüzer madde pigmentli kalır ve topak her zaman açık bir şekilde görülmez gibi anaerobik BC şişeden işlenen bir numune için özellikle önemlidir.

Kalıntı Hücreler 6. Lysis

  1. Santrifüj 1 dakika sonra aspiratı (ve artıklar) için 18,407 xg'de örnek pelet bozmadan mümkün olduğunca az kalan sıvıyı terk ince uçlu bir transfer pipet kullanarak yüzer.
  2. Aşağı yukarı pipetleme ve steril DNase ve RNase içermeyen su 1 ml kalıntı pelletini. Not: Bazı yazarlar, canlı olmayan bakteri hale pelletini steril su yerine alkol çözeltilerin kullanımını tarif etmişlerdir.
  3. 1 dakika boyunca 18.407 x g'de yeniden süspansiyon haline çözeltisi santrifüjleyin.

Bakteriyel Proteinlerin 7. Ekstraksiyon

  1. Aspire ve yine mümkün olduğu kadar sıvı kaldırılır sağlamak ince bir ucu pipet ile aspirasyon kullanarak, süpernatant atın.
  2. 10 ul formik asit (% 70 v / v) içindeki pelet tekrar. Not: deri ile temas ederse o solunması veya eğer Karınca asidi vücudu etkileyebilir. Solüsyonları hazırlamak veya manipüle zaman rpersonel kişisel koruyucu donanımlar için ek bir duman kabine kullanmak ecommended.
  3. Bir homojen yeniden süspanse çözüm sağlamak için pipet kullanarak iyice karıştırın. Fiziksel olarak bozmak için pelet pipet kullanarak, daha homojen bir çözelti sağlamak için gerekli olabilir.

MALDI-TOF 8. Hazırlanması Hedef Plaka

  1. Hedef nokta başına hazırlanan süspansiyonun 2 ul temiz bir MALDI-TOF hedef plaka inoküle. Başarısız okur zaman sorunun üstesinden gelmek için her örnek için 3 hedef siteleri hazırlayın.
  2. MALDI-TOF hedef plakası kurumasını bekleyin. Kurutma hızı plaka üzerinde hava akımı üst düzeye çıkarmak için, davlumbaz kenarında plaka yerleştirilerek artırılabilir.
  3. Matris solüsyon içerisinde 1 ul (10 mg / ml α-siyano-4-hidroksisinamik asit (HCCA),% 50 asetonitril,% 2.5 trifloroasetik asit) ile, her bir nokta Bindirme kurutuldu. Not: Bu conta girdiği eğer solunması veya eğer Matrix çözümü vücudu etkileyebilirderi ile ct. Hazırlamak veya çözümler manipüle zaman personel, kişisel koruyucu donanımlar için ek bir duman kabine kullanmanız önerilir.
  4. MALDI-TOF hedef plakası yukarıda tarif edildiği gibi çeker ocak kenarında kurumaya bırakın. Homojen bir hazırlık plaka üzerinde hedef noktalardan her doldurur emin olun.

Kütle Spektrometre içine 9. Sıra MALDI-Hedef Plaka

  1. MALDI-TOF kütle spektrometresi içine MALDI-TOF hedef plakası yerleştirin. Plaka yaylı plakaları ile aynı hizada oturuyor olun. Not: Tüm hedef noktalar kuru kadar hedef plakası takmayın.
  2. Kauçuk conta gerekli vakum şartlar oluşturulabilir izin tiftik, toz ve saç temiz olduğundan emin olun.
  3. MALDI-TOF sahne kapağını kapatın ve daha sonra cihazın önündeki "/ out" düğmesine basın. Kapak şimdi kilitlemek ve gerekli vakum yaratılmış olmasını sağlayacaktır.

10. MALDI-TOF MS Spectra Acquisition

  1. MALDI Biyotiplendirme sonucunda ve FlexControl yazılımını açın.
  2. Yazma yazılım içinde "dosya" başlıklı açılır menüden "yeni sınıflandırma" seçeneğini seçin. Projeyi adlandırın ve sonra "yeni" seçeneğini seçin. Yazma yazılım içinde kurulumunu tamamlamak için "İleri" yi seçin.
  3. Kontrol yazılım penceresinde hedef plaka ekrandaki grafik tanımlamak. Farenin sol tuşuna basılı tutarak aşılanmış noktalar üzerinde fareyi hareket ettirerek kullanımda MALDI-TOF hedef noktalar vurgulayın.
  4. Seçilen hedef konum üzerinde herhangi bir yere tıklayın ve ardından açılır menüden "analitlerle eklemek" seçmek için sağ fare düğmesini kullanın.
  5. Hedef noktalar her biri için "Kimlik" sütununa kan kültürü, kimlik bilgileri ekleme ve "next" Tamamlandığında tıklayın.
  6. Ticari "taksonomi" spektrumları veritabanı seçin ve "next" seçeneğini seçin. Not: Labolaboratuarları referans spektrumları sayısını artırmak için içi veya ticari veritabanları ek kullanabilir.
  7. "Bitirmek" tıklayın ve MALDI-TOF MS spektrumları üreten başlayacaktır. Not: MALDI-TOF ayarları fabrika ayarları (lineer pozitif mod, 60 Hz lazer frekansı, 20 kV hızlandırma voltajı, 16.7 kV IS2 gerilimi, 170 NSEC çıkarma gecikmesi ve 2,000-20,137 m / z aralığı) başına idi.
  8. MALDI kontrol yazılımı tepe oluşturmak için başarısız olursa, spektrumları elle elde etme (yöntem tarif edilmemektedir) ile gerçekleştirilebilir.

MALDI-TOF MS Puanlarının 11. Mesaj Analizi Yorumlama

  1. Spektrumları edinilen ve analiz tamamlandıktan sonra, her hedef için kimlik listesini genişletmek için Yazma yazılım türleri kimlik yanındaki "+" düğmesini seçin.
  2. En iyi 5 benzer eğer belirterek, ilk 5 tanımlamaları çalışma. Skorları aynı hedefin ≥ 1.7 ile uyumsuz ilk 5 cinsSpot karışık Brotların olasılığını yükseltti. Not: MALDI-TOF teknoloji karışık Brotların saptanması için düşük bir duyarlılığa sahiptir. Bir karma suyu türler içerir, örneğin, yüksek bir güven puanı karışık türlerin sadece biri için tespit edilebilir.
  3. Bir puan ≥ 2.0, bir hedef noktada en yüksek maç için dikkat edildiğinde türler rapor.
  4. Hedef noktada en yüksek puanı 1.7 ≥, ancak <2.0, sadece cins rapor zaman. Ilk 5 teşhislerin ek kriterler uyumlu iseniz, o tür düzeyinde rapor.

MALDI-TOF Hedef Plate 12. Kaldırma

  1. Tüm spektrumları MALDI-TOF makinede "out / in" düğmesine tam basın zaman.
  2. MALDI-TOF hedef plakası yuvasını açın ve MALDI-TOF hedef plakasını çıkarın.
  3. Bir yeniden MALDI-TOF hedef plakası, alkol kullanılarak temiz tüm hedef noktalar kullanarak ve temiz ve kuru bir kez oda sıcaklığında MALDI-TOF plaka saklayın.

Sonuçlar

Oluşturulan MALDI-TOF MS spektrumları spektrumları entegre referans veri tabanı ile karşılaştırılmaktadır. Bir logaritmik puan olası cins düzeyine kimlik (Şekil 1) ve türlerinin olası tanımlanması için ≥ 2.0 (Şekil için gerekli bir skor ≥ 1.7 tavsiyesi ile test izolatı ve referans veritabanı izolatları arasındaki maçın güven için atanır 2). Yazma yazılımı ile eşleşen skoru ≥ 1.7 ve ilk 5 tanımları (Şekil 1)

Tartışmalar

Santrifüj sonrası adımlar ayrılmış eser bileşenler için değil, yeterli bakım ile gerçekleştirilen bir kan kültürü suyu için MALDI-TOF MS uygularken önemlidir. Bu, MALDI-TOF spektrumları ile müdahale sivri üretebilir hemoglobin da dahil olmak üzere kan kültürü bileşenleri ve insan hücresel proteinleri, kaldırmak için özellikle önemlidir.

MS türler için ≥ 2.0 puan kesti ve cins tanımlanması için ≥ 1.7 tavsiye üretmektedir rağmen, diğer raporlar M.Ö. ?...

Açıklamalar

Yazarlar, hiçbir rakip mali çıkarlarını olmadığını beyan ederim.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
BACTEC Plus Aerobic/F MediumBecton Dickinson; BD, Franklin Lakes, NJ, USA442192
BACTEC Lytic/10 Anaerobic /F MediumBecton Dickinson; BD, Franklin Lakes, NJ, USA442265
BACTEC Peds Plus MediumBecton Dickinson; BD, Franklin Lakes, NJ, USA442194
Vacutainer - Blood transfer deviceBecton Dickinson; BD, Franklin Lakes, NJ, USA364880Single use sampling device reducing the risk of needlestick injury
Vacutainer SST 5.0mL, Advance plusBecton Dickinson; BD, Franklin Lakes, NJ, USA367954Serum separating tube
Syringe 10 mLBecton Dickinson; BD, Franklin Lakes, NJ, USA302143
Transfer pipetteSamco, USA222-20S
Transfer pipette (fine tipped)Samco, USA232-20S
Microcentrifuge tube (2.0 mL)Eppendorf, Hamburg, Germany0030.120.094
Sterile water (DNAse and RNAse free)Life Technologies, Carlsbad, California, USA10977-015
Formic acidSigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USAF0507
Matrix solution Bruker Daltonics, Bremen Germany28507410 mg/ml α-cyano-4-hydroxycinnamic acid, 50% acetonitrile, 2.5% trifluoroacetic acid
Benchtop microflex LT MALDI-TOF MSBruker Daltonics, Bremen GermanyUtilizing BioTyper 3.1 (Build 65) and FlexControl 3.3 (Build 99) software

Referanslar

  1. Bearman, G. M., Wenzel, R. P. Bacteremias: a leading cause of death. Arch. Med. Res. 36 (6), 646-659 (2005).
  2. Leibovici, L., Shraga, I., Drucker, M., Konigsberger, H., Samra, Z., Pitlik, S. D. The benefit of appropriate empirical antibiotic treatment in patients with bloodstream infection. J. Intern. Med. 244 (5), 379-386 (1998).
  3. Kumar, A., et al. Duration of hypotension before initiation of effective antimicrobial therapy is the critical determinant of survival in human septic shock. Crit. Care Med. 34 (6), 1589-1596 (2006).
  4. Munson, E. L., Diekema, D. J., Beekmann, S. E., Chapin, K. C., Doern, G. V. Detection and treatment of bloodstream infection: laboratory reporting and antimicrobial management. J. Clin. Microbiol. 41 (1), 495-497 (2003).
  5. Clerc, O., Prod'hom, G., Vogne, C., Bizzini, A., Calandra, T., Greub, G. Impact of Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Time-of-Flight Mass Spectrometry on the Clinical Management of Patients With Gram-negative Bacteremia: A Prospective Observational Study. Clin. Infect. Dis. 56 (8), 1101-1107 (2013).
  6. Dekker, J. P., Branda, J. A. . MALDI-TOF Mass Spectrometry in the Clinical Microbiology Laboratory. Clinical Microbiology Newslette. 33 (12), 87-93 (2011).
  7. Seng, P., et al. Ongoing revolution in bacteriology: routine identification of bacteria by matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry. Clin. Infect. Dis. 49 (4), 543-551 (2009).
  8. Neville, S. A., et al. Utility of matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry following introduction for routine laboratory bacterial identification. J. Clin. Microbiol. 49 (8), 2980-2984 (2011).
  9. Schmidt, V., Jarosch, A., März, P., Sander, C., Vacata, V., Kalka-Moll, W. Rapid identification of bacteria in positive blood culture by matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 31 (3), 311-317 (2012).
  10. March-Rosselló, G. A., Muñoz-Moreno, M. F., de Urriés, M. C., Bratos-Pérez, M. A. A differential centrifugation protocol and validation criterion for enhancing mass spectrometry (MALDI-TOF) results in microbial identification using blood culture growth bottles. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 32 (5), 699-704 (2012).
  11. Christner, M., Rohde, H., Wolters, M., Sobottka, I., Wegscheider, K., Aepfelbacher, M. Rapid identification of bacteria from positive blood culture bottles by use of matrix-assisted laser desorption-ionization time of flight mass spectrometry fingerprinting. J. Clin. Microbiol. 48 (5), 1584-1591 (2010).
  12. Gray, T. J., Thomas, L., Olma, T., Iredell, J. R., Chen, S. C. Rapid identification of Gram-negative organisms from blood culture bottles using a modified extraction method and MALDI-TOF mass spectrometry. Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 72 (2), 110-112 (2013).
  13. Hazelton, B. J., Thomas, L. C., Unver, T., Iredell, J. R. Rapid identification of Gram-positive pathogens and their resistance genes from positive blood culture broth using a multiplex tandem RT-PCR assay. J. Med. Microbiol. 62 (2), 223-2231 (2013).
  14. Saffert, R. T., Cunningham, S. A., Mandrekar, J., Patel, R. Comparison of three preparatory methods for detection of bacteremia by MALDI-TOF mass spectrometry. Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 73 (1), 21-26 (2012).
  15. Consoir, C., Lörch, D., Schneider, C. Direct identification of bacteria from charcoal-containing blood culture bottles using matrix-assisted laser desorption/ionisation time-of-flight mass spectrometry. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 31 (10), 2843-2850 (2012).
  16. Martiny, D., Dediste, A., Vandenberg, O. Comparison of an in-house method and the commercial Sepsityper™ kit for bacterial identification directly from positive blood culture broths by matrix-assisted laser desorption-ionisation time-of-flight mass spectrometry. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 31 (9), 2269-2281 (2012).
  17. Moussaoui, W., et al. Matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry identifies 90% of bacteria directly from blood culture vials. Clin Microbiol Infect. 16 (11), 1631-1638 (2010).
  18. Novel, , et al. improved sample preparation for rapid, direct identification from positive blood cultures using matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight (MALDI-TOF) mass spectrometry. J. Mol. Diagn. 13 (6), 701-706 (2011).
  19. Fothergill, A., Kasinathan, V., Hyman, J., Walsh, J., Drake, T., Wang, Y. F. Rapid Identification of Bacteria and Yeasts from Positive-Blood-Culture Bottles by Using a Lysis-Filtration Method and Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization-Time of Flight Mass Spectrum Analysis with the SARAMIS Database. J. Clin. Microbiol. 51 (3), 805-809 (2013).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

mm nolojiSay 87Gram negatif basillerkan k lt rkan ak m enfeksiyonubakteriyemiMALDI TOF k tle spektrometresi

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır